細(xì)胞分化-細(xì)胞生物學(xué)-2-13課件

第十三章Différentiationcellulaire細(xì)胞分化一個受精卵如何變成一個孩子？個體發(fā)育是通過細(xì)胞分化來實(shí)現(xiàn)的受精后6星期，人形已隱約可見。這時，胚胎的心跳每分鐘140—150下．是母親心跳的兩倍。

細(xì)胞分化（Différentiationcellulaire)

由同源細(xì)胞逐漸變?yōu)樵谛螒B(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能和生化特征等方面具有穩(wěn)定差異的另一類型細(xì)胞的過程。并非所有細(xì)胞均能分化干細(xì)胞(StemCell)是存在于人和動物發(fā)育各階段（包括早期胚胎和成熟組織）的一類原始狀態(tài)的未分化細(xì)胞，它能夠自我更新并始終保持很強(qiáng)的分化潛能，可以產(chǎn)生一種、多種、甚至全部的機(jī)體細(xì)胞類型。具體詳見第五篇第十六章干細(xì)胞的類型：

胚胎干細(xì)胞embryonicstemcells

胚胎干細(xì)胞主要是指來自囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞，有自我更新和多向分化潛能，可以分化為內(nèi)、中、外三個胚層的各類細(xì)胞。成體干細(xì)胞

adultstemcells

成體干細(xì)胞是處于干細(xì)胞狀態(tài)的成體細(xì)胞，包括成年和未成年動物組織中的各種干細(xì)胞，因此又稱為組織干細(xì)胞。如神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、骨髓間質(zhì)干細(xì)胞、上皮干細(xì)胞、肝干細(xì)胞、胰腺干細(xì)胞等。胚胎干細(xì)胞的來源成體干細(xì)胞的功能自然條件下成體干細(xì)胞傾向于分化成所在組織的細(xì)胞，參與組織更新和損傷修復(fù)；外界條件誘導(dǎo)下成體干細(xì)胞可橫向分化成其他組織的細(xì)胞，參與這些組織的損傷修復(fù)。成體的組織更新也是細(xì)胞分化的結(jié)果

保持親代干細(xì)胞的特性增殖、分化成體干細(xì)胞終末分化細(xì)胞死亡

已存在的細(xì)胞通過增殖形成相同類型的子細(xì)胞，如肝細(xì)胞成體干細(xì)胞產(chǎn)生新的分化，如表皮細(xì)胞

成體產(chǎn)生新的分化細(xì)胞表皮干細(xì)胞的分化各種血液細(xì)胞的形成過程Science.1992Mar27;255(5052):1707-10

Neurogenesisinthemammaliancentralnervoussystemisbelievedtoendintheperiodjustafterbirth;inthemousestriatum（紋狀體）nonewneuronsareproducedafterthefirstfewdaysafterbirth.Inthisstudy,cellsisolatedfromthestriatumoftheadultmousebrainwereinducedtoproliferateinvitrobyepidermalgrowthfactor.Theproliferatingcellsinitiallyexpressednestin,anintermediatefilamentfoundinneuroepithelialstemcells,andsubsequentlydevelopedthemorphologyandantigenicpropertiesofneuronsandastrocytes.Newlygeneratedcellswithneuronalmorphologywereimmunoreactiveforgamma-aminobutyricacidandsubstanceP,twoneurotransmittersoftheadultstriatuminvivo.Thus,cellsoftheadultmousestriatumhavethecapacitytodivideanddifferentiateintoneuronsandastrocytes.ReynoldsandWeiss,1992

Cell.1999Jan8;96(1):25-34

Newneuronsarecontinuouslyaddedinspecificregionsoftheadultmammaliancentralnervoussystem.Theseneuronsarederivedfrommultipotentstemcellswhoseidentityhasbeenenigmatic.Inthiswork,wepresentevidencethatependymalcells(室管膜細(xì)胞)areneuralstemcells.Ependymalcellsgiverisetoarapidlyproliferatingcelltypethatgeneratesneuronsthatmigratetotheolfactorybulb.Inresponsetospinalcordinjury,ependymalcellproliferationincreasesdramaticallytogeneratemigratorycellsthatdifferentiatetoastrocytesandparticipateinscarformation.Thesedatademonstratethatependymalcellsareneuralstemcellsandidentifyanovelprocessintheresponsetocentralnervoussysteminjury.

