DB37-T 3880-2020 鴨疫里默氏桿菌病診斷技術規(guī)程-（高清版）

ICS 11.220B41

DB37山 東 省 地 方 標 準DB37/T3880—2020鴨疫里默氏桿菌病診斷技術規(guī)程2020-03-162020-03-162020-04-16山東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布前 言本標準按照GB/T1.1－2009給出的規(guī)則起草。本標準由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并組織實施。本標準由山東省畜牧業(yè)標準化技術委員會歸口。鴨疫里默氏桿菌病診斷技術規(guī)程范圍GB4789.28食品安全國家標準食品微生物學檢驗培養(yǎng)基和試劑的質量要求GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范~8急性型2～31～3慢性型4～73.4判定標準3.13.23.3除非另有規(guī)定，實驗室診斷所用化學試劑均為分析純；試驗用水符合GB/T6682二級水的規(guī)定；實驗室生物安全要求按照GB19489執(zhí)行。CO2A.1）（A.2）取樣按NY/T541GB4789.285%～10CO2的3724h～48h4.1.3.31mm～2mm0.2μm～0.5μm，長為μm～5μm，呈絲11μm～24μm分離的細菌如同時符合4.1.3.3和4.1.3.4，可判定為疑似鴨疫里默氏桿菌。PCRPCR4.2.1.1.5：0.5μL～10μL；2μL～20μL；20μL～200μL；100μL～1000）KPBS（B.1）TE（B.2）。SDS（B.3）（B.4）。TAE（B.5）1.0g～5.0g，按10%（g/mL）PBS磨勻漿。-20℃保存?zhèn)溆?。?00μL組織勻漿液加入400μLTE中充分混勻，再加終濃度為1%的SDS和100μg/mLK，置56℃水浴消化2h75%40μLDEPCDNA，作為PCR20DNADNA挑取4.1.3.2可疑菌落，加到含20μL滅菌去離子水的PCR離心管中，壓緊管蓋，煮沸10min，再冰浴10min后離心取上清作為PCR模板樣品。或者用商品化的DNA提取試劑盒提取DNA。引物根據(jù)GenBank16sRNA475bpGATAGTTGGTGAGGTAA-3’RA-002R:5’-ATCGGTGTTCTGAGTAAT-3’PCR反應體系為25μL，配制見表1。表1PCRPCR反應體系中各成分每個樣品反應組分用量/μL10×PCRbuffer2.52.5mmol/LdNTP2.010μmol/L引物F0.510μmol/L引物R0.55U/μLTaqE0.5模板1.0無RNA酶去離子水18.0總體積25.0采用以下反應程序進行擴增：——第一階段：95℃5min；——第二階段：95℃30s，56℃30s，72℃40s，共進行30個循環(huán)；——第三階段：72℃10min。PCR擴增也可使用商品化的PCR試劑盒，按說明書要求操作。電泳反應結束后取10.0反應結束后取10.0μLPCR產物與1.0μL10×上樣緩沖液混合，加到1%瓊脂糖凝膠板的加樣孔中，同時設DNA分子量標準參照，以5V/cm電壓進行電泳20min～40min，在凝膠成像儀上觀察結果。在陽性質控出現(xiàn)一條大小475bp的單一條帶，同時陰性質控無此條帶的情況下，檢測結果成立。C。實時熒光定量PCRPCR4.2.2.1.40.5μL～10μL；2μL～20μL；20μL～200μL；100μL～10004.2.2.1.5RNAPCR）KSDSPCR參見4.2.1.3.1。參見4.2.1.3.2。引物根據(jù)GenBank16sRNA190bpGGAATGAGTAGTGTAG-3’RA-004R:5’-GCTTAGTCTCTGAACCATATAG-3’PCR表2熒光PCR反應體系配制——第一階段：95℃2min；表2熒光PCR反應體系配制——第一階段：95℃2min；——第二階段：95℃20s，57℃1min，共進行40個循環(huán)，57℃時收集熒光。反應結束后根據(jù)分析軟件得出的Ct值和擴增曲線來判定結果。Ct＜28.04.2.2.5.3.2結果的判定反應體系中各成分每個樣品反應組分用量/μL2×SYBRPremix10.010μmol/L引物P31.010μmol/L引物P41.0模板2.0無RNA酶去離子水6.0總體積20.0Ct≤30CtCt值≥3530＜Ct值＜35CtE符合3.4臨床診斷規(guī)定的疑似病例經(jīng)4.2.1和4.2.2中的任一方法檢測，結果為陽性者，可判定為鴨疫里默氏桿菌病。附錄A（規(guī)范性附錄）試劑的配制PBS（0.01mol/L，pH7.2）氯化鈉8.00g氯化鉀0.2mL磷酸二氫鉀0.2mL磷酸氫二鈉2.89g硫柳汞0.1g去離子水加至1000mL100kPa15min滅菌，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?00kPa15min滅菌后備用。A.320%SDSA.41.0%瓊脂糖凝膠加熱完全融化，待冷至50℃～60℃時，加Goodview溶液5100kPa15min滅菌后備用。A.320%SDSA.41.0%瓊脂糖凝膠加熱完全融化，待冷至50℃～60℃時，加Goodview溶液5μL，搖勻，倒入電泳板上，凝固后取下梳子，備用。A.550×TAE緩沖液羥基甲基氨基甲烷（Tris）12.11g乙二胺四乙酸二鈉3.72g水800mLHCl調PH至8.0水加至1000mL十二烷基硫酸鈉20g水80mLHCl調PH至7.2水加至100mL瓊脂糖1.0g1×TAE電泳緩沖液加至100mL羥基甲基氨基甲烷（Tris）242.0g冰乙酸57.1mL0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（PH8.0）27.5mL滅菌去離子水加至1000mL2℃～8℃保存。附錄B（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基的配制牛肉0.5蛋白1.0氯化0.5瓊脂1.0100kPa20min50℃～605mL4℃麥康粉50瓊脂10去離子水加至1000mL，100kPa15min滅菌，置2℃～8℃冰箱保存?zhèn)溆谩８戒汣（資料性附錄）