RNAi及其在植物遺傳改良中的應用

RNAi及其在植物遺傳改良中的應用123RNAi即RNA干涉(或RNA干擾)是指雙鏈RNA導入細胞后并被切割成21?23個核苷酸長度的短核苷酸雙鏈，在其它作用因子的參與下能夠特異地與其同源的mRNA結合并導致其降解，從而使得內(nèi)源基因不能表達，導致內(nèi)源基因的沉默。自1998年Fire等首次在線蟲中發(fā)現(xiàn)并闡明以來，RNAi已經(jīng)在其它動物、植物和真菌中被證實。研究表明參與該過程的許多基因具有高度的保守性，這可能是生物調(diào)控基因表達及抵御病毒侵染或轉座子誘導DNA突變的一種共有的古老生理機制。RNAi所具有的特異性、穩(wěn)定性、高效、快速以及不改變基因組的遺傳組成等特性為人們研究未知功能的基因提供了新的反向遺傳學手段。在擬南芥和水稻等基因組測序完成后，RNAi這一新技術在植物功能基因組學研究及植物的遺傳改良等方面提供了一個強有力的手段。植物的轉基因沉默Napoli等將1個查爾酮合成酶基因(chs)置于1個強啟動子后導人矮牽牛(Petuniahybrida)，試圖加深花朵的紫顏色。結果部分花的顏色并非期待中的深紫色，而是形成了花斑狀甚至白色，而且這種性狀可以遺傳。因為導入的基因和其同源的內(nèi)源基因同時都被抑制，他們將這種現(xiàn)象命名為共抑制(co-suppression)。類似的結果同樣在真菌脈胞菌(Neurosporacrassa)中和其它轉基因植物中存在。對于部分轉基因植物來說，基因沉默可能是因為特異基因的甲基化而導致，這被稱為轉錄水平基因沉默。但確實部分植物中的基因沉默是在轉錄后發(fā)生的，這被稱為轉錄后基因沉默。實驗表明在發(fā)生PTGS的個體中同源轉錄確實存在，但是很快在胞漿中被降解，沒有積聚。Palauqui等進一步證實，在植物中將出現(xiàn)轉基因沉默的植株嫁接到另一沒有基因沉默的轉基因植株中同樣可以導致PTGS，但對非轉基因植株卻無效。Cogoni等證實PTGS由一種可擴散的反式作用分子所介導。RNAi及其機制RNAi的發(fā)現(xiàn)Guo等在對線蟲基因par-1進行功能研究時發(fā)現(xiàn)：當他們給線蟲注射par-1的反義RNA以阻斷該基因的表達時，發(fā)現(xiàn)作為正對照的正義RNA和反義RNA得到的結果相似，即兩者都阻斷了par-1基因的表達。Fire等分別將正義RNA、反義RNA和雙鏈RNA注射進線蟲中來研究unc22，fem1,unc54和hlh1等基因的功能。他們發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA比任一單鏈單獨使用所產(chǎn)生的基因沉默效果要好的多，雙鏈RNA能產(chǎn)生高效和特異的效果，并且每個細胞只需要幾個雙鏈分子，這種干涉的效果還可以持續(xù)到其子代，他們將這種現(xiàn)象稱為RNA干涉。Timmons等在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)RNAi具有擴散性，將雙鏈RNA注射到線蟲的某一部位后可以在全身其它細胞中看到干涉現(xiàn)象，并且他們通過喂食的方法將雙鏈RNA導人線蟲體內(nèi)也獲得了類似的結果。RNAi的產(chǎn)生機制Hamilton等和Ketting等分別在發(fā)生共抑制的煙草和西紅柿中鑒定了一些大約25個堿基大小的RNA,這些RNA分別與沉默基因的正義鏈和反義鏈互補。Zamore等在果蠅細胞中發(fā)現(xiàn)被注射進入的雙鏈RNA被切割為21?23堿基長短的雙鏈RNA片段。同時與雙鏈RNA同源的內(nèi)源基因的mRNA，只在和雙鏈RNA對應的部位被切割成為21?23核苷酸長的片段，造成mRNA在細胞中的含量大大降低，因此他們認為這些siRNA在RNAi過程中起著重要作用。