何首烏苯甲酮合成酶基因的克隆及序列分析

何首烏苯甲酮合成酶基因的克隆及序列分(作者：單位： 郵編:【摘要】目的克隆何首烏苯甲酮合成酶基因并作序列分析。方法以何首烏PolygonummultiflorumThunb.為材料，根據其它植物苯甲酮合成酶但enzalacetonesynthase,BAS)基因cDNA序列的保守區(qū)域設計引物，利用RTPCR和3CRACE,克隆其基因。結果從何首烏葉cDNA中克隆出了長度為1049bp的基因片段。序列分析表明該片段具有典型的CHS基因家族的結構域，為何首烏的BAS基因片段，命名為PmBASo將得到的序列提交GenBank,序列號為FJ601686。對獲得的PmBAS的氨基酸序列進行比較分析，發(fā)現PmBAS不含有Phe215,這種差異可能是CHS與BAS催化不同反應的重要原因之一。何首烏BAS與其它植物CHS的氨基酸序列的進化分析表明，其與同為蓼科的虎杖和掌葉大黃的同源性較近。結論對利用基因工程技術促進何首烏蕙醍合成具有重要意義?！娟P鍵詞】何首烏；苯甲酮合成酶；基因克??；序列比較蕙酉(Anthraquinone)是一類重要的中草藥活性成分，常見于何首烏、決

明、大黃、虎杖、蘆薈和茜草等植物中，具有抗菌、瀉下、利尿、抗氧化和過氧化作用、抗誘變和保肝等多種功效口，2］oDewick等］3]與VELI［EK明、大黃、虎杖、蘆薈和茜草等植物中，具有抗菌、瀉下、利尿、抗氧化和過氧化作用、抗誘變和保肝等多種功效口，2］oDewick等］3]與VELI［EK等［4］認為，蕙醍的合成大致分為3個階段:①以乙酰輔酶A為起始單元，連續(xù)與8個丙二酸單酰輔酶A發(fā)生縮入8個二碳單位，最后生成蕙醍的基本骨架八酮化合物；合，引②八酮化合物經過還原、脫竣及氧化等步驟，形成大黃酚、蘆薈大黃素與大黃酸等蕙醍類化合物：③八酮化合物經過水解、脫竣、脫水與甲基化等步驟，形成大黃素與大黃素甲醛等蕙醍類化合物(見圖1)。在第1階段中，催化乙酰輔酶A與丙二酸單酰輔酶A縮合的反應是由植物查爾酮合成酶系催化完成的。查爾酮合成酶系屬于植物皿型聚酮合成酶的一個家族，包括了查爾酮合成酶(Chaiconesynthase,CHS)、英合成酶(Stilbenesynthase,STS)、毗喃酮合成酶(2［pyronesynthase,2PS)、苯甲酮合成酶(BAS)、^Y唳酮合成酶(Acridonesynthase,ACS)和蘆薈松合成酶(Aloesonesynthase,ALS)等成員，它們的氨基酸序列相似性達60%70%:5,6］。近幾年來，一系列功能不同的查爾酮合成酶系不斷從蓼科植物中被克隆和鑒定。如Abe等］5］從蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumLinru中克隆得到CHS與BAS°CHS能催化3分子的丙二酸單酰輔酶A和1分子對香豆酰［輔酶A結合形成查爾酮。BAS能催化1分子pcoumaroyl_輔酶A與1分子的丙二酸單酰輔酶A,縮合生成具有抗炎作用的苯乙烯基丙酮。Junghanns等］7］也從掌葉大黃中克隆得到ALS,能夠催化6夠催化6分子的乙酰輔酶A,形成蘆薈松。!1!Samappito［8］等也從園葉大黃Rheumtataricum中克隆得到STS。彳可首烏PolygonummultiflorumThunb.,蓼科(Polygonaceae)傳統(tǒng)中藥，具有補肝腎、益精血、烏須發(fā)、生發(fā)、強筋骨之功效，主要含蕙醍、二苯乙烯昔類化合物和卵磷脂等活性成分］1,2］o我們以何首烏為材料，采用RTPCR技術克隆其BAS1,基因，并進行序列分析。這對從分子水平上探討蕙醍的生物合成機制中具有重要的指導意義，并為下一步利用轉基因技術來提周何首烏蕙醍產量的研究奠定基礎。1材料與試劑植物材料何首烏PolygonummultiflorumThunb.采自西南交通大學峨眉校區(qū)。Taq酶、限制性內切酶、分子量Marker為Takara產品;DNA電泳凝膠回收試劑盒購自OMEGA公司；其余試劑均為上海生工生物工程公司產品。2方法21總RNA的提取剪取何首烏幼嫩的葉片，加液氮研磨成粉末，RNA的提取使用Tiangen公司的RNAplant植物總RNA提取試劑，具體步驟按說明書進行。2.2cDNA的獲得以純化的RNA為模板，以oligo(dT)18:5,GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)18'為反轉錄引物，米用AMV反轉錄酶進行反轉錄獲得cDNAo2.3引物設計與合成根據Genbank所報道的已知植物的BAS基因的cDNA序列，使用PrimerPremier5.0引物設計軟件，由上海英俊生物技術服務有限公司合成所有引物，序列如下：中間片段引物，正向引物(P1)：5GAATGGGGCCAACCC(T)AAGTC3氣反向引物(P2):5CCATAG(C)TCGTTCAACACTTG3BRACE弓|物，3P1:5TGTCCAAGACTCTTCCCGTAC3；3P2:5TATCCTGGACCATGTTGAAGC3仁2.4PCRPCR擴增采用BioRAD公司的MG96G梯度PCR儀，反應條件按引物的堿基組成進行設置。