分子生物學技術(shù)第五章 核酸擴增技術(shù)

2022/11/61核酸擴增技術(shù)分子生物學技術(shù)?第五章2022/11/62主要內(nèi)容第一節(jié)聚合酶鏈反應技術(shù)第二節(jié)熒光定量PCR技術(shù)第三節(jié)其他核酸擴增技術(shù)第四節(jié)臨床基因擴增檢驗實驗室的管理與質(zhì)量控制2022/11/63

聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction，PCR）技術(shù)是生物技術(shù)領(lǐng)域中最重要的四項生物技術(shù)（即細胞融合技術(shù)、分子克隆術(shù)、蛋白工程技術(shù)和基因擴增技術(shù)）之一。由于通過體外（試管內(nèi)）擴增，可以將目的基因（或靶基因）片段百萬倍的放大，從而達到極大地提高核酸分子檢測的靈敏度，理論上其檢測的靈敏度可以達到一個細胞、甚至一個分子的水平。

第一節(jié)聚合酶鏈反應技術(shù)2022/11/64一、聚合酶鏈反應技術(shù)原理Watson、Crick：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)Meselson、Stahl:半保留復制模型。Khorana：最早提出體外擴增核酸的設(shè)想Kary.B.Mullis：發(fā)明聚合酶鏈反應Saiki：發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合酶（一）PCR技術(shù)發(fā)展簡史2022/11/65KaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。他原本是要合成DNA引物來進行測序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。1983年春夏之交的一個晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用兩個引物（而不是一個引物）去擴增模板DNA的想法…...很少有在公司工作的科研人員得

諾貝爾獎，Mullis是其中之一2022/11/66KaryB.Mullis（1944－）2022/11/67Mullis開車的時候,瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對面開來的車象是DNA聚合酶，面對面地合成著DNA，……2022/11/68引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段1983年2022/11/6994℃55℃37℃2022/11/61094℃變性50-65℃退火XX℃延伸2022/11/611Mullis的第一個PCR實驗1983年9月中旬。Mullis在反應體系中加入DNA聚合酶后在37℃一直保溫。結(jié)果第二天在瓊脂糖電泳上沒有看到任何條帶。于是他認識到有必要用加熱來解鏈，每次解鏈后再加入DNA聚合酶進行反應，依次循環(huán)。1983年12月，他終于看到了被同位素標記的PCR條帶。2022/11/612PCR不只是一個方法改進Mullis的上司有句“名言”，“我們要擴增這么多DNA樣品有什么用”；到了1991，Cetus公司以3億美元的轉(zhuǎn)讓費將PCR相關(guān)專利轉(zhuǎn)讓給瑞士HoffmanLaRoche公司，并在此后的經(jīng)營中又獲得了數(shù)億美元的分紅；Mullis于1993年獲得諾貝爾化學獎，PCR和DNA重組技術(shù)一樣意義深遠。2022/11/613生物學領(lǐng)域幾乎無處不用基因、DNA片段的克隆人工基因構(gòu)建DNA序列測定基因定點突變基因型（突變）檢測，SNP分析，遺傳背景分析生物物種鑒定，系統(tǒng)進化研究基因表達量研究（real-timePCR）/基因表達譜研究（DNAchip,SAGE）2022/11/614PCR儀器的變遷三個水浴鍋，用手移動（Mullis等人當時用的）電加熱塊＋自來水冷卻（PE，1988）電加熱塊＋內(nèi)置循環(huán)液冷卻（PE，1989）三個加熱塊＋機械手（Stratagene，1994）半導體制冷和加熱（MJ,PE,BioMetra,Eppendrof）溫度梯度,熒光檢測(如Roche的Lightcycler)風加熱Lab-on-chip式的PCR儀(所謂的芯片PCR)中國的狀況1991年出現(xiàn)三個水浴鍋+機械手的原始PCR儀（華美，復日等）現(xiàn)在以半導體（Peltier板）制冷式為主（杭州博日,上海天呈,廈門安普利等）2022/11/615PCR技術(shù)實際上是模擬體內(nèi)DNA半保留復制過程，在模板DNA、引物和四種dNTP存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應，由變性——退火——延伸三個基本反應步驟構(gòu)成。

