壯藥復(fù)方鐵草膠囊（ZT）對(duì)肝癌小鼠NK細(xì)胞活性及細(xì)胞因子含量的影響l

壯藥復(fù)方鐵草膠囊〔ZT〕對(duì)肝癌小鼠NK細(xì)胞活性及細(xì)胞因子含量的影響l〔〕:

摘要：復(fù)方鐵草膠囊由鐵包金、白花舌蛇草、半枝蓮、玄參、等組成。具有消腫散結(jié)、驅(qū)邪扶正之功，其臨床效果顯著。

本文采用腹腔注射CY致免疫低下的肝癌H22荷瘤小鼠作為模型，來(lái)討論壯藥復(fù)方鐵草膠囊〔ZT〕對(duì)肝癌小鼠NK細(xì)胞活性及細(xì)胞因子含量的影響。

來(lái)證實(shí)ZT可進(jìn)步免疫低下肝癌H22荷瘤小鼠的免疫功能，但對(duì)地塞米松致免疫低下的肝癌H22荷瘤小鼠的細(xì)胞因子IL-2、TNF-beta;無(wú)明顯作用。運(yùn)用此實(shí)驗(yàn)為藥物的臨床應(yīng)用提供了一定的理論根據(jù)。

關(guān)鍵詞：復(fù)方鐵草膠囊；肝癌H22；免疫功能

本文引用格式：鄒靜,鄭作文.壯藥復(fù)方鐵草膠囊〔ZT〕對(duì)肝癌小鼠NK細(xì)胞活性及細(xì)胞因子含量的影響[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘,2022,19(25):98-99.

0引言

復(fù)方鐵草膠囊作為一種著名壯藥，其組成成分比擬復(fù)雜，詳細(xì)包括鐵包金、白花蛇舌草、半枝蓮、玄參等。復(fù)方鐵草膠囊可以起到消腫、祛瘀、驅(qū)邪等成效，具有良好的使用效果。

藥方中鐵包金臨床上多用來(lái)消腫、散淤，同時(shí)還可以起到解毒、祛濕的作用，因此對(duì)于各種原因引起的瘡瘍腫脹、跌打損傷等具有良好效果；白花蛇舌草是治療腫瘤的常用中藥，具有清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)之功。研究說(shuō)明,白花蛇舌草還可以起到抑制腫瘤細(xì)胞的作用。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1主要藥品。壯藥復(fù)方鐵草膠囊浸膏〔廣西民族醫(yī)藥研究所，批號(hào)：20220521〕；注射用環(huán)磷酰胺；0.9%氯化鈉注射液；新生牛血清

1.2瘤株。小鼠H22肝癌細(xì)胞株，以腹水型傳代保種，臨用抽取H22腹水，以滅菌生理鹽水稀釋備用。

1.3主要儀器。干凈工作臺(tái)；恒溫水浴鍋；CO2培養(yǎng)箱；80-2離心機(jī)〔上海手術(shù)機(jī)械廠(chǎng)〕；倒置顯微鏡；培養(yǎng)瓶；微量移液器；十萬(wàn)分之一電子天平。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。昆明種小白鼠60只，其中雌雄各30只，SPF級(jí)。合格證號(hào)：桂醫(yī)動(dòng)字第11004號(hào)

2實(shí)驗(yàn)藥物

壯藥復(fù)方鐵草膠囊藥液的配制：將壯藥復(fù)方鐵草膠囊浸膏置于60℃水浴鍋內(nèi)，使結(jié)塊溶解，待其溫度降至室溫，精細(xì)稱(chēng)取49.3g，用超純水定容至240mL，得相當(dāng)于生藥濃度1g/mL的藥液，將所得藥液與水按2:1體積稀釋?zhuān)脧?fù)方鐵草高劑量藥液〔20g/kg〕，取上述高劑量藥液，加等體積水稀釋?zhuān)弥袆┝克幰骸?0g/kg〕，以一樣方法等體積稀釋中劑量藥液得低劑量藥液〔5g/kg〕。將上述藥液置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

環(huán)磷酰胺的配制：取環(huán)磷酰胺注射用滅菌粉末0.0075g，加10mL無(wú)菌生理鹽水配制成0.75mg/mL的水溶液，所得藥液于1h內(nèi)使用。