2.5克隆與測序PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳后，禾ij用OMEGA公司的膠回收試劑盒回收產物，連接到pMD18T載體，構建重組質粒。轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選重組子并用菌落 PCR檢測，送由上海英俊生物技術服務有限公司測序。U!2.6核昔酸序列分析采用lnter_ProScan進行結構域和功能位U!點預測。利用NCBI（）的BLAST在線分析工具分別對GenBank數據庫進行序列比對分析。采用DNAman軟件進行序列的多重比較及與進化樹繪制。3結果3.1電泳結果何首烏的BAS的中間片段PCR和3'RACE的擴增結果如圖2所示，中間片段引物進行PCR擴增后得到約660bp的片段（圖2”A,3'RACE擴增出約600bp的片段（圖2B）。3.2PCR產物的測序分別將PCR產物進行測序。BAS基因克隆的中間片段和3片段分別測得為659bp和595bp。根據兩個片段的測序結果，利用VectorNTISuite7軟件拼接得到何首烏的BAS基因的部分序列，命名為PmBASo而PmBAS基因長度為1049bp,其最長的ORF編碼一個由276個氨基酸殘基組成的蛋白（圖3）oInterProScan在線分析結構域和功能位點表明，PmBAS具有查爾酮合成酶基因家族的N末端和C末端序列特征（圖4），說明所獲得的基因序列屬于查爾酮合成酶基因家族，GenBank登錄號為FJ601686。3.3不同植物CHS與BAS基因的序列比較與進化分析PmBAS序列進行Blast在線序列比對，結果表明該基因的核昔酸序列與其它植物CHS家族的相似性較高，均超過74%以上。PmBAS基因的核昔酸序歹U與虎杖（Polygonumcuspidatum）、大黃（Rheumpalmatum）、楊樹(Populustrichocarpa)x白楊(Populusalba)等植物CHS家族的核昔酸一致性分別為94%,86%,76%和76%。利用DNAMAN軟件將獲得的PmBAS基因推導的氨基酸序列與其它幾種植物CHS基因家族的氨基酸序列進行多重比對，并構建進化樹?？梢钥闯?，查爾酮合成酶系被分為查爾酮合成酶與非查爾酮合成酶兩個亞家族[5],其中BAS、ALS、2PS與ACS構成非查爾酮合成酶亞家族，而絕大部分CHS[除葉牽牛CHS仲omoeapurpureaCHS)]與STS構成了查爾酮合成酶亞家族。何首烏與蓼科的虎杖(Polygonumcuspidatum)的同緣關系最近，與蓼科的掌葉大黃(Rheumpalmatum)的同緣關系也較近，而與其它植物的同緣關系較遠(圖5)。3.4PmCHS與PmBAS基因的氨基酸序列比較查爾酮合成酶系具有高度保守的催化活性中心(Cyt164]His303]Asn336)，通過調控活性中心腔內的空間大小決定了起始底物的選擇性和聚酮鏈的長度。Phe215位于活性位點口袋的入口處，調控一系列縮合反應中適合的底物和中間產物的進入，同時有利于丙二酸單酰 CoA的脫竣。PmBAS保留了催化聚酮合成的三個必需氨基酸殘基(Cyt164、His303、Asn336,虎杖查爾酮合成酶的氨基酸位置數)，推測PmBAS也能夠催化聚酮的合成。然而在PmBAS分子中，Phe215被Leu215(含有較長的氨基酸側鏈)替代，阻礙了丙二酸單酰輔酶A進入活性中心腔，導致PmBAS不能夠連續(xù)縮合丙二酸單酰輔酶A而只能催化1分子的丙二酸單酰輔酶A參與反應(圖6)o3討論通過克隆與活性成分形成關系最密切的生物合成相關基因入手，闡明中藥活性成分的生物合成及其調控機制，是植物基因工程的一個重要領域。本研究采用RACE技術克隆PmBAS的基因，這對進一步研究其功能、表達特征以及利用基因工程技術促進何首烏蕙醍合成具有重要意義。由于何首烏葉片中含較多的次生代謝物，造成 RNA的提取困難，目前我們正在進一步改進RNA提取方法，同時PmBAS的5LRACE實驗也正在進行中?！緟⒖嘉墨I】1]YiT,LeungKS,LuGH,etal.IdentificationanddeterminationofthemajorconstituentsintraditionalChinesemedicinalplantPolygonummultiflorumThunbbyHPLCcoupledwithPADandESI/MS[J[.PhytochemistryAnalysis,2007,18(3):181.[2[ChoiSG,KimJ,SungND,etal.Anthraquinones,Cdc25Bphosphataseinhibitors,isolatedfromtherootsofPolygonummultiflorumThunb[J[NaturalProductResearch,2007, 21(6):487.[3]DewickPM.MedicinalNaturalProducts[M].NewYork:Academicpress, 2002:193.:4]VELISEKJ,DAVDEKJ,CEJPEKK.Biosynthesisoffoodconstituents:Naturalpigments [J[?CzechJournalFoodScienee,2007,25(6):291.[5[Abe