（二）PCR技術(shù)基本原理2022/11/616PCR循環(huán)–

第一步–加熱變性2022/11/617PCR循環(huán)-

第二步–引物與模板DNA分子退火Primer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’2022/11/618PCR循環(huán)-

第三步-引物延伸Primer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase2022/11/619第1個PCR循環(huán)完成后

－－得到兩個拷貝的靶序列2022/11/62030次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量循環(huán)數(shù)擴增產(chǎn)物量（2n）1 21＝22 22＝43 23＝84 24＝165 25＝326 26＝6420 220＝1,048,57630 230＝1,073,741,8242022/11/621模板DNA94℃變性55℃退火72℃引物延伸第二次循環(huán)模板變性退火延伸經(jīng)25-30次循環(huán)，目的DNA增加106-7PCR原理示意圖2022/11/6221234522557294時間（min）溫度（℃）PCR的基本原理適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍2022/11/623PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA94℃2022/11/624PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃55℃引物1引物2DNA引物2022/11/625PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點55℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶2022/11/626PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結(jié)束94℃第2輪開始2022/11/627PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點94℃55℃72℃TaqTaqTaqTaq2022/11/628PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結(jié)束2022/11/629PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增2022/11/630在下一輪循環(huán)中，DNA雙鏈再經(jīng)變性、退火、延伸三步,模板DNA數(shù)量翻一倍(假設(shè)擴增效率為100%)。如此反復循環(huán)，便可使DNA以指數(shù)形式進行擴增。每完成一個循環(huán)需2～4min，2～3h就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。2022/11/631nyny圖6-2-1

圖6-2-2PCR擴增效率圖（三）PCR反應動力學

到達平臺期（plateau）所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)。2022/11/632反應組成（五要素）：模板（template）引物（primer）DNA聚合酶（DNApolymerase）dNTPPCRbuffer

二、PCR反應體系及其優(yōu)化（一）PCR反應動體系2022/11/6331.模板（template）DNA

RNA：總RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA基因組DNA質(zhì)粒DNA模板就是待擴增的目的基因或其特異片段（靶序列）2022/11/634預擴增核酸片段兩端的已知序列，決定特異。偏高：非特異產(chǎn)物擴增及錯配，增加引物之間形成引物二聚體，產(chǎn)量降低。偏低：產(chǎn)量降低。量：0.1-0.5umol/L2.引物（primers)引物（primers）是人工合成的一對可以分別與兩條模板DNA互補結(jié)合的寡核苷酸序列2022/11/635引物設(shè)計要求：引物長度分布的均衡性引物二聚體及二級結(jié)構(gòu)引物3’端、5’端的特異性引物的內(nèi)部穩(wěn)定性引物的特異性擴增區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)2022/11/636引物的長度：15～30核苷酸，引物過短會影響PCR反應的特異性，引物過長會提高相應的退火溫度，增加退火難度。引物的均衡性：引物中堿基組成應盡可能隨機分布，避免出現(xiàn)嘌呤或嘧啶堿基堆積現(xiàn)象，兩條引物應該有匹配的GC含量，G﹢C含量一般40%~60%。引物的二級結(jié)構(gòu)：應避免由于引物分子之間存在較多的互補堿基而形成引物二聚體。

引物設(shè)計原則2022/11/637引物的末端：引物的延伸從3′端開始，因此3′端的幾個堿基與模板DNA均需嚴格配對，不能進行任何修飾，否則不能進行有效的延伸。引物的5′末端堿基無嚴格限制，5′末端可以被修飾。

引物的特異性：引物與非目的基因序列的同源性不超過70%，3′末端不要有連續(xù)8個堿基與非目的基因序列同源。

2022/11/638量：0.5-5u/100ul

偏高：引物非特異產(chǎn)物的擴增偏低：產(chǎn)物量降低特性：(耐高熱)熱穩(wěn)定性:92.5℃、95℃、97.5℃時，半衰期分別為130min、40min、5-6min延伸效率:75-80℃時，150個核苷酸/s校正功能:TaqDNA聚合酶沒有3’-5’外切酶活性，

Vent、pfu等具有3’-5’外切酶活性3.DNA聚合酶(DNApolymerase)2022/11/639

dNTP：包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP。量：50-200umol/L過高：加快反應速度，還可增加堿基的錯誤摻入率和室驗成本。過低：反應速度下降，可提高實驗的精確性

dNTP會絡(luò)合Mg2+，當PCR需要較高濃度的dNTP時，應在反應體系中適當增加Mg2+濃度。。4.dNTP2022/11/640一般組成：50mMKCl,10-50mMTris-Cl(室溫pH8.3)，1.5mMMgCl2

