聚焦過程中出現(xiàn)的問題及解決辦法

精選優(yōu)質(zhì)文檔-----傾情為你奉上精選優(yōu)質(zhì)文檔-----傾情為你奉上專心---專注---專業(yè)專心---專注---專業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔-----傾情為你奉上專心---專注---專業(yè)聚焦過程中出現(xiàn)的問題及解決辦法聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦不論在制膠、電泳和染色過程中都比常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳和SDS電泳有較多的技術(shù)問題需要解決，如制膠不易聚合，電泳時易燒膠，脫色時背景不易脫凈等。但是只要掌握等電聚焦技術(shù)的原理，就能解決這些問題而得到高分辨和滿意的結(jié)果。凝膠聚合不佳，膠軟，粘系統(tǒng)中使用的試劑和水不純（應(yīng)該用雙蒸水配制溶液）。系統(tǒng)中有醇、巰基化合物或灰塵影響聚合。凝膠濃度和關(guān)聯(lián)度太低（有時是由于丙烯酰胺或甲叉雙丙烯酰胺溶解不佳造成的）。過硫酸銨（粉末或溶液）和TEMED保存期太長，不能起催化作用。貯液保存期太長，抽氣不充分。聚合時溫度太低，最好在30~40℃聚合。如用核黃素催化的光聚合，應(yīng)使用近紫外的光源，如熒光燈，不要用鎢燈泡，并采用盡可能薄的玻璃，不要用塑料板。核黃素在堿性pH范圍不能催化光聚合。接通電源后沒有電流，電流太低或電流隨電泳增加如果接通電源后沒有電流，也沒有電壓，應(yīng)檢查外線電源是否正常工作？電源的保險絲是否完好？電源和電泳槽的連接插頭是否已插好？如果僅僅沒有電流或電流很小，應(yīng)檢查凝膠、電極條與電極之間的接觸是否良好？檢查電極條上的電極液是否充分？如果在等電聚焦過程中，電壓逐漸下降，電流逐漸上升，應(yīng)檢查電極或電極液是否陰、陽極錯置？接通電源后電流太高或在電泳過程中電流突然升高電流太高通常是由于在凝膠或樣品中有過量的鹽。電流突然升高是燒膠（原因下述）的前奏，應(yīng)立即關(guān)掉電源。等電聚焦過程中冷凝水的出現(xiàn)等電聚焦過程中出現(xiàn)冷凝水雖然是常見現(xiàn)象，但它是燒膠的征兆，所以應(yīng)予密切注意。如果在整塊膠面上出現(xiàn)冷凝水是由于功率（電壓）設(shè)置太高或由于冷卻不充分。應(yīng)重新設(shè)置溫度，檢查循環(huán)冷卻水的運行，凝膠與冷卻板的接觸。在夏天時，冷卻溫度不要設(shè)置太低，以免潮濕空氣凝聚在凝膠周圍。在加樣上方出現(xiàn)冷凝水，說明加樣過多或樣品中有鹽。電極沿邊的冷凝水常常是由于過多，過濃的電極液造成的，有時還因此而引起在凝膠上的壓痕。在凝膠的堿性側(cè)或陰極沿邊出現(xiàn)冷凝水通常是由于凝膠介質(zhì)的電內(nèi)滲引起的。在凝膠的部分位置出現(xiàn)冷凝水是由于凝膠與冷卻板之間有氣泡，接觸不好。