Johanssonetal.,1999

不同的細(xì)胞存在分化能力的差異細(xì)胞分化經(jīng)歷一個分化能力逐漸受限制的過程全能細(xì)胞多能細(xì)胞單能細(xì)胞終末分化細(xì)胞細(xì)胞如何hui變得不同？不對稱分裂：生成不同的子細(xì)胞對稱分裂：子細(xì)胞形成后因受到不同的影響而成為不同的細(xì)胞2.細(xì)胞間的相互誘導(dǎo)來自外部的信號使一群細(xì)胞中的一個或更多的成員進(jìn)入不同的發(fā)育途徑，此過程稱為誘導(dǎo)式的相互作用。誘導(dǎo)信號細(xì)胞被導(dǎo)入新的發(fā)育途徑細(xì)胞間誘導(dǎo)式的相互作用3.相鄰細(xì)胞的側(cè)向抑制已分化的細(xì)胞可以產(chǎn)生抑制臨近細(xì)胞朝相同方向分化的物質(zhì)，阻止它們成為和自己一樣。細(xì)胞間的相互接觸和側(cè)向抑制抑制信號4.信號分子的梯度效應(yīng)當(dāng)信號分子從一個源頭向外擴(kuò)散時，往往形成一個信號的濃度梯度，使得距源頭遠(yuǎn)近不同的細(xì)胞根據(jù)自己周圍信號分子的濃度，表現(xiàn)出各種不同的行為。成形素蛋白在小雞四肢發(fā)育中的作用

細(xì)胞分化的多向性與細(xì)胞決定未分化細(xì)胞終末分化細(xì)胞A終末分化細(xì)胞B終末分化細(xì)胞E終末分化細(xì)胞C終末分化細(xì)胞D移植實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞的決定狀態(tài)DeterminedIndevelopmentalbiology,anembryoniccellissaidtobedeterminedifithasbecomecommittedtoaparticularspecializedpathofdevelopment.Thisdeterminationreflectsachangeintheinternalcharacterofthecell,anditprecedesthemuchmorereadilydetectedprocessofcelldifferentiation.細(xì)胞決定雞胚：移植前，肢芽（長出大腿）和翼芽（長出翅膀）兩處細(xì)胞形態(tài)相同，均未分化。肢芽組織塊移植至翼芽部位，結(jié)果：翼尖為腳趾。肢芽翼芽長出翅膀不同類型的細(xì)胞合成不同的蛋白管家基因（huosekeepinggene）：編碼維持細(xì)胞最低限度的功能所不可缺少的蛋白質(zhì)的基因，如組蛋白、細(xì)胞周期蛋白的基因，這些基因不參與細(xì)胞分化的定向，對細(xì)胞分化只有協(xié)助作用。奢侈基因(luxurygene)：有些蛋白和分化細(xì)胞的特殊性狀密切相關(guān)，但不是細(xì)胞基本生命活動必不可少的，編碼此類蛋白的基因稱為奢侈基因，與各種分化細(xì)胞的特殊性狀有直接關(guān)系。細(xì)胞分化是奢侈基因按一定時空順序表達(dá)的結(jié)果細(xì)胞分化是基因按一定時空順序表達(dá)的結(jié)果，這種在個體發(fā)育過程中不同的基因按照一定的時空順序被激活的現(xiàn)象稱為“基因的差異表達(dá)”。成纖維細(xì)胞被加入肌源蛋白后分化為肌細(xì)胞生皮肌節(jié)：arecollectoionsofembryonicmesodermalcells

