奶粉中蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)方法

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目的嘗試建立一種快速準(zhǔn)確地測定奶粉中蛋白質(zhì)含量的方法。方法使用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)后，運(yùn)用BCA（二喹啉甲酸）法，在570nm波長處，分不測定標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)應(yīng)用液與樣品稀釋液的吸光度值，基于測定液中蛋白質(zhì)含量與其吸光度值呈正比關(guān)系，計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)的含量。結(jié)果待測溶液中蛋白質(zhì)濃度在0～250μg/ml范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線呈線性關(guān)系，其回歸方程為：Y=301.12X-73.42，相關(guān)系數(shù)r=0.998，平均回收率為100.2%。結(jié)論結(jié)合三氯乙酸沉淀的BCA法適用于奶粉中蛋白質(zhì)的快速檢驗(yàn)和摻偽檢驗(yàn)。【關(guān)鍵詞】

奶粉；蛋白質(zhì)；BCA法；三氯乙酸；三聚氰胺Arapidandsimplemethodofproteindeterminationinpowderedmilk

ZhangZhiqiao,ShenGuodong,WangGang

FirstMiddleSchoolofHefei,AnhuiProvincialHospitalAffiliatedtoAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001

［Abstract］Objective

Toexplorearapidandsimplemethodofproteindeterminationinpowderedmilkwithoutothernitrogen-containingcompounddisturbanceinKjeldahldetermination.Methods

Conjugatedwithproteinprecipitationwithtrichloroaceticacid,BCA(bicinchoninicacid)methodwasused.Accordingtothepositiverelationshipofproteincontentwiththe570nmabsorbance,proteincontentwascalculatedinpowderedmilk.Results

Proteincontentinmilksolutionshowedagoodlinearrelationshipatthedetectionrangesof0-250μg/ml,withregressionequation:Y=301.12X-73.42andrelatedcoefficient:0.998,andtheaveragerecoveryratewas100.2%.Conclusion

BCAmethodconjugatedwithtrichloroaceticacidisadaptabletotherapidandsensitivedeterminationofproteininpowderedmilk.

［Keywords］Powderedmilk;Protein;BCAmethod;Trichloroaceticacid;Melamine

蛋白質(zhì)是人類最重要的營養(yǎng)物質(zhì)之一。因此，蛋白質(zhì)含量一直是食品檢測中的重要指標(biāo)。目前蛋白質(zhì)定量方法較多,如凱氏定氮法、紫外分光光度法和Lowry法等。盡管凱氏定氮法目前是測定蛋白質(zhì)含量的國家標(biāo)準(zhǔn)方法，但其操作繁瑣費(fèi)時，且蛋白質(zhì)含量是通過測定氮的含量推算得來的，容易被其他含氮物質(zhì)干擾（如2008年9月“問題奶粉”的出現(xiàn)源于有人利用凱氏定氮法的缺陷，向牛奶中添加三聚氰胺造成蛋白質(zhì)含量虛高）；Lowry法和紫外分光光度法存在顯色所需時刻長，靈敏度低，穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)［1］。為彌補(bǔ)這些不足，本實(shí)驗(yàn)利用BCA（二喹啉甲酸）法結(jié)合三氯乙酸沉淀法建立一種快速簡便的測定奶粉中蛋白質(zhì)含量的方法。

1

材料與方法1.1

儀器與試劑1.1.1

儀器酶標(biāo)儀（型號ELX800，BIO-TEKINSTRUMENTS公司），96孔微孔板，化學(xué)分析濾紙（直徑：9cm，最大孔徑：10μm，杭州新華紙業(yè)有限公司），玻璃漏斗、燒杯等。1.1.2

試劑

光明全脂速溶奶粉（黑龍江省光明松鶴乳品有限責(zé)任公司，產(chǎn)地：齊齊哈爾，生產(chǎn)日期：20081010），蒙牛學(xué)生多維高鈣高鋅奶粉（內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，產(chǎn)地：呼和浩特，生產(chǎn)日期：20081207），尿素（分析純，上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司），三聚氰胺（化學(xué)純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司），硝酸銨（分析純，汕頭市西隴化工廠有限公司），三氯乙酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），BSA（牛血清清蛋白，美國Sigma公司）BCA試劑盒（PIERCE公司，BCA23225），去離子水。1.2