3實(shí)驗(yàn)方法

3.1腫瘤懸液的制備與接種。無(wú)菌離心搜集H22細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0x106cells/mL，備用。取雌性昆明小鼠10只，以0.2mL/只接種上述H22細(xì)胞，于8-10d后，無(wú)菌抽取腹水，第19天將上述小鼠右側(cè)腋部皮膚消毒，以0.2mL/只接種濃度為1.0x107cells/mL的H22細(xì)胞。

3.2分組與給藥。將事先準(zhǔn)備好的昆明小鼠按照隨機(jī)分組法分為五組，每組12只，其中雌雄各一半。分組小鼠分別是空白對(duì)照組、模型組、復(fù)方壯藥鐵草膠囊高、中、低劑量組，復(fù)方壯藥鐵草膠囊高、中、低劑量分別為20g/kg、10g/kg、5g/kg。

灌胃給藥，其中空白組和模型組使用生理鹽水，復(fù)方壯藥鐵草膠囊高、中、低劑量組分別按照對(duì)應(yīng)劑量施行給藥。五組小鼠連續(xù)給藥18天，并在灌藥每三天進(jìn)展稱(chēng)重，根據(jù)稱(chēng)重結(jié)果調(diào)整給藥劑量。

19天時(shí)對(duì)模型組以及復(fù)方壯藥鐵草膠囊高、中、低劑量組小鼠施行注射，方式為腹腔注射，藥物為環(huán)磷酰胺〔給藥劑量為0.015g/kg,給藥體積為20mL/kg〕，空白組小鼠那么承受生理鹽水腹腔注射。針對(duì)模型組、復(fù)方壯藥鐵草膠囊高、中、低劑量組小鼠隔天皮下注射地塞米松〔給藥劑量為5mg/kg，給藥容積為10mL/kg〕，此外，所有小鼠繼續(xù)承受灌藥10天。

3.3.1ZT對(duì)免疫抑制肝癌H22荷瘤小鼠NK細(xì)胞活性的影響實(shí)驗(yàn)觀(guān)察指標(biāo)與觀(guān)察方法：對(duì)小鼠最后一次灌藥后，將小鼠處死，將其放入75%的酒精中浸泡，時(shí)間為5分鐘。

取出小鼠脾臟，注意操作過(guò)程保證無(wú)菌；將脾臟放入平皿中，去掉相關(guān)結(jié)締組織，然后使用生理鹽水對(duì)脾臟進(jìn)展清洗。使用無(wú)菌剪子將脾臟剪碎，然后放入RPMI1640完全培養(yǎng)液中，進(jìn)一步使用注射器芯得到單個(gè)細(xì)胞懸液，使用200目不銹鋼網(wǎng)進(jìn)展篩除；將得到的脾臟使用RPMI1640完全培養(yǎng)液進(jìn)展清洗，并在4度無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)展離心，取出得到的上清液體。

取出靶細(xì)胞和脾細(xì)胞懸液各100ul，將其注入培養(yǎng)板，設(shè)置五個(gè)小組的培養(yǎng)液對(duì)照；靶細(xì)胞對(duì)照孔加靶細(xì)胞以及RPMI-1640培養(yǎng)液各100l，每個(gè)小組參加RPMI-1640培養(yǎng)液各100l。

在此根底上在每個(gè)標(biāo)本設(shè)置五個(gè)復(fù)孔，在對(duì)應(yīng)環(huán)境下施行孵育，詳細(xì)環(huán)境為溫度控制在37度，5%的CO2培養(yǎng)箱。培育時(shí)間為4小時(shí)，施行離心操作，取出其中的上清液體，在每個(gè)孔內(nèi)參加DMSO150l，施行振蕩，詳細(xì)時(shí)間為10min。

按照對(duì)應(yīng)公式計(jì)算NK殺傷活性，詳細(xì)結(jié)果以殺傷率表示。K細(xì)胞殺傷率(%)=[1－〔實(shí)驗(yàn)孔OD值－效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔OD值〕/靶細(xì)胞對(duì)照孔OD值]x100％