KCl促進引物退火，濃度過高抑制TaqDNA聚合酶的活性。Tris緩沖液調(diào)節(jié)pH，使反應體系偏堿性，發(fā)揮TaqDNA聚合酶活性。Mg2+濃度：影響TaqDNA聚合酶活性Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應產(chǎn)物減少。

PCR促進劑：牛血清白蛋白、明膠、非離子去污劑（如Tween20，濃度0.05%）二甲亞砜（DMSO）5.PCR緩沖液（PCRbuffer）2022/11/64150ulPCR反應體系的組成①樣品DNA0.1～1ug；②正鏈引物（25umol/L）1.0ul；③負鏈引物（25umol/L）1.0ul；④脫氧核苷三磷酸（dNTP各2.5mmol/L）4.0ul；⑤10×PCR緩沖液5.0ul；⑥MgCl2（25mmol/L）3.0ul；⑦TaqDNA聚合酶1～2.5u；⑧蒸餾的去離子水補至50ul。對照：陽性對照、空白對照分別以陽性模板DNA、蒸餾的去離子水取代樣品DNA。6.PCR一般方案2022/11/642PCR儀工作參數(shù)的設(shè)置

94℃30～60sec，

55℃30～60sec，

72℃30～60sec，循環(huán)30次，最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物的保存與檢測

PCR產(chǎn)物于4℃保存，PCR產(chǎn)物檢測。2022/11/643模板引物緩沖液Mg2+三磷酸脫氧核苷酸耐熱DNA聚合酶溫度循環(huán)參數(shù)變性、復性、延伸的溫度與時間循環(huán)數(shù)和擴增效率：循環(huán)數(shù)決定著擴增程度。（二）PCR反應體系的優(yōu)化2022/11/644起始模板數(shù)量與足量產(chǎn)物的熱循環(huán)次數(shù)起始模板DNA分子數(shù)循環(huán)次數(shù)5040-451.0×10335-401.5×10430-353.0×105

25-302022/11/645剃度PCR（TDPCR

Touch-downPCR）

根據(jù)引物Tm值，選定一個退火溫度范圍（跨越10~20℃的溫度范圍，引物Tm值在這個范圍之內(nèi)）。在設(shè)置循環(huán)參數(shù)時，讓退火溫度從選定范圍的最高溫度開始，逐步降低退火溫度（每次降低1~5℃），最后結(jié)束在選定范圍的最低溫度。在每一個退火溫度上循環(huán)2~5次。熱啟動PCR（hotstartPCR）由于TaqDNA聚合酶在低溫時仍有一定的聚合酶活性，第一輪PCR反應前的升溫過程中會出現(xiàn)非特異產(chǎn)物，而降低了PCR反應的特異性?？梢酝ㄟ^所謂的“熱啟動”方式克服這一問題。兩種優(yōu)化參數(shù)的PCR技術(shù)2022/11/646(一)

凝膠電泳

1．瓊脂糖凝膠電泳法瓊脂糖凝膠電操作方法簡單，能對PCR產(chǎn)物的長度進行粗略的鑒定，是應用最廣泛的檢測PCR產(chǎn)物的方法。在電泳過程中，凝膠中的溴化乙錠(EB)嵌入DNA分子中，在紫外線照射下，EB-DNA復合物發(fā)出橙紅色熒光。該法缺點是不能鑒定PCR產(chǎn)物的序列，而且存在溴乙錠污染。

三、擴增產(chǎn)物的檢測與分析PCR產(chǎn)物是否為目的基因的擴增產(chǎn)物，還是非特異擴增？2022/11/647

瓊脂糖濃度與分離線狀DNA的有效范圍瓊脂糖含量(%)分離線狀DNA的有效范圍(kb)

0.51-300.70.8-121.00.5-101.20.4-71.50.2-32.00.1-22022/11/6482．聚丙烯酰胺凝膠電泳法特點：分辨力高，長度僅相差1bp的DNA分子即可分開；上樣量遠大于瓊脂糖凝膠；回收的DNA純度高；采用銀染色DNA或RNA，靈敏度高，比瓊脂糖凝膠電泳中EB染色法高2-5倍，且避免EB易退色的弱點。用途：PCR擴增指紋圖、多重PCR、PCR產(chǎn)物限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）分析。2022/11/649