生化鑒定表明這些siRNA具有一些共性：一般為長21?23個堿基對的雙鏈；3'端具有2個突出的堿基，多為尿嘧啶，也可以是胸腺嘧啶且具有羥基；5'端被磷酸化。這些特點可能是其與別的RNA相區(qū)別，能被特異地識別。而這一特點也是RNaseIII酶切后的特征。研究表明mRNA被特異性切割發(fā)生在細胞質(zhì)中。當雙鏈RNA進入細胞后，能與類似RNaseIII的Dicer結合，隨即被切割成21?23個堿基的siRNA。siRNA與RISC（RNAinducedsilencingcomplex）結合，若雙鏈5'端未被磷酸化，則會啟動其磷酸激酶活性，將其磷酸化并被解螺旋。反義鏈RNA與RISC結合后將其內(nèi)切酶活性激活，激活的RISC在細胞質(zhì)中尋找能與反義RNA同源的mRNA，并在雙鏈的中心部位、距雙鏈RNA5'端第10個堿基處將其切割，從而使mRNA降解。在對RNAi的研究中，往往一個細胞中含有幾個雙鏈RNA分子就可以將靶基因沉默，即使是沉默高豐度表達基因也是如此。因此人們推測在RNAi過程中還應包括一個雙鏈RNA的復制過程。Sijen等認為雙鏈RNA在RNAi初期的作用是為RdRP（RNAdependentRNAPolymerase）提供引物，并以靶mRNA為模板合成更多的雙鏈RNA。這一假設在其它物種中得到證實。目前人們已經(jīng)在線蟲、果蠅、擬南芥及脈胞菌等物種中鑒定了多個與RNAi過程相關的基因，如線蟲基因ego-1，rde-1和rde-4，脈胞菌的qde-2,擬南芥的ago1基因等。RNAi在生物體的進化與發(fā)育過程中具有相當?shù)谋Ｊ匦?。AGO1，QDE2,和RDE1在植物的轉基因沉默、真菌的壓抑現(xiàn)象和動物的RNAi中起著相似的作用。Boutla等從產(chǎn)生基因沉默的植物中提取RNA,在注射到線蟲后引起了特異基因的沉默。但不同物種間在RNAi上仍有較大的差異。在哺乳動物細胞中用21個堿基對的雙鏈RNA可以引起特異的抑制反應，而較長的雙鏈RNA（超過30個堿基對）轉染哺乳動物細胞會引起非特異的基因抑制，這和在其他生物中的特異抑制不同。這種抑制可能是由于一種抗病毒應答反應造成。長的雙鏈RNA激活蛋白激酶PKR,激活的PKR通過一系列的磷酸化使翻譯起始因子eIF2a失活，導致翻譯抑制或者長dsRNAs激活RNaseL,導致非特異的RNA降解。2.3RNAi的特點RNAi所產(chǎn)生的基因沉默具有如下特點：1） 高效性。Elbashir等在研究中發(fā)現(xiàn)分別為25nmol/L與100nmol/L的起始雙鏈RNA產(chǎn)生的結果是一樣的，只是高濃度起始的更有效些。將雙鏈RNA濃度降低到1.5nmol/L時產(chǎn)生的基因沉默效果變化不大，只有當濃度降低到0.05nmol/L時，沉默的效果才消失。Holen等也證實1?100nmol/L的雙鏈RNA濃度對基因沉默的效果是一致的。這說明雙鏈RNA介導的基因沉默效率是相當高的。2） 需要ATP。Zamore等認為RNAi過程中至少有2個步驟需要能量的供給：一是長的雙鏈RNA被Dicer所酶切產(chǎn)生雙鏈RNA；二是在雙鏈RNA與RISC結合解鏈后形成有活性的RISC。3） 特異性。Elbashir等和Brummelkamp等發(fā)現(xiàn)在21?23個堿基對中有1?2個堿基錯配會大大降低對靶mRNA的降解效果。4） 位置效應。Holen等根據(jù)人TF（tissuefactor）不同的位置各合成了4組雙鏈RNA來檢測不同位置的雙鏈RNA對基因沉默效率的影響。