大豆皂苷的提取純化和測定

大豆皂昔的提取純化和測定大豆皂昔的提取測定1、大豆簡介1(1大豆的組成成分:大豆主要成分為蛋白質(zhì)35%、脂肪169廣21%、碳水化合物23%"27%、水分和粗纖維15%左右、皂昔和異黃酮等糖昔占2%左右，其中，皂昔約占0.5%o1(2大豆皂昔的化學(xué)組成：大豆皂昔，乂稱大豆皂^(Soyasaponins)屬于三聒類齊墩果酸型皂昔，是三聒類同系物的羥基和糖分子環(huán)狀半縮醛疑基失水縮合而以水解生成多種糖類和配糖體，LI前已確認(rèn)的大豆皂昔約18種，是山

成，它可5種皂昔元(Soyasapogeno?>?、？、？、?)和糖基中的0-D-半乳糖、B-D-木糖、a-L-鼠李糖、ci-L-阿拉伯糖、B-D-葡萄糖醛酸等6種單糖以及乙酰基大豆皂昔(Acetyl-soyasaponin)所組成。大豆皂昔依照其昔元不同樣分為A類、B類、E類和DDMP類，A類皂昔是以soyasapogeno1A為配基的雙糖皂昔，B類和E類是以soyasapogenoIB和soyasa-pogenoIE為配基的單糖皂昔，DDMP皂昔是以soyas-apogenoB作配基在022位上結(jié)合有2,3-dihydro-2,5-dinydroxy-6-methy-14h-pyran-4-one的單糖鏈皂［4-5］。因?yàn)樗蠨DMP大豆皂昔對熱不牢固，受熱易分解生成A類和E類皂昔，因此，有些人認(rèn)為DDMP皂昔是大豆中存在的真切皂圖1大豆甘元結(jié)構(gòu)式山低聚糖及齊墩果烯三聒縮合形成的一類化合物，擁有抗癌、調(diào)治免疫功能、防治心血管疾病、抗菌、抗病毒、護(hù)肝等多重生理功能。除用作藥物外，皂昔還可以作為高級化妝品和食品增加劑，如作為殺菌劑、抗氧化劑、發(fā)泡劑等，在化妝品和食品工業(yè)中擁有廣泛的應(yīng)用。大豆加工制品種類眾多，一般分為傳統(tǒng)的大豆制品和新興大豆制品。傳統(tǒng)豆制品分Cdi34W.l?WOIS2大豆皂苔毗恤和時"的結(jié)構(gòu)就?分子靈及分子至為非發(fā)酵制品如豆腐、干豆腐、豆腐皮、豆腐干、豆芽和發(fā)酵的豆制品如腐乳、豆豉、豆醬、醬油、天培、納豆等;新興的豆制品有大豆油脂、大豆蛋白、大豆磷脂、大豆低聚糖、大豆異黃酮、大豆纖維、大豆皂昔等。豆制品的生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量的廢水，這些廢水含有大分子蛋白、小分子寡糖、有機(jī)酸、色素類物質(zhì)和鹽類等，極易腐敗，BOD（生物需氧量）、COD（化學(xué)需氧量）值嚴(yán)重超標(biāo)。別的還有很多有益的生理活性成分，如大豆異黃酮、皂昔、維生素、胰蛋白酶控制劑等。在很多生產(chǎn)過程中這些廢水經(jīng)常直接山下水道排放，既污染了環(huán)境，乂浪費(fèi)了資源。因此，從豆制品生產(chǎn)的廢水中提取功能性物質(zhì)，不論對于環(huán)境保護(hù)仍是對資源的充分利用都有著極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。豆腐的生產(chǎn)流程為：加蟲加水JIXV一誚選一枚泡“（F?槳一涼漿一過謔一計(jì)聚7同一用梓一成醴一包裝I賛業(yè)水圖1豆砸生產(chǎn)的流程Fig.1Flowoflofurr^Kiuction大豆殘?jiān)鼊t是用剛榨過豆?jié){的大豆?jié)穸乖?5?條件下干燥至恒重，過36LI篩,保存制作而成。