植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

植物組織培養(yǎng)\實(shí)驗(yàn)報(bào)告學(xué)院:班級(jí):10姓名:李勝程植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)報(bào)告植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)報(bào)告第第PAGE9頁/9頁學(xué)號(hào):2010193023植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)報(bào)告一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握無菌操作的植物組織培養(yǎng)方法；?通過配置MS培養(yǎng)基母液，掌握母液的配置和保存方法；5.了解植物細(xì)胞通過分裂、增殖、分化、發(fā)育，最終長(zhǎng)成完整再生植株的過程，加深對(duì)植物細(xì)胞的全能性的理解。二、實(shí)驗(yàn)原理（一）植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)是把植物的器官，組織以至單個(gè)細(xì)胞，應(yīng)用無菌操作使其在人工條件下，能夠繼續(xù)生長(zhǎng)，甚至分化發(fā)育成一完整植株的過程。植物的組織在培養(yǎng)條件下，原來已經(jīng)分化停止生長(zhǎng)的細(xì)胞，又能重新分裂，形成沒有組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)，即愈傷組織。這一過程稱為“脫分化作用”，已經(jīng)“脫分化”的愈傷組織，在一定條件下，又能重新分化形成輸導(dǎo)系統(tǒng)以及根和芽等組織和器官，這一過程稱“再分化作用”。（二）植物細(xì)胞的全能性植物細(xì)胞的全能性即是每個(gè)植物的本細(xì)胞或性細(xì)胞都具有該植物的全套遺傳基因，在一定培養(yǎng)條件下每個(gè)細(xì)胞都可發(fā)育成一個(gè)與母體一樣的植株。（三）組織的分化與器官建成（四）培養(yǎng)基的組成培養(yǎng)基中各成分的比例及濃度與細(xì)胞或組織的生長(zhǎng)或分化所需要的最佳條件相近，似成功地使用該培養(yǎng)基進(jìn)行組織培養(yǎng)的主要條件。營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基一般由無機(jī)營(yíng)養(yǎng)、碳源和能源、維生素、植物激素（生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑）和包括有機(jī)氮、酸和復(fù)雜物質(zhì)的添加劑組成。三、實(shí)驗(yàn)器材高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、烘箱、培養(yǎng)室 鑷子、記號(hào)筆、橡皮筋、玻璃器皿、三角燒瓶、燒杯、量筒、剪刀、棉塞、繩子、牛皮紙、酒精燈、噴霧器等。四、實(shí)驗(yàn)材料豌豆種子五、實(shí)驗(yàn)藥品藥品、70%酒精、0.1%升汞、MS培養(yǎng)基、蒸餾水、NaOH84消毒液、蔗糖、瓊脂等。六、實(shí)驗(yàn)步驟（一）培養(yǎng)基母液的配制2MgSC?7HOFeSO?4HONa-EDTAMn37027.82MgSC?7HOFeSO?4HONa-EDTAMn37027.837.322.3CuSOP5HOCoC?6HOb肌醇甘氨酸0.0250.0251002瓊脂PH80006.0成分含量成分 含量 成分 含量NHNO1650ZnSO77H2O 8.6 鹽酸硫胺素 0.4KNO1900HBBO 6.2 鹽酸吡哆醇 0.5KHPO170KI0.83煙酸0.5CaCl?2HO440NaMln0.25蔗糖30000名稱r,曰―\微量?jī)?/p>

2.MS培養(yǎng)基所需母液以及擴(kuò)大倍數(shù)擴(kuò)大倍數(shù) 定容體積（ml） 吸取毫升/L50500205050020Ca鹽5050020Mg鹽5050020Fe鹽5050020有機(jī)10020010肌醇10020010激素 100 50 53.3.配制母液所需的藥品及稱取量（注：根據(jù)表1與表2計(jì)算各物質(zhì)的稱取量）藥品名稱稱取量（mg）藥品名稱稱取量（mgNHNO41250KI20.75KNO47500NaMnOP2HO6.25KHPO4250CuSOP5HO0.625藥品名稱稱取量(mg)藥品名稱稱取量(mgCaC?2HObMgSCP7HO110009250CoC?6HO肌醇0.6252000FeSO?4HO695甘氨酸40Na-EDTA932.5鹽酸硫胺素8MnSCP7HO557.5鹽酸吡哆醇10ZnSO77HO215煙酸10HBO155b2MSb23

500ML存放于冰名稱NHNO名稱NHNOKNO4125047500名稱KHPO4CaCb?重量(mg)425011000MS微量元素母液3

500ML存放于冰箱 中名稱 重量KI 20.75

備 名稱NaMoO?2HO2

。重量(mg)6.25HBO3

155

CuSO?5HO

0.625MnSO-7H2

557.5

CoCb

6H2

0.625ZnSO7HO2

215MS有機(jī)母液3箱中備用。名稱

定量的卜夕U約品用蒸餾水溶解，疋容至重量(mg) 名稱

200ML存放于冰重量(mg)鹽酸吡哆醇

2000101

鹽酸硫胺素 8甘氨酸 400MS鐵鹽母液的配制參考表3稱取 疋量的卜列藥品用蒸餾水溶解，疋容箱中備用。名稱 重量(mg) 名稱

500ML存放于冰重量(mg)EDTA二鈉 932.5 FeSO4-4H2O 695MS鈣鹽母液的配制用。用。

311000mgCaCb?2HO500MLMS鎂鹽母液的配制39250mg的MgSQ7HO500ML7)MS肌醇母液的配制32000mg200ML(8)MS激素母液的配制1當(dāng)量的NaOH1100mg100ml母液。(二)培養(yǎng)基的配制(1)(2)拌；(3)(4)