成肌細(xì)胞Threestagesindevelopmentofskeletalmuscleinmammals。Myoblastsarecommittedtobecomemusclebuthavenotyetdifferentiated;hencetheyarereferedtoasdetermined.Myogenicgenes(myoD,myogenin,myf5,mrf4)werefirstidentifiedinstudieswithculturedfibroblastsMyogenicproteinsaretranscriptionfactors絕大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞核可始終保持分化的全能性多能細(xì)胞：具有演變?yōu)槎喾N細(xì)胞類型的能力。單能細(xì)胞：僅具有分化形成某一種類型細(xì)胞的能力。細(xì)胞的全能性：生物體中的一個體細(xì)胞或一個性細(xì)胞在一定條件下，有能力重新形成完整的個體，或者分化形成該個體任何種類的細(xì)胞。此特性稱為“細(xì)胞全能性”。受精卵、8細(xì)胞期前的胚胎細(xì)胞是全能細(xì)胞。體細(xì)胞克隆技術(shù)的誕生克隆（clone）就是指一個細(xì)胞或生物體通過無性繁殖方法擴(kuò)增所得到的一批同樣的細(xì)胞或生物體，簡單來說就是無性繁殖?！拔饔斡洝敝械拿篮锿跎瞄L克?。喊胃姑兂鲂∶篮锿?997年2月24日：克隆羊培育成功。隨后幾年中，克隆牛、克隆貓、克隆猴相繼面世。12生肖已經(jīng)克隆了一半。多名研究人員宣布克隆人計(jì)劃

克隆人：我到底是誰？體細(xì)胞克隆羊多利1997年克隆羊多利的誕生震驚了世界，被譽(yù)為20世紀(jì)最重大、也是最有爭議的科技突破之一。

胚胎細(xì)胞克隆猴“泰特拉”2000年1月這些克隆猴將用于人類糖尿病和帕金森氏癥的研究。茜茜來到這個世上很不容易，科學(xué)家共實(shí)驗(yàn)了188次才獲得成功。

克隆貓CC(clonecat)2002年初

由我國自主完成的成年體細(xì)胞克隆牛誕生，至今已產(chǎn)犢14頭，存活5頭。這表明我國已成為繼日本、新西蘭、美國等國家之后掌握體細(xì)胞克隆牛關(guān)鍵技術(shù)的少數(shù)國家之一。中國克隆的牛犢1.將人類卵細(xì)胞中的DNA取出，由此獲得卵細(xì)胞的空殼。4.胚胎在子宮內(nèi)逐漸發(fā)育成熟，直至降生。3.將早期胚胎植入代理受孕母親的子宮。2.將體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)植入空殼，通過電擊刺激卵細(xì)胞發(fā)育，并發(fā)育到早期胚胎狀。治療性克隆通常指通過對干細(xì)胞的研究來復(fù)制人類的某些組織或器官。生殖性克隆是指對整個人的復(fù)制，即從被克隆的人身上取得細(xì)胞之后，將其植入被去除了遺傳基因物質(zhì)的卵細(xì)胞空殼中，通過刺激使新卵細(xì)胞分化并形成胚胎，之后將胚胎植入母體的子宮里孕育?？寺雰壕哂信c遺傳物質(zhì)源相同的生理特性。目前，國際上一般把對人類自身的克隆分為治療性克隆和生殖性克隆治療性克隆return克隆人普通人細(xì)胞質(zhì)的重新編程作用GenesthatareunexpressedinsomaticcellshavebeenactivatedbyinjectingculturedcellnucleiofthefrogXenopuslaevis（非洲爪蛙）intooocytesofthenewtPleurodeleswaltlii（東方蠑螈）.Thegenesthatwereactivatedarenormallyexpressedinoocytesbutnotinculturedcells.Conversely,genesthatarenormallyexpressedinculturedcellsbutnotinoocytesbecameinactivewhenculturedcellnucleiwereinjectedintooocytes.Thesechangesingeneactivityweredetectedbytwo-dimensionalgelelectrophoresisofproteinssynthesizedbyoocytesinjectedwithnuclei.Controls,whichincludedtheuseofalpha-amanitin,showedthatthesechangesinproteinsynthesisaredependentongenetranscription.Weconcludethatgenesthatbecomeinactiveduringcelldifferentiationcanbereactivated,intheabsenceofcelldivision,bynormalcomponentsofoocytecytoplasm.ProcNatlAcadSciUSA.1977:2470–2474.