實(shí)驗(yàn)方法1.2.1

方法原理

據(jù)資料介紹，BCA法是目前已知的一種敏感準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)測試法，廣泛用于國內(nèi)外企業(yè)和科研院所進(jìn)行蛋白質(zhì)含量檢測。其要緊原理是：要分析的蛋白質(zhì)在堿性溶液里與Cu2+反應(yīng)產(chǎn)生Cu+，Cu+與BCA形成一種紫色化合物，其汲取峰在562nm波長處。BCA法定量分析蛋白質(zhì)具有準(zhǔn)確靈敏（20～2000μg/ml）、快速（約40min）、穩(wěn)定和經(jīng)濟(jì)有用（能夠用試管或微孔板測定），以及它是反應(yīng)物與蛋白質(zhì)直接作用，對銨鹽類等含氮化合物的抗干擾能力較強(qiáng)等特點(diǎn)。

三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)的要緊原理：三氯乙酸作為蛋白質(zhì)變性劑可使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出較多的疏水基團(tuán)，使之聚攏沉淀。據(jù)文獻(xiàn)報道，三氯乙酸比硫酸銅等物質(zhì)能更好地排除非蛋白氮對溶液中蛋白氮的阻礙，具有廣泛的適用性。1.2.2

標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用曲線的繪制

配制2mg/ml牛血清清蛋白（BSA）溶液作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)儲存液（含有9g/L氯化鈉），參照BCA試劑盒講明書所示方法，按表1所示配制不同濃度BSA工作液，用定性濾紙過濾，收集濾液并記錄體積，取其中200μl濾液加入等體積的10%三氯乙酸溶液，充分反應(yīng)后12000r/min離心30min，吸取上清液待測；以9g/L氯化鈉溶液為空白對比，吸取上述濾液及其三氯乙酸沉淀后的上清液各25μl加入微孔板上相應(yīng)的各個微孔中，每孔還加入200μlA液與B液（10A∶1B）的混合工作液，60℃水浴30min，用酶標(biāo)儀在570nm波長下測定各個微孔中溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)回歸方程并繪制工作曲線。表1

不同濃度BSA工作液的配方（略）1.2.3

樣品制備與測定

準(zhǔn)確稱量牛奶粉150mg/份和300mg/份各4份，分不倒入貼有1、2、3、4、5、6、7、8標(biāo)簽的8個50ml離心管中，再分不稱量20mg的硝酸銨、三聚氰胺和尿素各2份，按表2示倒入對應(yīng)的離心管中。加入適量60℃9g/L氯化鈉溶液充分溶解，并用100ml容量瓶定容至刻度。用定性濾紙過濾，收集濾液并記錄體積，取其中200μl濾液加入等體積的10%三氯乙酸溶液，充分反應(yīng)后12000r/min離心30min，吸取上清液待測；以9g/L氯化鈉溶液為空白對比，吸取上述濾液及其三氯乙酸沉淀后的上清液各25μl加入微孔板上相應(yīng)的各個微孔中，每孔還加入200μlAB（10A∶1B）混合液，60℃水浴30min，用酶標(biāo)儀在570nm波長下測定各個微孔中溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上查出對應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度。表2

待測樣品組成（略）1.2.4

分析結(jié)果的表述與計(jì)算

樣品中蛋白質(zhì)的含量X按式(1)計(jì)算：X=10C·F(1)，式中：X-樣品中蛋白質(zhì)的含量，g/100ml(g)，C-測定樣品溶液中蛋白質(zhì)含量（mg/ml），F(xiàn)-稀釋倍數(shù)。1.2.5

同意差

同一樣品的兩次測定結(jié)果之差，不得超過平均值的51%。2

結(jié)果2.1

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及線性范圍

以BSA各級工作液的蛋白質(zhì)濃度（Y，μgmoL-1）對其OD值（X）作圖，結(jié)果表明蛋白質(zhì)濃度在0～250μg/ml范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線呈線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=301.12X-73.42，相關(guān)系數(shù)r=0.998。見附圖。

附圖

蛋白質(zhì)含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線2.2

樣品測定中干擾因素的阻礙

取上述添加了不同干擾物質(zhì)的樣品，按上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作，結(jié)果發(fā)覺，在60℃的水中三聚氰胺等添加物質(zhì)都能充分溶解，只是過濾速度表現(xiàn)不一樣：添加了三聚氰胺的奶粉溶液過濾速度最快（3號和7號管分不用時為19min和21min），添加了尿素的奶粉溶液次之（4號和8號管分不用時為79min和92min），添加了硝酸銨的奶粉溶液最慢（2號和6號管分不用時為112min和124min）。