丙烯酰胺濃度與分離DNA分子的有效范圍丙烯酰胺(%)

有效分離范圍(bp)溴酚藍位置(bp)二甲苯藍位置(bp)3.51000-20001004605.080-500652608.060-4004510012.040-200207015.025-150156020.05-10012452022/11/650不同的限制性核酸內(nèi)切酶具有特異的DNA識別序列，突變堿基的出現(xiàn)有可能會改變限制酶的識別位點，使切點增多或減少，導致酶切片段的數(shù)量或大小發(fā)生改變。

PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析（polymerasechainreactionbasedonrestrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP）（二）PCR產(chǎn)物的酶切分析2022/11/651PCR-RFLP法：

惡性腫瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因限制性內(nèi)切酶突變限制性內(nèi)切酶2022/11/6521．點雜交（dotblot）2．反向點雜交（reversedotblot）3．微孔板雜交（microplatehybridization）4．PCR-EIA：（RNAprobehybridizationenzymeimmunoassay,RPEIA）5．Southern印跡雜交（Southernblot）（三）核酸探針雜交分析2022/11/6531．假陽性①PCR產(chǎn)物是最主要的污染源。②含有靶DNA序列的質(zhì)粒的污染。③陽性對照的污染。④標本之間的交叉污染。⑤在采集標本時，其他污染源帶來的污染。⑥Taq聚合酶中帶有細菌DNA，當PCR擴增片段為保守的rRNA序列時，易造成假陽性。四、常見問題原因分析與處理2022/11/6542．假陰性(1)標本處理的原因①處理標本時，靶DNA丟失。②處理標本時，雜質(zhì)成分沒有去除干凈，帶入PCR反應中抑制了Taq酶活性。③標本放置不當，模板發(fā)生降解（尤其是RNA）。2022/11/655(2)PCR試劑問題

①TaqDNA聚合酶失活。②Mg2+濃度過低或是沒有加。(3)PCR擴增過程中的問題①PCR擴增儀故障。②PCR擴增反應液沒有加液體石蠟油。(4)PCR產(chǎn)物鑒定中的問題①電泳時沒有加溴化乙錠。②電泳緩沖液和凝膠使用次數(shù)過多。③凝膠濃度過低，使擴增帶跑散。2022/11/6563．引物二聚體⑴兩個相同的或不同的引物分子之間有較多的堿基配對，特別是引物3′端有互補區(qū)。⑵引物模板比例太高，可增加模板用量。⑶退火溫度過低。⑷熱循環(huán)次數(shù)過多。2022/11/6574．非特異性PCR產(chǎn)物造成非特異性PCR產(chǎn)物的常見原因提高PCR反應特異性的辦法

5．PCR污染及預防措施標本、操作人員、實驗室的一切試劑、器材及儀器

6．RNA酶的污染與預防（RT-PCR）（1）去除外源RNase污染（2）抑制內(nèi)源性RNase的活性2022/11/658巢式PCR（nestedPCR）

逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）

多重PCR（multiplexPCR）重組PCR（recombinantPCR）

錨定PCR（anchoredPCR,A-PCR）不對稱PCR（asymmetricPCR）反向PCR（inversePCR）免疫PCR(immuno-PCR)原位PCR(insituPCR)定量PCR

五、PCR衍生技術(shù)2022/11/659巢式PCR外引物1外引物2內(nèi)引物1內(nèi)引物2第一次PCR第二次PCR2022/11/660逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴增2022/11/661用于檢測特定基因序列的存在或缺失。電泳引物多重PCRPCR產(chǎn)物2022/11/662引物a引物c引物b引物d5'3'PCR混合，變性和復性延伸異源部分雙鏈DNA形成5'5'5'5’5'3'3'3'3'3'3'3'3'3'3'3'5'5'5'5'5'5'PCR引物a引物d