DeRobertisEM,GurdonJB.

DNA甲基化修飾可能是一種重新編程的方式DNA自身的共價，限于CG序列的胞嘧啶上。由甲基轉(zhuǎn)移酶催化修飾。甲基化和去甲基化可調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。（CTCF蛋白對Pax6表達(dá)的調(diào)節(jié)）DNA甲基化可以忠實(shí)地得到遺傳基因芯片實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和過程去甲基化處理48h后ES細(xì)胞在沒有滋養(yǎng)層細(xì)胞條件下培養(yǎng)1μM甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Azad-2’-deoxycytidine處理RNA準(zhǔn)備:

新鮮抽提組織

用RNA600Nano

LabChip質(zhì)檢cRNA的準(zhǔn)備:擴(kuò)增率,>20電泳芯片雜交測試基因芯片:

均一的背景

良好的整體信號

雜交陽性對照GAPDH,-actin3’/5’信號

組內(nèi)可重復(fù)性數(shù)據(jù)收集:高嚴(yán)謹(jǐn)性標(biāo)準(zhǔn)化(TGT,GAPDH)去甲基化Demethylation-inducedchangesofgeneexpressioninmouseEScells2,0322,003Up-regulatedgenesbyDNAdemethylation-Down-regulatedgenesbyDNAdemethylation-1612840-4mRNARatioChangedDnmt2Pax6H19IGF2RDnmt3b1.基因組合調(diào)控產(chǎn)生多種調(diào)節(jié)模式組合調(diào)控（combinationalcontrol）一些基因調(diào)節(jié)蛋白通過一定的組合形成一系列的調(diào)節(jié)模塊，依次結(jié)合到調(diào)節(jié)序列上，在正確的時間和空間，表達(dá)正確的基因模式。該機(jī)制可以使為數(shù)不多的基因調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)生眾多的細(xì)胞類型?；蚪M合調(diào)控對發(fā)育的重要作用二、基因調(diào)節(jié)模式的遺傳和細(xì)胞記憶與特化細(xì)胞的特征形成有關(guān)的基因調(diào)節(jié)模式及染色體結(jié)構(gòu)變化是可以遺傳的。正反饋環(huán)的遺傳機(jī)制三、基因表達(dá)的調(diào)節(jié)是多水平的真核細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)節(jié)的多重性四、細(xì)胞質(zhì)的作用胞質(zhì)記憶由細(xì)胞質(zhì)中的成分直接或間接作用于基因組，使得特定的基因被選擇性表達(dá)的現(xiàn)象。第四節(jié)細(xì)胞分化與腫瘤

腫瘤發(fā)生是細(xì)胞去分化或分化阻斷的結(jié)果，其分子基礎(chǔ)是基因突變或表達(dá)異常。一、分化異常與腫瘤腫瘤起源于一些未分化或微分化的干細(xì)胞，主要表現(xiàn)出增殖過度、分化不全的特征。腫瘤細(xì)胞所處的分化狀態(tài)決定了腫瘤的惡性程度。例如白血病是多能造血干細(xì)胞在某一階段分化發(fā)育受阻的結(jié)果。二、誘導(dǎo)分化與腫瘤治療腫瘤細(xì)胞在一定條件和誘導(dǎo)分化劑的作用下可以向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化：維甲酸治療白血病。由同源細(xì)胞逐漸變?yōu)樵谛螒B(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能和生化特征等方面具有穩(wěn)定差異的另一類型細(xì)胞的過程稱為分化。細(xì)胞分化是胚胎發(fā)育和維持成體生存的重要因素。本章小節(jié)已分化的細(xì)胞能夠去分化、轉(zhuǎn)分化。細(xì)胞向哪個方向分化是由各方面因素共同決定的。從基因角度看細(xì)胞分化是基因按一定時空順序表達(dá)的結(jié)果，這種在個體發(fā)育過程中不同的基因按照一定的時空順序被激活的現(xiàn)象稱為“基因的差異表達(dá)”。思考題：解釋下列名詞：細(xì)胞分化去分化轉(zhuǎn)分化細(xì)胞全能性干細(xì)胞管家基因奢侈基因基因的差異表達(dá)

