基因工程高三復(fù)習(xí)用課件

第35講

基因工程轉(zhuǎn)魚抗寒基因的番茄轉(zhuǎn)基因鮭魚人類按照自己的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予生物新的遺傳特征?？瓜x害的玉米第一章：基因工程一、概念：基因工程又叫做基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。這種技術(shù)是在生物體外，通過對DNA分子進(jìn)行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無性繁殖，使重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物。

基因工程的別名基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)操作環(huán)境生物體外操作對象基因操作水平DNA分子水平基本過程剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)結(jié)果人類需要的基因產(chǎn)物實(shí)質(zhì)：基因重組限制酶的識別序列限制酶所識別的序列的特點(diǎn)是：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對稱，無論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的，稱為回文序列

黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對，這樣的切口叫黏性末端。平末端平末端SmaI限制酶的切割當(dāng)限制酶從識別序列的中心軸線處切開時(shí)，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。二、操作的工具2、基因的針線——DNA連接酶

（1）作用：將互補(bǔ)配對的DNA片段連接起來，使之成為一個(gè)完整的DNA分子。（2）作用部位：形成磷酸二酯鍵（3）常見DNA連接酶①EcoliDNA連接酶(來自大腸桿菌)-----只作用于黏性末端。②T4噬菌體連接酶-----既連接黏性末端又作用于平末端，但連接平末端的效率較低。兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來DNA連接酶的縫合作用可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，DNA連接酶DNA聚合酶相同點(diǎn)作用實(shí)質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點(diǎn)模板作用對象作用結(jié)果 用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)

不需要需要形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制（4）DNA連接酶與DNA聚合酶的比較只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵載體的作用載體的必要條件載體的種類3、基因的運(yùn)輸工具--載體1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。2）具多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接。3）具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行鑒定和選擇。4）必須是安全的，對受體細(xì)胞無害。5）載體DNA分子應(yīng)大小適中，以便于提取和操作1）作為運(yùn)載工具，將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞中2）在受體細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制①細(xì)菌的質(zhì)粒②病毒：噬菌體、動植物病毒等。

有標(biāo)記基因的存在，可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別。有切割位點(diǎn)能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制質(zhì)?！懵兜?、結(jié)構(gòu)簡單的、獨(dú)立于細(xì)菌染色體（即擬核DNA）之外，并具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。最常用運(yùn)載體——質(zhì)粒

實(shí)際上在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。1.2基因工程的基本操作程序提取目的基因的方法用限制酶切斷成許多片段⑴直接分離基因——鳥槍法將供體生物的DNA用限制酶切割為許多片段，再用運(yùn)載體將這些片段都運(yùn)載到受體生物的不同細(xì)胞中去。只要有一個(gè)細(xì)胞獲得了需要的目的基因并得以表達(dá)，基因工程就算成功了。

該法最大的缺點(diǎn)是帶有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能將真核生物的基因轉(zhuǎn)移到原核生物中去。⑵人工合成基因法DNA合成儀有兩種方法：

①逆轉(zhuǎn)錄法：以信使RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下將脫氧核苷酸合成合成DNA(基因)。

②直接合成法：根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸順序推算出信使RNA核苷酸順序，再據(jù)此推算出基因DNA的脫氧核苷酸順序。用游離脫氧核苷酸直接合成相應(yīng)的基因。（4）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增

概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段原理：DNA復(fù)制四種脫氧核苷酸(dNTP)等

模板DNA(需含有目的基因)

條件：一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物前提：TaqDNA聚合酶等

PCR儀2、構(gòu)建表達(dá)載體用與提取目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒使之出現(xiàn)一個(gè)切口，將目的基因插入切口處，在連拉酶的作用下連接形成重組DNA分子。一個(gè)完整的表達(dá)載體包括：目的基因，標(biāo)記基因，啟動子，終止子。知識點(diǎn)一：1.原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動子終止子啟動子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結(jié)合位點(diǎn)并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì).(以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落)①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)②有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNA

聚合酶結(jié)合位點(diǎn)等。非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（轉(zhuǎn)化）導(dǎo)入擴(kuò)增要讓目的基因表達(dá)，必須將它導(dǎo)入受體細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增。為使重組的DNA分子更容易進(jìn)入受體細(xì)胞，通常還要用一些物質(zhì)對受體細(xì)胞進(jìn)行處理，使受體細(xì)胞具有更大的通透性。（一）轉(zhuǎn)化：（二）方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)【將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法】（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