如果在凝膠上一條線區(qū)域出現(xiàn)冷凝水可能是由于載體兩性電解質(zhì)在此pH范圍的導(dǎo)電性不佳引起的，特別是使用窄pH范圍的電解質(zhì)，過長的聚焦時間可能也是原因。打火花和燒膠凝膠上出現(xiàn)冷凝水是打火花和燒膠的前奏，所以要避免冷凝水的出現(xiàn)。如果燒膠是沿著電極條邊緣，可能是由于電極條太長。電極條應(yīng)比凝膠短幾毫米。、如果燒膠是沿著陰極條邊緣，可能是由于凝膠介質(zhì)較長時間與堿性電極液接觸而水解。如果樣品數(shù)目多，最好先加樣，后加陰極電極條。如果在pH7純水區(qū)燒膠，應(yīng)在制膠時加適量pH3~10或pH6~8的載體兩性電解質(zhì)。不能得到預(yù)期的pH梯度電泳過程中產(chǎn)生梯度漂移，也稱平臺現(xiàn)象，可能是由于介質(zhì)中丙烯酸引起陰極漂移所致。單體貯液時間太長。聚焦時間太長。載體兩性電解質(zhì)導(dǎo)電性不均勻。pH梯度的堿性部分被丟失凝膠溶液吸收了大氣中的二氧化碳。凝膠介質(zhì)的電內(nèi)滲。在電泳時，載體兩性電解質(zhì)和電極液被氧化。pH梯度成波紋狀凝膠聚合時加過多的過硫酸銨。電極液保存時間太長，電極液太多，不均勻。凝膠，電極條，電極液接觸不好。電極絲不直或不干凈。尿素膠貯存時間太長。如果波紋主要在加樣位置，說明蛋白濃度太高或樣品中有較高濃度的鹽。蛋白帶的拖尾和紋理現(xiàn)象樣品溶解不好，有沉淀顆粒。加樣器或加樣濾紙片在凝膠上放置時間太長。樣品放置時間太長或已變性。樣品分子量大，慢慢進入并堵塞凝膠。蛋白帶偏斜凝膠不成規(guī)則的矩形或正方形。陰、陽電極條長度不一致。電極或電極條的放置不平行。蛋白帶不細(xì)窄低分子量蛋白在等電聚焦時不能被凝膠介質(zhì)穩(wěn)定住。聚焦時間不夠。聚焦后沒有及時或沒有充分固定。在堿性側(cè)可能是由于pH梯度的原因。蛋白帶丟失蛋白濃度太低。樣品由于電泳時的溫度或加樣位置的pH而發(fā)生沉淀。樣品被吸附在加樣濾紙上或加樣濾紙孔徑太小，分子不能進入凝膠。加樣位置太靠近等電點，或分子太大，或加樣時場強太大，蛋白分子無法進入凝膠。染色方法不靈敏。染色前，蛋白分子沒有被固定。脫色時，蛋白分子被溶在脫色液中。一些蛋白帶聚焦在錯誤位置蛋白分子形成復(fù)合物。丟失配體。“一種”戴白聚焦成幾條帶1）蛋白分子被解聚，被水解或形成復(fù)合物。2）樣品在準(zhǔn)備，保存或電泳期間被氧化。3）蛋白分子的寡聚物或部分基團的不同結(jié)合。4）酶的不同程度的磷酸化作用，甲基化作用或乙?；饔谩?）糖蛋白的糖殘基不同。6）樣品在含有尿素時產(chǎn)生氨基甲酰化作用。“微笑”與“皺眉”現(xiàn)象“微笑”與“皺眉”現(xiàn)象同屬于邊緣效應(yīng)凝膠的邊緣與中間的溫度分布和電場強度不同。放置一段時間后，凝膠邊緣的濃度高于中間的濃度。背景脫色不凈1）在固定后漂洗時，載體兩性電解質(zhì)沒有被完全洗去。2）染料質(zhì)量不好，未充分溶解。3）染色液濃度太大凝膠和支持膜表面有染料沉淀染料沉淀來自于三氯醋酸和載體兩性電解質(zhì)的復(fù)合物?？稍谌旧?，脫色前在脫色液中用濕棉花輕輕擦去。凝膠從支持膜上脫落1）三氯醋酸太濃，固定時間太長。