回答下列問題：1.為什么腸上皮細(xì)胞頻繁地更新，而大部分神經(jīng)細(xì)胞的壽命可與機(jī)體的壽命一樣長？分化、增殖狀態(tài)不同的三類細(xì)胞：持續(xù)增殖細(xì)胞：造血干細(xì)胞、表皮基底細(xì)胞、骨原細(xì)胞暫時不增殖細(xì)胞：肝細(xì)胞、初級卵母細(xì)胞不增殖細(xì)胞（終末細(xì)胞）：神經(jīng)元、紅細(xì)胞、表皮角質(zhì)細(xì)胞、骨細(xì)胞更新速度不同的三類細(xì)胞：不更新、接近機(jī)體壽命：神經(jīng)元、骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞緩慢更新：肝細(xì)胞、胃壁細(xì)胞、腎皮質(zhì)細(xì)胞快速更新：表皮細(xì)胞、紅細(xì)胞、白細(xì)胞

干細(xì)胞

stemcell未分化細(xì)胞自我更新

(self-renew)無限增殖體外長期培養(yǎng)多向分化潛能

(multipotential)干細(xì)胞的類型：

胚胎干細(xì)胞embryonicstemcells

胚胎干細(xì)胞主要是指來自囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞，有自我更新和多向分化潛能，可以分化為內(nèi)、中、外三個胚層的各類細(xì)胞。成體干細(xì)胞

adultstemcells

成體干細(xì)胞是處于干細(xì)胞狀態(tài)的成體細(xì)胞，包括成年和未成年動物組織中的各種干細(xì)胞，因此又稱為組織干細(xì)胞。如神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、骨髓間質(zhì)干細(xì)胞、上皮干細(xì)胞、肝干細(xì)胞、胰腺干細(xì)胞等。胚胎早期發(fā)生：囊胚形成

（囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)）胚胎干細(xì)胞的分離和建系

將囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞通過體外培養(yǎng)產(chǎn)生未分化的細(xì)胞克隆，建立胚胎干細(xì)胞系1981年Evans和Martin首次成功分離和建立小鼠胚胎干細(xì)胞系1998年Thomson等首次成功分離和建立人胚胎干細(xì)胞系胚胎干細(xì)胞可在體外誘導(dǎo)分化形成各種成體細(xì)胞胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化外源誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化

誘導(dǎo)因子：維甲酸(RA)、骨形成蛋白BMPs)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)等轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化

用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使某種促分化基因在ES細(xì)胞中表達(dá)、調(diào)節(jié)其分化與其他細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化

創(chuàng)造細(xì)胞分化的微環(huán)境胚胎干細(xì)胞embryonicstemcells（ES細(xì)胞）胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化成體干細(xì)胞adultstemcells又稱組織干細(xì)胞tissuestemcells成體干細(xì)胞的概念成體干細(xì)胞又稱組織干細(xì)胞，傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為它們是存在于成體組織的未分化細(xì)胞，現(xiàn)在認(rèn)為也包括未成年動物的組織干細(xì)胞，它們具有不斷增殖和自我更新能力、又具有多向分化潛能。