再次PCR5'5'3'3'重組PCR2022/11/663Ag＋Ab生物素化的DNAAg-Ab復合物DNA-連接分子復合物連接分子檢測PCR＋Ag-Ab-連接分子-DNA-復合物免疫PCR2022/11/664原位PCR（insituPCR）原位PCR技術(shù)是PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物?；具^程是，先用合適的固定劑（通常為甲醛固定劑如中性甲醛）對組織或細胞進行固定，然后用蛋白酶對細胞進行通透處理，以確保PCR試劑進入細胞并同靶序列接觸，最后對DNA和RNA進行細胞內(nèi)原位擴增。然后進行產(chǎn)物分析并用顯微鏡觀察結(jié)果。2022/11/665定量PCR（QuantitivePolymeraseChainReaction，QPCR）廣義概念上的定量PCR是指通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測，對PCR起始模板進行定量的技術(shù)。指數(shù)擴增期2022/11/666第二節(jié)熒光定量PCR技術(shù)2022/11/667實時熒光定量PCR定義

在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法2022/11/668常規(guī)PCR技術(shù)：對PCR擴增反應的終點產(chǎn)物進行定量和定性分析無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時檢測實時定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析2022/11/6692022/11/670定量原理介紹三個概念：擴增曲線、熒光閾值、Ct值如何對起始模板定量？通過Ct值和標準曲線對起始模板進行定量分析2022/11/671擴增曲線擴增曲線圖：橫坐標：擴增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標：熒光強度每個循環(huán)進行一次熒光信號的收集熒光基團熒光檢測元件2022/11/6722022/11/673熒光信號閾值（threshold）：

前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍真正的信號:熒光信號超過域值熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是基線（背景）熒光信號的標準偏差的10倍。2022/11/674Ct值的定義：PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)C(t)value2022/11/675實時熒光定量PCR原理---------標準曲線

模板DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小

Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量2022/11/676確定未知樣品的C(t)值通過標準曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量Sample實時熒光定量PCR原理絕對定量252022/11/677熒光定量PCR（FQ-PCR）基于熒光能量傳遞技術(shù)（FluorescenceresonanceenergytransferFRET）,通過受體發(fā)色團之間偶極-偶極相互作用,能量從供體發(fā)色團轉(zhuǎn)移到受體發(fā)色團,轉(zhuǎn)移效率與兩個發(fā)色團之間距離的6次冪倒數(shù)成比例，受體熒光染料發(fā)射出的熒光訊號強度與DNA產(chǎn)量成正比，檢測PCR過程的熒光訊號便可得知靶序列初始濃度。在PCR反應體系中，F(xiàn)Q-PCR的熒光標記物可分為兩種：熒光染料標記和熒光探針標記。2022/11/678一、熒光染料法SYBR熒光染料能特異性地摻入DNA雙鏈，發(fā)出熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)出任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。此方法未使用目的特異性探針，其特異性完全由引物決定。在有非特異雙鏈DNA產(chǎn)生時，其熒光也同樣增強，此法與常規(guī)PCR的特異性差別不大。2022/11/679SYBRGreen能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光變性時，DNA雙鏈分開，無熒光復性和延伸時，形成雙鏈DNA，SYBRGreen發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。SYBRGreen2022/11/680圖6-10SYBR-GreenI熒光染料原理示意圖5’3’激發(fā)5’3’SG發(fā)射SGSGSGSG5’3’5’3’激發(fā)SGSGSG發(fā)射SGSG不摻入雙鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)出任何熒光信號SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈,發(fā)出熒光信號2022/11/681SYBRGreen法優(yōu)缺點

對DNA模板沒有選擇性

----適用于任何DNA

使用方便

---不必設(shè)計復雜探針非常靈敏便宜優(yōu)點

容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性,但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應條件對引物特異性要求較高缺點2022/11/6821．Taqman技術(shù)

二、熒光探針法與目標序列互補5′端標記有報告基團(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher,Q)

探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針2022/11/683TaqMan技術(shù)原理示意圖3’端的熒光Q分子吸收5’端熒光R分子的熒光信號

探針5’端連接的熒光R分子被Taq酶切割下來

熒光R分子發(fā)出熒光,切割的熒光分子數(shù)與PCR數(shù)量成比例5’3’5’3’QRQ5’3’R5’3’激發(fā)5’3’5’3’激發(fā)RQ引物Taq酶2022/11/684TaqMan法優(yōu)缺點