分不收集濾液和三氯乙酸沉淀后的上清液進(jìn)行BCA法檢測蛋白質(zhì)含量，測得各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表3。結(jié)果發(fā)覺三種不同的非蛋白質(zhì)的含氮化合物差不多不阻礙蛋白質(zhì)含量的正確測定：質(zhì)量150mg的奶粉添加三種含氮化合物后平均蛋白質(zhì)含量為35.72mg，標(biāo)準(zhǔn)方差為1.38mg；質(zhì)量300mg的奶粉添加三種含氮化合物后平均蛋白質(zhì)含量為62.13mg，標(biāo)準(zhǔn)方差為1.43mg；分不與空白對比的34.96mg和65.56mg，以及廠家奶粉中蛋白質(zhì)標(biāo)示量36mg和72mg相比，二者差異都不明顯。同時實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明本實(shí)驗(yàn)所用奶粉的蛋白質(zhì)含量達(dá)到國家要求（我國《食品營養(yǎng)標(biāo)簽治理規(guī)范》的技術(shù)附件中規(guī)定，關(guān)于蛋白質(zhì)和碳水化合物，其同意的誤差范圍是≥80%標(biāo)示值）。表3

不同樣品蛋白質(zhì)含量測定（略）2.3

方法的加標(biāo)回收率

分不取奶粉1（光明全脂速溶奶粉，其稀釋液為稀釋液1）和奶粉2（蒙牛學(xué)生多維高鈣高鋅奶粉，其稀釋液為稀釋液2）加入60℃9g/L氯化鈉溶液進(jìn)行1/1000樣品稀釋，做方法加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表4，該方法的平均加標(biāo)回收率為100.2%。

表4

方法的加標(biāo)回收率3

討論

奶粉中蛋白質(zhì)含量是奶粉檢驗(yàn)工作的一項(xiàng)重要指標(biāo)。目前國內(nèi)要緊采納常規(guī)凱氏定氮法，國外也多采納常規(guī)或改良的凱氏定氮法測定食品中蛋白質(zhì)含量，但此法費(fèi)時、費(fèi)水、費(fèi)電，操作繁瑣，試劑消耗量大，且不能有效區(qū)分非蛋白氮［2、3］。常見的含氮化合物如硝酸銨和尿素比牛奶蛋白質(zhì)的含氮率都高，易溶于水，專門容易摻入奶粉等食物中；而三聚氰胺盡管常和氣冷水狀況下在水中的溶解度特不低［4］，然而人們平常適應(yīng)上和奶粉講明書上都要求用溫開水沖調(diào)，例如60℃時三聚氰胺在100g水中能夠溶解1.8g，100℃時溶解6.4g，因而摻偽問題容易受到人們的忽視。

國內(nèi)已有多篇文獻(xiàn)涉及有關(guān)乳制品中蛋白質(zhì)含量測定方法的研究，例如，云南工業(yè)大學(xué)張惠芬等探討了在奶粉、豆奶粉、魚粉中人為摻入尿素、硫酸銨等含氮化合物對蛋白質(zhì)測定的阻礙，結(jié)果表明：用95%乙醇能專門好地將尿素與食品中蛋白進(jìn)行分離，回收率較高，并能方便、快速測定摻入量。對摻入硫酸銨等無機(jī)銨鹽的測定，采納加MgO調(diào)到弱堿性，直接蒸餾測定［5］。成都理工大學(xué)李海玲等通過對Lowry法、BCA法、磺基水楊酸沉淀法、Bradford法等4種常用蛋白濃度測定方法的研究認(rèn)為，確定PEG-IL-6的最佳蛋白濃度測定方法為BCA法，而包涵體變性液中的蛋白濃度只能用Bradford法測定［6］。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院牛巍等利用三氯乙酸沉淀蛋白法和硫酸銅沉淀蛋白法對添加了非蛋白氮的液態(tài)奶進(jìn)行蛋白氮測定。結(jié)果表明，三氯乙酸沉淀法能更有效地排除非蛋白氮對液態(tài)奶蛋白氮測定的阻礙［7］。河北省衡水市疾病預(yù)防操縱中心田志梅等分不運(yùn)用紫外分光光度法及甲醛值滴定法快速測定液體奶、奶粉中蛋白質(zhì)含量。結(jié)果顯示，兩種方法均可有效解決非蛋白質(zhì)類含氮物質(zhì)對牛奶中蛋白質(zhì)測定結(jié)果的干擾問題［8,9］。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)侯彩云等使用三氯乙酸使蛋白質(zhì)沉淀后，不同含量的蛋白氮在堿性條件下與雙縮脲試劑形成深淺不同的藍(lán)紫色的絡(luò)合物，依照其色度值與蛋白氮含量高低呈線性相關(guān)關(guān)系，用計(jì)算機(jī)軟件自動分析獲得的樣品色度值，從而計(jì)算出蛋白氮含量［10］。