如造血干細(xì)胞、骨髓間質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、上皮干細(xì)胞、胰腺干細(xì)胞、肝干細(xì)胞等成體干細(xì)胞的功能自然條件下成體干細(xì)胞傾向于分化成所在組織的細(xì)胞，參與組織更新和損傷修復(fù)；外界條件誘導(dǎo)下成體干細(xì)胞可橫向分化成其他組織的細(xì)胞，參與這些組織的損傷修復(fù)。造血干細(xì)胞的分化表皮干細(xì)胞的分化

干細(xì)胞應(yīng)用前景細(xì)胞治療組織工程藥物篩選發(fā)育研究基因功能研究干細(xì)胞和細(xì)胞治療

stemcellandcelltherapy

細(xì)胞治療

celltherapy

細(xì)胞治療是指將正常或遺傳改造過的人體細(xì)胞直接移植或輸入患者體內(nèi)，以達(dá)到替代受損細(xì)胞、治療疾病的目的。利用干細(xì)胞及其分化細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞治療是干細(xì)胞臨床應(yīng)用的重要研究方向。

胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞都能用于細(xì)胞治療，但目前只有少數(shù)成體干細(xì)胞在細(xì)胞治療上己開始取得臨床療效，大多數(shù)的干細(xì)胞治療還在實(shí)驗(yàn)階段。血液病的細(xì)胞治療如白血病的細(xì)胞治療

造血干細(xì)胞移植：自體移植（臍帶血造血干細(xì)胞）無排斥反應(yīng)同系移植（同卵孿生之間骨髓造血干細(xì)胞）一般無排斥反應(yīng)同種移植（人與人之間骨髓造血干細(xì)胞）有排斥反應(yīng)（供、受者組織相容性抗原不同）

需組織配型、選擇供者（骨髓庫）；抑制受者的免疫應(yīng)答、誘導(dǎo)免疫耐受。

神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞治療如帕金森氏病細(xì)胞治療胚胎干細(xì)胞細(xì)胞移植神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞移植

1、干細(xì)胞直接移植

2、誘導(dǎo)分化成相應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞（多巴胺能神經(jīng)元）后進(jìn)行細(xì)胞移植

心肌疾病的細(xì)胞治療如心肌梗塞的細(xì)胞治療

胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞細(xì)胞移植成體干細(xì)胞（骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、心肌干細(xì)胞等）誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞細(xì)胞移植干細(xì)胞治療中的難點(diǎn)異體移植的免疫排斥反應(yīng)解決途徑：自身體細(xì)胞核移植（治療性克?。└杉?xì)胞基因改造采用自身干細(xì)胞成瘤性的危險胚胎干細(xì)胞植入動物體內(nèi)會形成畸胎瘤，如何防止干細(xì)胞移植后可能因分化不徹底形成腫瘤，是必須解決的問題。解決途徑：完善定向誘導(dǎo)分化方法改進(jìn)篩選純化技術(shù)治療性克隆

（體細(xì)胞核移植）

我們實(shí)驗(yàn)室的一項(xiàng)工作胰腺干細(xì)胞的β細(xì)胞分化與I型糖尿病的干細(xì)胞治療

I型糖尿病的治療外源胰島素治療胰腺或胰島移植干細(xì)胞治療：

胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成β細(xì)胞細(xì)胞移植基因?qū)胧蛊浔磉_(dá)胰島素細(xì)胞移植胰腺干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成β細(xì)胞細(xì)胞移植胰腺干細(xì)胞的標(biāo)志

1990年，Lendahl等人發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞中存在一種新的中間絲蛋白—巢蛋白（nestin），現(xiàn)在nestin已是公認(rèn)的神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志之一。

2000年，Hunziker和Stein發(fā)現(xiàn)胰腺導(dǎo)管和胰島中也存在nestin陽性細(xì)胞。

2001年，Zulewski等人從胰腺中分離到nestin陽性細(xì)胞，將其命名為NIPs（nestin-positiveislet-derivedprogenitorcells），并發(fā)現(xiàn)具有多向分化潛能(multipotential)，在體外可自發(fā)形成類胰島細(xì)胞團(tuán)（islet-likecellclusters,ICCs）.