對目標序列的高特異性

----陰性結(jié)果確定設(shè)計相對簡單

---與目標序列某一區(qū)域互補重復性比較好優(yōu)點

只適合一個特定的目標委托公司標記，價格較高不易找到本底低的探針缺點2022/11/685在Taqman探針的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)了一系列的技術(shù)進展。雙探針技術(shù)的特點是將熒光分子和淬滅分子分別標記在兩個不同的探針上，產(chǎn)生發(fā)光探針和淬滅探針。雜交時兩探針的熒光分子和淬滅分子緊密相鄰，從而發(fā)生FRET使熒光淬滅。熒光淬滅的程度與起始模板的量成正比，以此可進行PCR定量分析。最近廣泛應用的另外一個新技術(shù)就是TaqMan-小溝結(jié)合物（minorgroovebinder，MGB）探針。

Taqman技術(shù)的延伸2022/11/686雙探針技術(shù)原理示意圖熒光淬滅的程度與起始模板數(shù)的量成正比RQXQ淬滅探針R發(fā)光探針2022/11/687TaqMan-MGB探針示意圖MGB:MinorGrooveBinder(Tmenhancer)MGBQRMGB探針的3‘端采用了非熒光性的淬滅基因——淬滅基團吸收報告基團的能量后并不發(fā)光，大大降低了本底信號的干擾。MGB探針的3‘端還連接了一個二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽，可以大大穩(wěn)定探針與模板的雜交，升高探針Tm值，使較短的探針同樣能達到較高的Tm值——而短探針的熒光報告基團和淬滅基團的距離更近，淬滅效果更好，熒光背景更低。2022/11/688亦稱分子燈塔法，是一段熒光標記的單鏈寡核苷酸探針，其鏈由兩部分組成，一部分是能與靶基因堿基序列互補的寡核苷酸序列，是檢測靶基因的部分，位于探針的中間位置，探針形成后構(gòu)成探針的環(huán)部，另一部分是分別在5′和3′端的熒光標記物質(zhì)和熒光淬滅劑。5′和3′端有幾個互補的堿基存在，因而可形成兩端反轉(zhuǎn)配對，構(gòu)成探針的莖部。在游離狀態(tài)下，分子燈塔形成莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu),使熒光劑和淬滅劑緊密接觸，導致熒光淬滅，此時莖環(huán)結(jié)構(gòu)的分子燈塔發(fā)出的熒光檢測不到。2．Molecularbeacon技術(shù)2022/11/689RQX激發(fā)RQQR激發(fā)發(fā)射分子燈塔形成莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu),使熒光劑和淬滅劑緊密接觸,導致熒光淬滅單鏈寡核苷酸探針由于與靶基因堿基序列互補而與之雜交探針5’和3’端分離,淬滅劑對熒光劑的淬滅作用消失,產(chǎn)生熒光Molecularbeacon技術(shù)原理示意圖2022/11/690該法的基本原理是首先合成兩個探針，一是熒光探針（25bp），5′端接一熒光分子，另一為淬滅探針（15bp），3′端接一淬滅分子，淬滅探針能與熒光探針5′端雜交。當兩探針結(jié)合時，熒光探針發(fā)出的熒光被淬滅探針吸收，溶液中沒有熒光產(chǎn)生，但兩探針分離時，熒光探針發(fā)出的熒光不再被淬滅探針吸收，溶液中即可檢測到熒光。當PCR擴增時溶液中無模板時，兩種探針特異性結(jié)合，溶液中無熒光產(chǎn)生；當溶液中有模板時，在較高溫度下熒光探針優(yōu)先與模板結(jié)合，從而使兩探針分離產(chǎn)生熒光，熒光強度與溶液中模板數(shù)量成正比，因此，可進行PCR定量。3．復合探針法2022/11/691Q淬滅

XQ淬滅探針R發(fā)光探針RR復合探針法原理示意圖2022/11/692四、FQ-PCR的應用前景三、FQ-PCR測定的數(shù)據(jù)處理2022/11/693第三節(jié)、其他核酸擴增技術(shù)（一）核酸序列依賴性擴增（nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA）核酸序列依賴性擴增，又稱自主序列復制（self-sustainedsequencereplication，SSR），主要用于RNA的擴增、檢測及測序。反應體系包括：逆轉(zhuǎn)錄酶、核酸酶H（RNaseH）、T7RNA聚