綜上所述，目前國內(nèi)用于測定奶粉中蛋白質(zhì)含量的方法有多種，其測定原理及結(jié)果的準(zhǔn)確性各不相同，每種方法都有其優(yōu)點(diǎn)及局限性。相比較而言，本項(xiàng)目運(yùn)用BCA法結(jié)合三氯乙酸沉淀蛋白法檢測奶粉中蛋白質(zhì)的含量，能夠有效排除三聚氰胺等非蛋白氮的干擾，具有簡便、快速、準(zhǔn)確、有用的特點(diǎn)，可作為檢測機(jī)構(gòu)和平常人們準(zhǔn)確檢測蛋白質(zhì)含量時考慮運(yùn)用的方法之一。奶營養(yǎng)成分專門高，富含蛋白質(zhì)和微量元素鈣、鐵、鋅等，是人們生活中的要緊要營養(yǎng)食品之一。因此，分析牛奶中的營養(yǎng)成分含量是專門有必要的工作。本實(shí)驗(yàn)在一般實(shí)驗(yàn)室條件，采納簡單科學(xué)快捷的方法分析某品牌牛奶中部分成分含量。

摘要：牛奶營養(yǎng)成分專門高，富含蛋白質(zhì)和微量元素鈣、鐵、鋅等，是人們生活中的要緊要營養(yǎng)食品之一。因此，分析牛奶中的營養(yǎng)成分含量是專門有必要的工作。本實(shí)驗(yàn)在一般實(shí)驗(yàn)室條件，采納簡單科學(xué)快捷的方法分析某品牌牛奶中部分成分含量。

關(guān)鍵字：牛奶

蛋白質(zhì)鈣鐵鋅

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

用分光光度法測某牛奶中蛋白質(zhì)、鈣、鐵、鋅的含量。

2、實(shí)驗(yàn)原理

牛乳中的要緊的蛋白質(zhì)是酪蛋白，含量約為35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白質(zhì)的混合物，等電點(diǎn)為4.7。利用等電點(diǎn)時溶解度最低的原理，將牛乳的pH調(diào)至4.7時，酪蛋白就沉淀出來。用乙醇洗滌沉淀物，除去脂類雜質(zhì)后便可得到純酪蛋白。

雙縮脲(NH2CONHCONH2)在堿性溶液中與硫酸銅反應(yīng)生成紫紅色化合物，稱為雙縮脲反應(yīng)，蛋白質(zhì)分子中含有許多肽鍵在堿性溶液中也能與Cu2+反應(yīng)產(chǎn)生紫紅色化合物。在一定范圍內(nèi)，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。因此，能夠利用比色法測定蛋白質(zhì)濃度。雙縮脲法是測定蛋白質(zhì)濃度的常用方法之一。操作簡便、迅速、受蛋白質(zhì)種類性質(zhì)的阻礙較小，但靈敏度較差，而且特異性不高。除-CONH-有此反應(yīng)外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基團(tuán)也有此反應(yīng)。

鈣與軀體健康息息相關(guān)，鈣除成骨以支撐軀體外，還參與人體的代謝活動，它是細(xì)胞的要緊陽離子，依舊人體最活躍的元素之一，缺鈣可導(dǎo)致兒童佝僂病，青青年發(fā)育遲緩，孕婦高血壓，老年人的骨質(zhì)疏松癥。缺鈣還可引起神經(jīng)病，糖尿病，外傷流血不止等多種過敏性疾病。補(bǔ)鈣越來越被人們所重視。牛奶中含有易被人體汲取得鈣，有些牛奶產(chǎn)品中還特地加鈣而成為鈣奶。關(guān)于液體牛奶中鈣的含量，可采納EDTA法進(jìn)行直接測定?？紤]到牛奶中含有Fe3+、Al3+等干擾離子，能夠加入少量三乙醇胺以消除它們的，調(diào)節(jié)pH≈12～13，以鉻藍(lán)黑R作指示劑，指示劑與鈣生成紅色的絡(luò)合物，當(dāng)用EDTA滴定至計(jì)量點(diǎn)時，游離出指示劑，溶液呈現(xiàn)藍(lán)色。