①農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力【將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞】

方法：顯微注射法

程序：目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動物【將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞】

原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、

遺傳物質(zhì)少

方法：

用Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子檢測—鑒定—①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交基因探針與mRNA雜交抗原抗體雜交4、目的基因的檢測和表達(dá)基因探針

基因探針就是一段與目的基因或DNA互補(bǔ)的特異核苷酸序列。它包括整個(gè)基因，或基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來的RNA。歸納步驟【檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因】①首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA；②用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針；③使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中。（1）方法:DNA分子雜交（2）過程:【檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA】【檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)】①方法:基因探針與mRNA雜交方法：抗原抗體雜交②過程:

用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）基因操作的基本步驟（四）基因工程的成果與發(fā)展前景1、基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生2、基因工程與農(nóng)牧業(yè)、食品工業(yè)3、基因工程與環(huán)境保護(hù)1、基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生我國生產(chǎn)的部分基因

工程疫苗和藥物（1）基因工程藥品的生產(chǎn)微生物生長迅速，容易控制，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。如利用大腸桿菌生產(chǎn)胰島素、干擾素、白細(xì)胞介素—2等。既增加產(chǎn)量，又降低成本。胰島素是治療糖尿病的特效藥。一般臨床上使用的胰島素主要從豬、牛等家畜的胰腺中提取，每100kg胰腺只能提取4~5g胰島素。用該方法生產(chǎn)的胰島素產(chǎn)量低，價(jià)格昂貴，遠(yuǎn)不能滿足社會需要。1979年，科學(xué)家將動物體內(nèi)的胰島素基因與大腸桿菌DNA分子重組，并在大腸桿菌內(nèi)實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。1982年，美國一家基因公司用基因工程方法生產(chǎn)的胰島素投入市場，售價(jià)降低了30%~50%?；蚬こ趟幤贰葝u素治療侏儒癥的唯一方法，是向人體注射生長激素。而生長激素的獲得很困難。以前，要獲得生長激素，需解剖尸體，從大腦的底部摘取垂體，并從中提取生長激素?，F(xiàn)可利用基因工程方法，將人的生長激素基因?qū)氪竽c桿菌中，使其生產(chǎn)生長激素。人們從450L大腸桿菌培養(yǎng)液中提取的生長激素，相當(dāng)于6萬具尸體的全部產(chǎn)量?；蚬こ趟幤贰L激素（2）基因診斷基因診斷是用放射性同位素(如32P)、熒光分子等標(biāo)記的DNA分子做探針，利用DNA分子雜交原理，鑒定被檢測標(biāo)本上的遺傳信息，達(dá)到檢測疾病的目的。1）β—珠蛋白的DNA探針→鐮刀狀細(xì)胞貧血癥2）苯丙氨酸羧化酶基因探針→苯丙酮尿癥3）白血病患者細(xì)胞中分離出的癌基因制備的DNA探針→白血?。?）基因治療基因治療是把健康的外源基因?qū)胗谢蛉毕莸募?xì)胞中，達(dá)到治療疾病的目的。取患者骨髓分離干細(xì)胞病毒正常基因并入正?；虻母杉?xì)胞注入患者體內(nèi)（1）農(nóng)業(yè)上：獲得高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和具優(yōu)良品質(zhì)的農(nóng)作物

用基因工程的方法可以改善糧食作物的蛋白質(zhì)含量。如“向日葵豆”植株。培育具抗逆性的作物新品種

將細(xì)菌的抗蟲、抗病毒、抗除草劑、抗鹽堿、抗干旱、抗高溫等抗性基因轉(zhuǎn)移到作物體內(nèi)，將從根本上改變作物的特性。如轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。2、基因工程與農(nóng)牧業(yè)、食品工業(yè)繁殖具有抗病能力、高產(chǎn)仔率、高產(chǎn)奶率和高質(zhì)量的皮毛等優(yōu)良品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因動物。該過程的重要步驟是通過感染或顯微注射技術(shù)將重組DNA轉(zhuǎn)移到動物受精卵中。（2）畜牧養(yǎng)殖業(yè)上將人的生長激素基因和牛的生長素基因分別注射到小白鼠受精卵中，得到的“超級小鼠”。