1L的MS培養(yǎng)基為例進(jìn)行如下操作：1L的大燒杯，加入適量的蒸餾水在電磁爐上加熱至沸騰；分別取(一)中配制的8種母液放入小燒杯中，然后加入，邊加邊攪稱取30g蔗糖加入，邊加邊攪拌；稱取8g瓊脂加入，邊加邊攪拌，知之瓊脂粉溶解；51L,加入激素母液，用NaOH調(diào)PH6.0左右；(6)緊；

將培養(yǎng)基分別分裝于洗好的三角瓶中，塞上棉塞包上牛皮紙用繩子扎放入消毒滅菌鍋滅菌，滅菌20分鐘左右；滅菌后從滅菌鍋中取出培養(yǎng)基，平放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上令其冷卻凝固。(三)高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法具體操作步驟：高壓鍋放水至平把架；把包扎好的培養(yǎng)基裝入高壓鍋；，()關(guān)上氣閥和安全閥；然后接通電源；0.05MPa時(shí)，打開放氣閥()；，0.11MPa0.12MPa0.11MPa20分鐘；20()待再把培養(yǎng)基取出；

(注意對(duì)角扭松螺帽)稍待冷后25C4低溫下保存。總結(jié)：高壓滅菌鍋的使用方法可歸納為：進(jìn)水一放進(jìn)培養(yǎng)基一蓋緊鍋蓋一關(guān)上放汽閥一檢查安全閥一接上加熱源一待壓力升至 0.05MPa時(shí)排鍋內(nèi)冷空氣，關(guān)上放氣-0.11MPa(12lC)下滅菌20~25分鐘，保持穩(wěn)定壓力一除熱源—逐漸打開氣閥—鍋內(nèi)空氣排除完后—開放鍋蓋—稍冷后取出培養(yǎng)基。、(四)無菌操作技術(shù)、1、植物材料表面——消毒劑滅菌從外界或室內(nèi)選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶入培養(yǎng)基，便會(huì)造成培養(yǎng)基污染。因此，植物材料必須經(jīng)嚴(yán)格的表面滅菌處理，再經(jīng)無菌操作手續(xù)接到培養(yǎng)基上，這一過程叫做接種。2、接種步驟：第一步：清理材料―流水沖洗―加入吐溫(或洗衣粉)清洗—自來水沖洗；第二步：對(duì)材料的表面浸潤(rùn)滅菌

：70%酉精浸10-30秒—無菌水；第三步：滅菌劑處理—0.1-1%升汞5-8min(或其他滅菌) ;第四步：無菌水進(jìn)行沖洗。注意事項(xiàng)：滅菌劑一般要臨時(shí)配制，現(xiàn)配現(xiàn)用?升汞可以短期儲(chǔ)存；對(duì)去除較容易的滅菌劑滅菌后無菌水沖洗3 -4次，升汞一般5-8次,每次不少于3min；滅菌時(shí)要輕輕的攪拌，消除氣泡，使消毒更徹底；滅菌時(shí)間是從倒入消毒液開始，至倒入無菌水時(shí)為止；滅菌液要充分浸沒材料。3、無菌操作可按以下步驟進(jìn)行：3320分鐘，打開超凈工作臺(tái)的風(fēng)機(jī)以及臺(tái)上的紫外線燈；接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實(shí)驗(yàn)服，并換穿拖鞋等；先用酒精棉球搽拭接種工具，再將鑷子和剪刀從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)過火尖端處，對(duì)培養(yǎng)皿要過火烤干；（6）接種時(shí)，接種員雙手不能離開工作臺(tái)，不能說話、走動(dòng)和咳嗽等；材料吸干后，一手拿鑷子、一手拿剪刀或解剖刀，對(duì)材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈睢Ｆ谐?.5cm2的小塊；莖切成含有一個(gè)節(jié)的小段。微莖尖要?jiǎng)兂芍缓┰诮臃N過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染；

（如葉1-2片葉7）種，每5天要大強(qiáng)度滅菌一次。

30分鐘，若連續(xù)接（五）豌豆的萌發(fā)與豌豆外植體的接種1、準(zhǔn)備打開超凈工作臺(tái)，將鑷子酒精燈放如超凈工作臺(tái)中，用紫外燈照20min后關(guān)閉紫外燈，同時(shí)將豌豆種子用自來水沖 20min關(guān)閉紫外燈后在臺(tái)242豆，大燒杯等放入超凈工作臺(tái)。2、滅菌在超凈工作臺(tái)上取經(jīng)浸泡處理的豌豆，先用酒精倒入種子瓶中約 2/3消毒一次（1-2s）接著用無菌水沖洗一次。再用84350.5%HgCI泡8min，處理2次，每次5分鐘。后用無菌水搖晃清洗4-5次。3、接種將所要用的三角瓶用75%的酒精噴濕，接著把手噴濕并把三角瓶帶入超凈工作臺(tái)。接著將滅菌處理好的豌豆種子在超凈工作臺(tái)上用鑷子靠近酒精燈的外焰入向下傾斜的錐形瓶杯中，每個(gè)瓶?jī)?nèi)裝 4粒豌豆，接種過程放入暗處。（0.5厘米左右的小段，將莖上的葉片剪干凈，平鋪在培養(yǎng)基上；葉片成用鑷子破碎，平鋪在培養(yǎng)基上。）

0.5*0.54上。5、定期觀察種子的萌發(fā)情況和外植體的分化情況，記錄種子的萌發(fā)率、污染率以及愈傷組織的誘導(dǎo)率。種子的萌發(fā)率為：83.3%種子的污染率：0%外植體的污染率：100% 傷組織（莖）的誘導(dǎo)率愈傷組織（葉）