當(dāng)一束光通過一個吸光物質(zhì)（通常為溶液）時，溶質(zhì)汲取了光能，光的強(qiáng)度減弱。吸光度確實(shí)是用來衡量光被汲取程度的一個物理量。

吸光度用A表示。

A＝abc，其中a為吸光系數(shù)，單位L/(g·cm),b為液層厚度（通常為比色皿的厚度），單位cm，c為溶液濃度，單位g/L

阻礙吸光度的因數(shù)是b和c。a是與溶質(zhì)有關(guān)的一個常量。此外，溫度通過阻礙c，而阻礙A。

符號A，表示物質(zhì)對光的汲取程度。

鄰二氮菲也叫鄰菲啰啉，是測定微量Fe2+的高靈敏度顯色劑在pH2～9的條件下，F(xiàn)e2+與鄰二氮菲生成穩(wěn)定的橙紅色絡(luò)合物，在510nm波長處有最大汲取。

測定時，操縱溶液的酸度在pH＝5左右較為適宜。酸度高時，反應(yīng)進(jìn)行較慢；酸度太低，則Fe2+離子水解，阻礙顯色。當(dāng)鐵濃度在5.0mg／mL以內(nèi)時，吸光度與Fe2+濃度呈直線關(guān)系。Bi3+、Cd3+、Hg9+、Ag+、Zn2+等離子在pH＝2~9時與鄰二氮菲生成沉淀。Co2+，Ni2+，Cu2+等離子可與鄰二氮菲形成有色配合物，故應(yīng)注意它們的干擾。

鋅是人體中必需的微量元素之一，鋅缺乏會阻礙生長發(fā)育，過量又會導(dǎo)致胃癌等疾病。人類從牛奶等飲食中能夠獲得一定量的鋅。在pH4.0～5.5的水溶液中，鋅離子與雙硫腙（C13H12N4S）生成紅色螯合物，摩爾吸光系數(shù)535=9.3×104L?mol-1?cm-1用四氯化碳萃取后比色定量。在選定的pH條件下，用足夠量的硫代硫酸鈉可掩蔽水中存在的少量鉛、銅、鎘、鈷、鉍、鎳、金、鈀、銀、亞錫等干擾金屬離子。

3、實(shí)驗(yàn)步驟

3.1、試劑的配制

3.11、pH4.7醋酸-醋酸鈉緩沖液的配制:

先配A液與B液。A液：0.2mol/L醋酸鈉溶液。B液：0.2mol/L醋酸溶液。

取醋酸鈉固體6.5461g加水溶解并稀釋至100ml，取冰醋酸5mL加水稀釋至100ml，混合即得pH4.7的醋酸——醋酸鈉緩沖液200mL。

3.12、乙醇—乙醚混合液的配制：取25ml95％乙醇與25ml無水乙醚混合

3.13、雙縮脲試劑：稱取CuS04·5H2O0.3g，酒石酸鉀0.9g和碘化鉀0.5g，分不溶解后混勻，加6mol·L-1NaOH10mL，最后加水至100mL，貯于棕色瓶中，避光，可長期保存。

3.14、蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液(10mg·mL-1)，用小燒杯稱取干燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理鹽水溶解后倒入l0mL容量瓶中，淋洗小燒杯數(shù)次，一并倒入容量瓶中，最后加生理鹽水至刻度線。待測蛋白樣本：將牛奶樣品用生理鹽水準(zhǔn)確配制成一定濃度的溶液后再測定；將制得的酪蛋白用生理鹽水準(zhǔn)確配制成一定濃度的溶液后再測定。（如若不能溶解，滴加幾滴6mol/LNaOH溶液、分不用l0mL容量瓶定容）

3.15、鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液(40.0μg·mL-1)：:準(zhǔn)確稱取0.0345g硫酸鐵銨〔NH4Fe(SO4)2·12H2O〕于燒杯加入6mL6mol·L-1HCl和少量水，溶解后用純水定容至10mL。此溶液1.00mL含有40.0μg鐵。

3.16、鹽酸羥胺溶液(100g·L-1)：:稱取10g鹽酸羥胺(NH2OH·HCl)，溶于水，并稀釋至100m（新奇配制，兩周內(nèi)有效）

3.17、鄰二氮菲溶液(2g·L-1):：稱取0.20g鄰二氮菲(C12H8N2·H2O)，溶解于加有2滴濃鹽酸的純水，并稀釋至100mL（新奇配制，兩周內(nèi)有效）