3.3.2ZT對(duì)免疫抑制H22荷瘤小鼠細(xì)胞因子的影響實(shí)驗(yàn)觀(guān)察指標(biāo)與觀(guān)察方法：末次藥后1h，檢測(cè)小鼠的IL-1、TNF-beta;的含量。

3.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以〔s〕表示，兩組間均數(shù)差異用t檢驗(yàn)(方差不齊時(shí)采用t檢驗(yàn)校正公式)，統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0。

4實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1ZT對(duì)免疫抑制H22荷瘤小鼠NK細(xì)胞活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，與空白組比擬，模型組有差異〔P<0.01〕，提示環(huán)磷酰胺降低了肝癌H22荷瘤小鼠的NK細(xì)胞活性，使肝癌H22荷瘤小鼠的免疫功能降低。

與模型組比擬，ZT高、中、低劑量組均有顯著差異〔P<0.01〕，提示ZT高、中、低劑量組能明顯進(jìn)步環(huán)磷酰胺致免疫低下的肝癌H22荷瘤小鼠的NK細(xì)胞活性。

4.2ZT對(duì)免疫抑制H22荷瘤小鼠細(xì)胞因子的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，與免疫抑制模型組比擬，IL-2空白對(duì)照組有顯著性差異〔P<0.05〕，TNF-beta;空白對(duì)照組有非常顯著差異〔P<0.01〕，這一結(jié)果說(shuō)明復(fù)方壯藥鐵草膠囊高、中、低劑量組與地米模型組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P<0.05〕，據(jù)此可以推斷，復(fù)方壯藥鐵草膠囊高、中、低劑量組對(duì)地塞米松所致免疫低下的荷瘤小鼠的細(xì)胞因子IL-2、TNF-beta;無(wú)明顯作用。

5結(jié)論

ZT可進(jìn)步免疫低下肝癌H22荷瘤小鼠的免疫功能，對(duì)地塞米松致免疫低下的肝癌H22荷瘤小鼠的細(xì)胞因子IL-2、TNF-beta;無(wú)明顯作用。

6討論

NK細(xì)胞是人體內(nèi)一種特殊細(xì)胞，它可以參與到機(jī)體的非特異性免疫作用過(guò)程中來(lái)，詳細(xì)包括各種抗感染以及抗腫瘤反響，在這個(gè)過(guò)程中，NK細(xì)胞可以殺傷靶細(xì)胞，也就是人體內(nèi)發(fā)生感染的細(xì)胞以及腫瘤部位對(duì)應(yīng)的腫瘤細(xì)胞，其中比擬獨(dú)特的一點(diǎn)在于NK細(xì)胞不需要抗原刺激，也不需要抗體或者相關(guān)補(bǔ)體的協(xié)助，反響迅速，作用明顯。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示環(huán)磷酰胺降低了肝癌H22荷瘤小鼠的NK細(xì)胞活性，使肝癌H22荷瘤小鼠的免疫功能降低。進(jìn)步NK殺傷才能對(duì)殺滅腫瘤細(xì)胞，維持機(jī)體穩(wěn)定和防御疾病有重要意義。ZT進(jìn)步NK活性的作用機(jī)制可能是通過(guò)激活NK細(xì)胞內(nèi)某種潛在殺傷因子或解除某些抑制因素，增加NK細(xì)胞殺傷活性。

細(xì)胞因子(cytokine)能特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞對(duì)多種實(shí)驗(yàn)移植瘤有明顯的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示地塞米松能降低荷瘤小鼠細(xì)胞因子IL-2、TNF-beta;的含量，ZT高、中、低劑量組對(duì)地塞米松所致免疫低下的荷瘤小鼠的細(xì)胞因子IL-2、TNF-beta;無(wú)明顯作用。

由于ZT為一復(fù)方制劑，其抗腫瘤作用機(jī)制較為復(fù)雜，其體內(nèi)外抗腫瘤作用是毋庸置疑的，但可能不作用于細(xì)胞因子形成通路故對(duì)地塞米松所致免疫低下的荷瘤小鼠的細(xì)胞因子IL-2、TNF-beta;無(wú)明顯作用。本實(shí)驗(yàn)為藥物的臨床應(yīng)用提供了一定的理論根據(jù)。

參考文獻(xiàn)