從上述生產(chǎn)流程可以看出，豆腐生產(chǎn)的廢水主要來自于浸泡大豆的廢水（泡豆水）和壓迫豆腐產(chǎn)生的黃漿水，別的還有部分沖洗廢水。詳盡成分見表115H43tt0本實(shí)驗(yàn)欲從大豆的廢水、壓迫豆腐產(chǎn)生的黃漿水和大豆殘?jiān)袦y定大豆皂昔的含量，為從大豆生產(chǎn)廢水中提取大豆皂昔做準(zhǔn)備。LI前三命皂昔的提取方法主要有冷浸法、回流提取法、樹脂吸附法、凝膠吸附法、薄層層析法、超聲提取法、酶提取法、微波提取法等.經(jīng)過對大孔樹脂吸附法、有機(jī)溶劑提取法、微波提取法以及超聲波提取法等四種常有提取方法進(jìn)行比較,結(jié)果以下：1、四種方法中除大孔樹脂吸附法液料比為1:10外，其余三種均為1:20。2、四種大豆皂昔提取方法提取時所需溫度分別為：大孔樹脂吸附法70?、有機(jī)溶劑提取法80?、微波提取法和超聲波提取法均為60?o3、四種大豆皂昔提取方法提取時所需時間依次為：大孔樹脂吸附法最長，為6h;其次是有機(jī)溶劑提取法為3h;再次為超聲波提取法，需25min;微波提取法最短，僅為90s。4、四種大豆皂昔提取方法提取所得大豆皂昔吸光度依次為：微波提取法（0.310）〈超聲波提取法（0.317）〈大孔樹脂吸附法（0.479）〈有機(jī)溶劑提取法（0.489）o5、四種大豆皂昔提取方法中大豆皂昔提取率依次為：微波提取法（59.8%）<超聲波提取法（61.0%）〈大孔樹脂吸附法（90.2%）〈有機(jī)溶劑提取法（93.4%）o附:皂昔產(chǎn)率和提取率的訃算式分別以下：皂昔產(chǎn)率（紛二皂昔實(shí)質(zhì)產(chǎn)量/豆渣總質(zhì)量X100二提取液體積X提取液濃度/豆渣總質(zhì)量X100皂昔提取率二皂昔產(chǎn)率/皂昔理論含量經(jīng)過上述四種提取方法的比較，結(jié)合實(shí)質(zhì)生產(chǎn)條件，此次的大豆皂昔提取應(yīng)采用有機(jī)溶劑積淀法。大豆皂昔提取液中的主要雜質(zhì)是可溶性糖和大豆異黃酮，可溶性糖占到提取物干重的65%以上，因此除糖是提高大豆皂昔純度的要點(diǎn)。在大豆皂昔的純化工藝中，主要依照各組分的極性及其在不同樣溶劑中溶解度的差異。大豆低聚糖極性相對較大，較易溶于水而不易溶于極性較小的醇中；大豆皂昔則不易溶于乙瞇、乙酸乙酯、丙酮等非極性溶劑。大豆異黃酮極性一般略大于大豆皂昔的極性。因此常用以上極性的差異來分別純化大豆皂昔。H前大豆皂昔純化方法主要有以下兒種，經(jīng)過比較方下：方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)正丁醇法操作簡略溶劑耗費(fèi)大?產(chǎn)品純度及收衆(zhòng)均較低有機(jī)渚劑積淀法工藝簡單■、產(chǎn)品純涪劑耗費(fèi)人度較高酸緘水解-乙酸產(chǎn)品純度高只能御到甘元產(chǎn)站?收率低鉗鹽積淀法產(chǎn)品純度極島收率低、鉗離于有秦表3大豆皂昔不同樣分別純化方法比較柱層析法改復(fù)性好、成本低'產(chǎn)樹脂吸附容魚較小柱層析-仃機(jī)盜劑晶純度高「藝較復(fù)朵、潘劑產(chǎn)品純度髙?積淀進(jìn)耗費(fèi)大制備色譜法大豆電昔筑體產(chǎn)品純成本尚、產(chǎn)最低伽度高、可作標(biāo)準(zhǔn)樣品級）綜合考慮，最正確分別純化方法仍是有機(jī)溶劑積淀法，經(jīng)先人各方面研究得知，丙酮為最合適的積淀劑。