2）溫度太高，真要太激烈。3）支持膜質(zhì)量不好。蛋白帶在染色和保存過程中丟失1）改變?nèi)玖?，脫色液或染色方法。降低保存液中甘油的濃度。二、瓊脂糖凝膠等電聚焦凝膠強度不夠凝固時間不夠。最好灌注后1小時取出凝膠，再在保濕盒中置4℃過夜。凝膠可保存一周。濃度不夠。瓊脂糖應(yīng)放在室溫，密封保存，以防吸水。尿素會破壞瓊脂糖的結(jié)構(gòu)，所以此時凝膠濃度最好為2%。等電聚焦時凝膠表面有水從冰箱中取出時，先用濾紙吸干凝膠表面的水。凝膠凝固時間肽段。電極液濃度太大，應(yīng)該使用比據(jù)賓西酰胺凝膠等電聚焦時弱的酸和堿。電極條上的電極液過多。電內(nèi)滲所致，必須使用無電內(nèi)滲瓊脂糖。如果在考級陰極側(cè)有水，是由于電內(nèi)滲所致。如果在加樣位置有水，說明蛋白濃度太高，樣品有鹽，或加樣濾紙有電內(nèi)滲。在加樣位置有壓痕加樣時電場強度太大。過量加樣。凝膠強度不夠。等電聚焦時凝膠干掉強電內(nèi)滲使靠近陽極側(cè)干掉。凝膠厚度不均勻，薄的位置干掉?？諝馓稍?。電泳槽旁有熱源。打火花凝膠干了。電壓過高。凝膠表面有水。蛋白帶太寬過量加樣使鄰近樣品泳道混在一起。蛋白帶不細(xì)窄聚焦時間不夠。聚焦時間過長，陰極漂移所致。因為瓊脂糖凝膠孔徑大，易在等電聚焦時擴散。蛋白帶丟失同聚丙烯酰胺凝膠的原因，且在堿性pH范圍丟失帶的現(xiàn)象更嚴(yán)重?！拔⑿Α保鞍櫭肌焙偷鞍讕爆F(xiàn)象同聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦的原因。蛋白帶的拖尾和紋理現(xiàn)象比使用聚丙烯酰胺凝膠時減輕，因為瓊脂糖凝膠孔徑大。染色時的一些問題同聚丙烯酰胺凝膠，脫色比較容易。出師表：先帝創(chuàng)業(yè)未半而中道崩殂，今天下三分，益州疲弊，此誠危急存亡之秋也。然侍衛(wèi)之臣不懈于內(nèi)，忠志之士忘身于外者，蓋追先帝之殊遇，欲報之于陛下也。誠宜開張圣聽，以光先帝遺德，恢弘志士之氣，不宜妄自菲薄，引喻失義，以塞忠諫之路也。宮中府中，俱為一體；陟罰臧否，不宜異同。若有作奸犯科及為忠善者，宜付有司論其刑賞，以昭陛下平明之理；不宜偏私，使內(nèi)外異法也。侍中、侍郎郭攸之、費祎、董允等，此皆良實，志慮忠純，是以先帝簡拔以遺陛下：愚以為宮中之事，事無大小，悉以咨之，然后施行，必能裨補闕漏，有所廣益。將軍向?qū)櫍孕惺缇?，曉暢軍事，試用于昔日，先帝稱之曰“能”，是以眾議舉寵為督：愚以為營中之事，悉以咨之，必能使行陣和睦，優(yōu)劣得所。親賢臣，遠(yuǎn)小人，此先漢所以興隆也；親小人，遠(yuǎn)賢臣，此后漢所以傾頹也。先帝在時，每與臣論此事，未嘗不嘆息痛恨于桓、靈也。侍中、尚書、長史、參軍，此悉貞良死節(jié)之臣，愿陛下親之、信之，則漢室之隆，可計日而待也。臣本布衣，躬耕于南陽，茍全性命于亂世，不求聞達于諸侯。先帝不以臣卑鄙，猥自枉屈，三顧臣于草廬之中，咨臣以當(dāng)世之事，由是感激，遂許先帝以驅(qū)馳。后值傾覆，受任于敗軍之際，奉命于危難之間，爾來二十有一年矣。先帝知臣謹(jǐn)慎，故臨崩寄臣以大事也。受命以來，夙夜憂嘆，恐