因此，人們相信nestin可能也是胰腺干細(xì)胞的標(biāo)志。但是，NIPs是否確實(shí)是胰腺干細(xì)胞，能否用于細(xì)胞治療必須進(jìn)一步證實(shí)。2001年起，我們?yōu)榇俗隽艘稽c(diǎn)實(shí)驗(yàn)。

我們的實(shí)驗(yàn):人胎胰腺

nestin陽性細(xì)胞的分離、體外培養(yǎng)和生物學(xué)特性檢測（目的是確認(rèn)NIPs是胰腺干細(xì)胞）；體外誘導(dǎo)分化NIPs形成能產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞；類胰島細(xì)胞團(tuán)(ICCs)異種體內(nèi)移植—糖尿病的干細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)研究。

第一個實(shí)驗(yàn)：人胎胰腺nestin陽性細(xì)胞(NIPs)的分離、體外培養(yǎng)和生物學(xué)特性檢測人胎胰腺的nestin陽性細(xì)胞的分布

免疫組化技術(shù)顯示nestin陽性細(xì)胞

nestin陽性細(xì)胞位于胰腺小導(dǎo)管壁及其相連的原始細(xì)胞團(tuán)分離胎胰導(dǎo)管和細(xì)胞團(tuán)

在EHAA培養(yǎng)液（含2%FBS）中進(jìn)行原代培養(yǎng)

在EHAA培養(yǎng)液中的胎胰導(dǎo)管和細(xì)胞團(tuán)

培養(yǎng)48小時后細(xì)胞貼壁并開始鋪開CK19

insulinnestin貼壁細(xì)胞鑒別：是否存在NIPs

免疫熒光染色檢測CK19、胰島素、nestin陽性細(xì)胞

呈CK19陽性的胰腺上皮細(xì)胞（細(xì)胞較大)

呈胰島素陽性的

β細(xì)胞（細(xì)胞較?。?/p>

nestin陽性細(xì)胞(NIPs)（梭形）

NIPs的篩選培養(yǎng)和體外擴(kuò)增

貼壁細(xì)胞在無糖低血清條件培養(yǎng)液中篩選培養(yǎng)NIPs

4周后大部分細(xì)胞死亡、僅存少量梭形細(xì)胞(NIPs)

DMEM/F12培養(yǎng)液中加生長因子bFGF促進(jìn)梭形細(xì)胞(NIPs)體外擴(kuò)增。亞克隆純化、傳代培養(yǎng)圖為由單個梭形細(xì)胞(NIPs)形成的細(xì)胞集落梭形細(xì)胞(NIPs)可在體外長期傳代培養(yǎng)

NIPs的干細(xì)胞表型確定

免疫組化在蛋白質(zhì)水平檢測nestin表達(dá)

半定量RT-PCR在mRNA水平檢測nestin和干細(xì)胞標(biāo)志基因ABCG2表達(dá)

nestin

semiquantitativeRT-PCR篩選培養(yǎng)的梭形細(xì)胞(NIPs)集落免疫組化顯示篩選培養(yǎng)的細(xì)胞均呈nestin陽性反應(yīng)半定量RT-PCR顯示篩選培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)nestin和ABCG2nestin

NIPs達(dá)到80%鋪滿時可自發(fā)形成小的ICCsNIPs能自發(fā)形成類胰島細(xì)胞團(tuán)(ICCs).NIPs在DMEM培養(yǎng)液(含11.1mM葡萄糖、10%FBS和20ng/mlbFGF)中培養(yǎng)免疫組化顯示這種ICCs主要由nestin陽性細(xì)胞組成RT-PCR顯示這種ICCs高水平表達(dá)ABCG2和nestin

RT-PCRanalysis

培養(yǎng)2周后形成的ICCs大而致密glucagon

NIPs具有多向分化潛能培養(yǎng)液中撤去bFGF使NIPs分化RT-PCRanalysis免疫組化顯示此時ICCs表達(dá)glucagonRT-PCR顯示此時ICCs有多種譜系基因的表達(dá)，具有向胰腺多種類型細(xì)胞分化的能力這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：NIPs表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志ABCG2，能長期培養(yǎng)，有多向分化潛能，在細(xì)胞形態(tài)、生長行為和分化潛能上具有干細(xì)胞特征，因此可以認(rèn)為是胰腺干細(xì)胞.