因此，為有效提取擁有生理活性和藥用價值的大豆皂昔，用乙醇浸提、正丁醇萃取、丙酮積淀法提取大豆中皂昔，經(jīng)過紫外光譜法檢測大豆皂昔的含量和純度。實(shí)驗(yàn)方案：1.1資料與方法實(shí)驗(yàn)資料:一般大豆、齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品（市售）實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備:平底燒瓶數(shù)個、具塞試管數(shù)只、恒溫水浴鍋、不同樣量程量筒數(shù)個、紫外光分光光度計(jì)、壓迫機(jī)、恒溫干燥箱實(shí)驗(yàn)試劑:70%80%5%酸、乙乙醇、飽和正丁醇、屮醇、丙酮、香草醛、高氯酸、冰乙酸乙酯（所用化學(xué)試劑均為解析純）1.2實(shí)驗(yàn)步驟檢測樣品制備:取市售大豆原料lkg,采用傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)豆腐，收集浸泡大豆水和黃漿水，將剛榨過豆?jié){的大豆?jié)穸乖?5?條件下干燥至恒重獲得大豆殘?jiān)４蠖箯U水中檢測樣品的制備：大豆廢水?超濾？乙酸乙酯萃取?減壓蒸憎出去乙酸乙酯?無水乙醇溶解?上大孔樹脂層析柱?收集活性峰?減壓蒸鐳除去醇和水?大豆異黃酮混雜物（以上出自網(wǎng)的《豆腐生產(chǎn)中黃漿水的綜合利用》）III于大豆皂貳與大豆異黃酮溶解度和含量基實(shí)情似，因此也可以從大豆乳清廢水中提取大豆皂貳。利用提取異黃酮的實(shí)驗(yàn)方法將二者的混雜物提取出后，利用有機(jī)溶劑法提取大豆皂昔（同大豆殘?jiān)?。大豆殘?jiān)写衷砦魳悠返闹苽?取大豆殘?jiān)?0g兩份分別置于2個500ml的平底燒瓶中；向其中加入70%乙醇溶液350ml搖勻；在80?恒溫下浸泡7h;冷卻后用布氏漏斗過濾，將濾液濃縮到50皿；用等體積飽和正丁醇萃取，取正丁醇相濃縮至呈褐色粘稠狀冷卻;加入2.8ml的80%甲醇溶液溶解;再加入40mL丙酮充分振蕩，離心積淀，烘干稱重即得粗皂昔。大豆皂昔含量的測定方法采用香草醛，高氯酸比色法對大豆皂昔的含量進(jìn)行檢測，經(jīng)過解析兒種顯色反應(yīng)方法，確立了最正確顯色條件：向樣品中分別加入0.2ml5,香草醛溶液和0.8ml高氯酸，于70?水浴反應(yīng)lomin,流水冷卻，加入5ml冰乙酸。2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品27.60mg置于100mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度,得濃度為0.276ug/uL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液100、200、300、400、500、600uL于具塞試管中，70?水浴上蒸干，于每個試管中加新配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL,高氯酸0.8mL,置水浴上加熱lomin,流水冷卻，加冰醋酸搖60?5mL,勻，以550nm為設(shè)定波長測定吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)（Y）,齊墩果酸相當(dāng)量為橫坐標(biāo)（X,g）,獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.3樣