基因工程為人類開辟新的食物來源。

1）雞蛋白基因在大腸桿菌和酵母菌中表達(dá)獲得成功。這表明，未來能用發(fā)酵罐培養(yǎng)的大腸桿菌或酵母菌來生產(chǎn)人類所需要的卵清蛋白。

2）用基因工程的方法從微生物中獲得人們所需要的糖類、脂肪和維生素等產(chǎn)品。（3）食品工業(yè)中：轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒轉(zhuǎn)魚抗寒基因的番茄3、基因工程與環(huán)境保護(hù)（1）環(huán)境監(jiān)測

基因工程做成的DNA探針能夠十分靈敏地檢測環(huán)境中的病毒、細(xì)菌等污染。利用基因工程培育的“指示生物”能十分靈敏地反映環(huán)境污染的情況，卻不易因環(huán)境污染而大量死亡，甚至還可以吸收和轉(zhuǎn)化污染物。（2）環(huán)境污染治理

基因工程做成的“超級細(xì)菌”能吞食和分解多種污染環(huán)境的物質(zhì)。1、有些轉(zhuǎn)基因食物含的一些物質(zhì)，可能會影響人體健康。2、大量的轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)入自然界后很可能會與野生物種進(jìn)行雜交，產(chǎn)生一些超級生物，從而造成基因污染。3、如有些作物插入抗蟲基因，殺死環(huán)境中有益的生物?；蚬こ痰谋锥说鞍踪|(zhì)工程一、蛋白質(zhì)工程崛起的緣由1、基因工程的應(yīng)用（1）基因工程的實(shí)質(zhì)：將一種生物的

轉(zhuǎn)移到另一種生物體內(nèi)，使后者產(chǎn)生本不能產(chǎn)生的

，進(jìn)而表現(xiàn)出新的

。（2）基因工程的不足：在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的

。2、天然蛋白質(zhì)的不足天然蛋白質(zhì)是生物在長期

過程中形成的，它們的

符合特定物種

的需要，卻不一定完全符合人類生產(chǎn)和生活的需要。3、蛋白質(zhì)工程的目的生產(chǎn)符合人類生產(chǎn)和生活的需要的

?；虻鞍踪|(zhì)性狀蛋白質(zhì)進(jìn)化結(jié)構(gòu)和功能生存蛋白質(zhì)1、蛋白質(zhì)工程的概念基礎(chǔ):蛋白質(zhì)工程的實(shí)質(zhì)：途徑:目標(biāo):蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能基因修飾或基因合成改造或制造新的蛋白質(zhì)，滿足人類的生產(chǎn)或生活的需要是對編碼蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行改造二、蛋白質(zhì)工程的概念和原理對天然蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，你認(rèn)為直接對蛋白質(zhì)分子進(jìn)行操作，還是通過對基因的操作來實(shí)現(xiàn)？蛋白質(zhì)工程的流程基因DNA氨基酸序列多肽鏈蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)期功能生物功能mRNA轉(zhuǎn)錄翻譯折疊DNA合成分子設(shè)計(jì)2、蛋白質(zhì)工程原理天然蛋白質(zhì)的合成途徑：基因表達(dá)（轉(zhuǎn)錄和翻譯）形成氨基酸序列的多肽鏈形成具有高級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)行使生物功能預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)推測應(yīng)有的氨基酸序列找到相應(yīng)的脫氧核苷酸序列酸蛋白質(zhì)工程的途徑：對蛋白質(zhì)進(jìn)行改造大改中改小改設(shè)計(jì)、制造出自然界不存在的全新蛋白質(zhì)替代某一個(gè)肽段或一個(gè)特定的結(jié)構(gòu)域改造某個(gè)活性單位的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基（定點(diǎn)誘變技術(shù)）核心技術(shù)

蛋白質(zhì)的分子設(shè)計(jì)與改造蛋白質(zhì)工程首先是以蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，通過蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)和溶液構(gòu)象的研究，積累了成千上萬蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)資料，并編制成系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫，得以從中找出蛋白質(zhì)分子間的進(jìn)化關(guān)系、一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)的關(guān)系、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系方面的規(guī)律。基因定點(diǎn)誘變技術(shù)的示意圖異亮氨酸蘇氨酸天門冬酰胺天門冬酰胺酵母菌丙糖磷酸異構(gòu)酶熱穩(wěn)定性提高50％工業(yè)生產(chǎn)上三、蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用1、改造酶結(jié)構(gòu)，提高酶的熱穩(wěn)定性和催