雙水相萃取實(shí)驗(yàn)

5/5雙水相萃取實(shí)驗(yàn)一、雙水相系統(tǒng)的相圖繪制

1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

了解制作雙水相系統(tǒng)的相圖的方法，加深對(duì)相圖的認(rèn)識(shí)。

2.實(shí)驗(yàn)原理

相圖是研究?jī)伤噍腿〉幕A(chǔ)，雙水相形成條件和定量關(guān)系常用相圖來表示。圖1是典型的高聚物-高聚物-水雙水相體系的直角坐標(biāo)相圖，兩種聚合物A、B以適當(dāng)比例溶于水就會(huì)分別形成有不同組成、度的兩相，上相組成用T點(diǎn)表示，下相組成用B點(diǎn)表示，由圖1可知上下相所含高聚物有所偏重，上相主要含B，下相主要含A。曲線TCB稱為結(jié)線，直線TMB稱為系線。結(jié)線上方是兩相區(qū)，下方為單相區(qū)，若配比取在曲線上，則混合后，溶液恰好從澄清變?yōu)榛鞚?。組成在系線上的點(diǎn)，分為兩相后，其上下相組成分別為T和B，T、B量的多少服從相圖的杠桿定律。即T和B相質(zhì)量之比等于系線上MB與MT的線段長(zhǎng)度之比。又由于兩相密度相差很小，故上下相體積之比也近似等于系線上MB與MT線段長(zhǎng)度之比。

圖1A-B-水雙水相體系相圖

Oaqueoustwo-phasesystemFigure1ThephasediagramoftheA-B-H

2

3.實(shí)驗(yàn)器材和試劑

（1）器材：電子臺(tái)秤，漩渦混合器，大試管，滴定管，密度計(jì)，溫度計(jì)。（2）試劑：聚乙二醇，硫酸銨，硫酸鎂。

4.操作方法

（1）溶液的配制

配制40%的鹽（硫酸銨或硫酸鎂）溶液

配制40%的聚乙二醇溶液，液體聚乙二醇可用純?nèi)芤骸?/p>

（2）相圖的制作

精確稱取一定質(zhì)量（0.7000g左右）PEG溶液于大試管中，按表1所列第1列數(shù)據(jù)，加入0.5mL去離子水，用滴定管緩慢滴加已配好的40%的鹽溶液，并不斷在漩渦混合器上混合，觀察溶液的澄清程度，直至試管內(nèi)液體出現(xiàn)渾濁為止。記錄鹽溶液的加量(g)。然后，按表格所列第2列數(shù)據(jù)加入水，溶液澄清，繼續(xù)向試管中滴加鹽溶液并不斷混勻，直至再次達(dá)到渾濁，如此反復(fù)操作。計(jì)算每次達(dá)到渾濁時(shí)，PEG和鹽在系統(tǒng)總量中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)填入表中，以PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，某種鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)作圖，即得到一條雙節(jié)線的相圖。

表1相圖制作表

編

號(hào)水

/g(NH4)2SO4溶液加量/g純(NH4)2SO4累計(jì)量/g溶液累計(jì)總量/g(NH4)2SO4質(zhì)量分

數(shù)/%PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%10.53.13150.8954.378620.44.7920.32.17921.51865.951121.853.0230.32.04562.19.286722.652.2640.33.13723.012.673823.681.6550.56.07694.719.327624.521.0860.56.19096.526.013825.020.870.5

6.8585

8.5

33.4596

25.32

0.62

根據(jù)以上數(shù)據(jù)以(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，以PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)即可做出相圖。

二、雙水相系統(tǒng)比例的選擇

根據(jù)相圖，選擇五個(gè)成相比例。

三、蛋白酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制——Folin酚法或紫外分光光度法

PEG4000與MgSO4雙水相圖

y=0.0995x2-5.3887x+73.334

2012345

6

20

21

22

2324

25

26

MgSO4%

PEG4000%

紫外分光光度法測(cè)蛋白酶酶活

1．原理

蛋白酶在一定的溫度與pH條件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸終止酶反應(yīng)，并使未水解的酪素沉淀除去，濾液對(duì)紫外光有吸收，可用紫外分光光度法測(cè)定。根據(jù)吸光度計(jì)算其酶活力。酶活單位的定義：每1mL粗酶液，在一定溫度和pH值條件下，1min水解酪素產(chǎn)生1ug酪氨酸為一個(gè)酶活力單位，以（u/mL）表示。