3.18、醋酸鈉溶液（1.0mol·L-1）：:稱取8.2030g醋酸鈉，用純水溶解后稀釋至100mL。

3.19、鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.00μg·mL-1）：準(zhǔn)確稱取0.0100g基準(zhǔn)鋅于100mL燒杯中，加入6mol·L-1HCl0.5mL，立即蓋上表面皿，待鋅完全溶解后，以少量水沖洗表面皿及燒杯壁，將溶液轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，定容，即為鋅標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。準(zhǔn)確移取1mL鋅標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，稀釋定容至100.0mL，即得1.00μg·mL-1鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3.20、0.1％雙硫酸腙四氯化碳貯備溶液：稱取0.10g雙硫腙（C18H12N4S），在干燥的燒杯中用四氯化碳溶解后稀釋至100mL，倒入棕色瓶中。此溶液置冰箱內(nèi)保存，可穩(wěn)定數(shù)周。

3.21、雙硫腙四氯化碳溶液：臨用前，吸取適量雙硫腙四氯化碳貯備溶液，用四氯化碳稀釋約30倍，至吸光度為0.4（波長535nm，1cm比色皿）。

3.22、25％硫代硫酸鈉溶液：稱取64.60g硫代硫酸鈉（Na2S203·5H20)，溶于100mL純水中。

3.23、1＋1氨水溶液:10ml氨水加10ml水稀釋

3.2、牛奶中酪蛋白的提取

3.21、酪蛋白的粗提

50mL鮮牛奶加熱至40℃。在攪拌下慢慢加入預(yù)熱至40℃、pH4.7的醋酸緩沖液50mL.用周密pH試紙或酸度計(jì)調(diào)pH至4.7。

將上述懸浮液冷卻至室溫。離心15分鐘（3000r·min-1）。棄去清液，得酪蛋白粗制品。

3.22、酪蛋白的純化

用水洗滌沉淀3次，離心10分鐘（3000r·min-1），棄去上清液。在沉淀中加入30mL乙醇，攪拌片刻，將全部懸濁液轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中抽濾。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。將沉淀攤開在表面皿上，風(fēng)干；得酪蛋白純品。

3.3、酪蛋白含量的測定

3.31、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與樣品的測定

取試管8支，按下表操作。

各管混勻、放置37℃水浴中保溫20min。540nm比色，以空白管調(diào)零點(diǎn)，讀取各管吸光度值。

3.32、計(jì)算

在電腦上以吸光度值為縱坐標(biāo)，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出待測樣本的蛋白質(zhì)濃度(g／L)，并求出牛奶中蛋白質(zhì)濃度。由此濃度計(jì)算出100mL鮮牛奶中酪蛋白的真實(shí)含量。

3.4鈣含量的測定

3.41、鈣制劑鈣含量的測定

準(zhǔn)確移取25ml的鮮牛奶和鈣奶，分不轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。

準(zhǔn)確移取上述試液20.00mL，加入三乙醇胺溶液5mL，5mol·L-1NaOH4mL，加入水20mL，搖勻，加鉻藍(lán)黑R8~10滴，用0.01mol·L-1EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，接近終點(diǎn)時再補(bǔ)加2～3滴鉻藍(lán)黑，當(dāng)溶液由紅色變?yōu)樗{(lán)色即為終點(diǎn)，依照消耗EDTA的體積，計(jì)算出鮮奶和鈣奶中鈣的含量（g/100mL），并與包裝上注明的含量作比較。

3.42、注意事項(xiàng)

量取鮮奶和鈣奶的量視鈣含量多少而確定，以消耗0.01mol·L-1EDTA體積為20~30mL。牛奶、由于鈣奶均為乳白色，終點(diǎn)顏色變化不太明顯，接近終點(diǎn)時再補(bǔ)加2～3滴指示劑。

3.5鐵含量的測定

3.51、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取25mL比色管6支，按下表順序配制鐵標(biāo)準(zhǔn)系列并記錄測量的數(shù)據(jù)（注意：加入鹽酸鈔票干后需搖勻放置2min，再進(jìn)行下一步操作），加完試劑后搖勻，放置37℃水浴中保溫15min，以空白液為參比，在510nm下測定各溶液的吸光度值。

取25mL比色管2支，按照上表及上述方法測定510nm下的吸光度值。

3.52、計(jì)算

在電腦上以吸光度值為縱坐標(biāo)，以鐵質(zhì)量濃度（μg?mL）濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算鮮奶中鐵的含量（mg/100mL）。

3.53、樣品的測定

將50m