ABCG2是ABC運(yùn)輸?shù)鞍祝ˋTPbindingcassettetransporter）家族成員，其功能是將細(xì)胞內(nèi)的促分化因子泵出細(xì)胞以維持干細(xì)胞的未分化狀態(tài)，現(xiàn)在認(rèn)為它是干細(xì)胞狀態(tài)決定因子。已有報(bào)道ES細(xì)胞、造血干細(xì)胞、骨髓間質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、肌干細(xì)胞等均表達(dá)ABCG2。第二個實(shí)驗(yàn)：

體外誘導(dǎo)分化NIPs形成產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞；

培養(yǎng)10天后形成很多大而致密的ICCsinsulin誘導(dǎo)NIPs形成β細(xì)胞

NIPs在含高濃度葡萄糖(16.5mM)和多種誘導(dǎo)因子(IGF,HGF,betacellulinandnicotinamide)的DMEM

培養(yǎng)液中培養(yǎng)

RT-PCRanalysis免疫組化顯示ICCs中有胰島素陽性的β

細(xì)胞此時ICCs表達(dá)β

細(xì)胞的標(biāo)志，但仍少量表達(dá)NIPs和其他細(xì)胞的標(biāo)志ICCs的細(xì)胞內(nèi)胰島素含量

磁性分離酶聯(lián)免疫方法測定ICCs的細(xì)胞內(nèi)胰島素含量β細(xì)胞誘導(dǎo)分化后的ICCs(ICC3)細(xì)胞內(nèi)胰島素含量明顯高于多向分化的ICCs(ICC2)，但仍低于胎胰胰島(islet)的胰島素含量

insulinsecretioninresponsetoglucose

葡萄糖或促分泌素對ICCs分泌胰島素的作用

磁性分離酶聯(lián)免疫方法測定ICCs分泌胰島素量

T:tolbutamideC:carbacholG:GLP-1

insulinsecretioninresponsetosecretagogues在不同濃度葡萄糖刺激下ICCs中β細(xì)胞胰島素分泌量與萄葡糖濃度呈正相關(guān)各種分泌刺激因子刺激ICCs釋放胰島素。T--甲苯磺丁脲C--碳酰膽堿G--胰高血糖素樣肽

這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：NIPs具有多向分化潛能，在一定條件下能定向分化為功能性β細(xì)胞.

尚待解決的問題：

1、誘導(dǎo)分化不徹底，在產(chǎn)生β細(xì)胞同時，還存在其他類型細(xì)胞；

2、體外分泌胰島素水平遠(yuǎn)低于正常胰島。

第三個實(shí)驗(yàn)：

類胰島細(xì)胞團(tuán)(ICCs)異種體內(nèi)移植—

糖尿病的干細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)研究。

（將定向誘導(dǎo)人NIPs形成含β細(xì)胞的ICCs

移植到嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺失小鼠體內(nèi)）糖尿病小鼠模型制作(腹腔注射鏈脲佐菌素STZ)

腎膜下移植ICCs治療糖尿病NOD-Scid小鼠腹腔內(nèi)注射streptozotocin腎膜下移植含類β細(xì)胞的ICCs高血糖

注射STZ前注射STZ后

移植ICCS后

302010

血糖水平(mmol/l)

注射后3天小鼠出現(xiàn)穩(wěn)定的高血糖癥

移植4天后小鼠血糖明顯下降

insulin糖尿病小鼠腎膜下移植