2．試劑和溶液

2.1三氯乙酸c=0.4mol/L：稱取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000mL。

2.2氫氧化鈉溶液c（NaOH）=0.5mol/L

2.3鹽酸溶液c（HCl）＝1mol/L及0.1mol/L

1mol/LHCl:取90mL濃鹽酸溶解于去離子水中，定容至1000mL。

0.1mol/LHCl：取9mL濃鹽酸溶解于去離子水中，定容至1000mL。

2.4緩沖溶液

a.磷酸緩沖液（pH＝7.5）適用于中性蛋白酶

稱取磷酸氫二鈉（Na

2HPO

4

·12H

2

O）6.02g和磷酸二氫鈉（NaH

2

PO

4

·12H

2

O）0.5g，

加水溶解并定容至1000mL。

b.乳酸緩沖液（pH＝3.0）適用于酸性蛋白酶

甲液稱取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000mL。

乙液稱取乳酸鈉（70％）16g，加水溶解并定容至1000mL。

使用溶液取甲液8mL，加乙液1mL，混勻，稀釋一倍，即成0.05moi/L乳酸緩沖溶液。

c.硼酸緩沖溶液（pH＝10.5）適用于堿性蛋白酶

甲液稱取硼酸鈉（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000mL。

乙液稱取氫氧化鈉4.0g，加水溶解并定容至1000mL。

使用溶液取甲液500mL、乙液400mL混勻，用水稀釋至1000mL。

上述各種緩沖溶液，均須用pH計(jì)校正。

2.510g/L酪素溶液

稱取酪素1.000g，精確至0.001g，用少量0.5mol/L氫氧化鈉溶液（若酸性蛋白酶則用濃乳酸2～3滴）濕潤后，加入適量的各種適宜pH的緩沖溶液約80mL，

在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直到完全溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，用適宜的ｐH緩沖溶液稀釋至刻度。此溶液在冰箱內(nèi)貯存，有效期為三天。

2.6100ug/mLL-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液

a．稱取預(yù)先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精確至0.0002g，用1mol/L鹽酸60mL溶解后定容至100mL，即為1mg/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

b．吸取1mg/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液10.00mL，用0.1mol/L鹽酸定容至100mL，即得到100ug/mLL－酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。此溶液在冰箱內(nèi)貯存或立即使用。

3.儀器和設(shè)備

3.1恒溫水浴40±0.2℃。

3.2紫外分光光度計(jì)

4分析步驟

4.1求K值

按下表配制不同濃度的L－酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后，直接用紫外分光光度計(jì)于275nm測(cè)定其吸光度（A），以吸光度A為縱坐標(biāo)，酪氨酸的濃度c為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（此線應(yīng)通過零點(diǎn)）,根據(jù)作圖或用回歸方程，計(jì)算出當(dāng)吸光度為1時(shí)的酪氨酸的量（μg），即為吸光常數(shù)K值;（其K值應(yīng)在（130～135）范圍內(nèi)）。

4.2測(cè)定

吸取適量稀釋的酶液2.00mL、酪素2.00mL、三氯乙酸4.00mL，其它操作條件同福林法測(cè)定中的反應(yīng)、靜止沉淀，直到過濾。濾液用紫外分光光度計(jì)，在275nm波長(zhǎng)下，用10mm比色皿，測(cè)定其吸光度（A）。

a、先將酷素溶液放入40±0.2℃恒溫水浴中，預(yù)熱5min；

b、按下列程序操作：

試管A（空白）試管B（酶試樣，需作三個(gè)平行試樣）

加酶液2.00mL加酶液2.00mL

40±0.2℃，2min40±0.2℃，2min

加三氯乙酸4.00mL（搖勻）加酪素2.00mL(已預(yù)熱)（搖勻）

40±0.2℃，10min（精確計(jì)時(shí)）40±0.2℃，10min（精確計(jì)時(shí)）

加酪素2.00mL(已預(yù)熱)（搖勻）加三氯乙酸4.00mL（搖勻）

繼續(xù)加熱10min，過濾或離心繼續(xù)加熱10min，過濾或離心

于275nm波長(zhǎng)，測(cè)上清液吸光值于275nm波長(zhǎng)，測(cè)上清液吸光值

c、1.398和166蛋白酶，除反應(yīng)與顯色溫度為30±0.2℃外，其它操作同4.2。標(biāo)準(zhǔn)曲線作同樣處理。

5計(jì)算

在40℃下每毫升酶液每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸,定義為1個(gè)蛋白酶活力單位。

X＝A×K×8/2×1/10×n×E＝2/5×A×K×n×E

式中：X——樣品的酶活力，(u/mL)；

A——試樣溶液的平均吸光度；

K——吸光常數(shù)；

8——反應(yīng)試劑的總體積，mL；

2——吸取酶液2.00mL；

1/10——反應(yīng)時(shí)間10min，以1min計(jì)；

n——稀釋倍數(shù)

E——紫外法與福林法的換算系數(shù)（中性、堿性蛋白酶系數(shù)為0.50；酸性蛋白酶系數(shù)為0.77）。

所得結(jié)果表示至整數(shù)。

6結(jié)果的允許差

平行試驗(yàn)測(cè)定值之差不得超過3％。

四、雙水相系統(tǒng)在蛋白酶分離中的應(yīng)用

利用選擇的五個(gè)成相體系對(duì)蛋白酶進(jìn)行分離純化