在不同濃度和不同類型的細胞中，hTF167i和hTF372i能夠抑制85%?90%的基因活性，hTF562i只能抑制部分基因活性，而hTF478i則幾乎沒有抑制基因的活性。他們還以hTF167為中心依次相差3個堿基對在其左右各合成了幾組雙鏈RNA,有趣的是它們所能抑制該基因活性的能力以hTF167為中心依次遞減。特別是hTF158i和hTF161i只與hTF167i相距9個和6個堿基，但它們幾乎沒有抑制該基因活性的能力。結果還表明雙鏈RNA對mRNA的結合部位有堿基偏好性，相對而言，GC含量較低的mRNA被沉默效果較好。5） 競爭效應。Hoten等將10nmol/L和30nmol/L的hTF167i相比，兩者的沉默基因效果無差異，但將20nmol/L基因抑制效果很差的PSK314i和10nmol/L的hTF167i相混和后，hTF167i產(chǎn)生的抑制效果明顯降低。6） 可傳播性。在線蟲中，雙鏈RNA可以從起始位置傳播到遠的地方，甚至于全身。Feinberg和Hunter在線蟲細胞膜上發(fā)現(xiàn)一種跨膜蛋白SID1，它可以將雙鏈RNA轉運出細胞，因此系統(tǒng)性的RNAi包括了SID1介導的雙鏈RNA在細胞間的運輸。但在果蠅上并未發(fā)現(xiàn)有此基因的同源物，因此在果蠅上通過注射產(chǎn)生的RNAi不能擴散。2.4RNAi的生物學功能從低等的真菌到高等的哺乳動物都有RNAi,在不同的物種間既有差異，又有很高的保守性，這說明RNAi應該出現(xiàn)在生命出現(xiàn)的早期，它的存在是生物進化與發(fā)育的重要組成部分。目前來看，RNAi的生物學功能主要表現(xiàn)在如下3個方面：1） 一種抗病毒的應答反應。真核生物也編碼類似RdRPs的酶，它們與病毒的RdRPs沒有同源性，但兩者在功能上卻有很多相似的地方。rde-2，rde-3和mut-7對于線蟲PTGS是必須的，它們同時在RNAi中起著關鍵作用，因此對RNAi和PTGS來說，這是兩者在功能上的相似之處。煙草的RdRPs基因NtRdRP1能被病毒侵染和水楊酸所誘導，在它被反義RNA沉默后，突變株系中病毒RNA的積累很快，并且產(chǎn)生了很嚴重的感病反應。2） 基因組的免疫系統(tǒng)。在復雜的基因組中存在著許多重復因子，包括數(shù)目眾多的轉座子。研究中發(fā)現(xiàn)，RNAi經(jīng)常由重復轉座因子引起，并能抑制轉座子活性。在線蟲的研究中，缺失RNAi的蟲體表現(xiàn)出了高頻的轉座子活性。在植物細胞中發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA能夠誘導同源的基因序列甲基化，Pelissier等在用番茄的類病毒載體侵染煙草時發(fā)現(xiàn)，在侵染過程中，與類病毒互補的大約30個堿基對的基因組序列發(fā)生甲基化。在PTGS中常常伴隨有基因組的甲基化，當雙鏈RNA與啟動子而非表達序列區(qū)域有同源性時，常常表現(xiàn)為基因的甲基化，基因在轉錄水平被抑制。Schramke等和Zilberman等分別在酵母和擬南芥中鑒定了幾個參與RNAi的基因，并證實這些基因主要是甲基化酶，它們的主要功能是由長的雙鏈RNA誘導相應的基因組甲基化，使其在轉錄水平沉默。Kovalchuk等也證實病菌的侵染能誘使植物的DNA發(fā)生重排，這個過程中有與RNAi相關基因的參與。3） 調(diào)節(jié)基因的時空表達。許多在RNAi的過程中起著關鍵作用的基因在生物的發(fā)育過程中同樣起著重要作用，它們的突變往往造成發(fā)育的變異，如擬南芥中的ago1突變體表現(xiàn)為共抑制缺陷的同時也表現(xiàn)為葉發(fā)育缺陷，因此人們認為與RNAi相關的一些酶或者過程可能也參與了發(fā)育調(diào)控過程。VOlpe等發(fā)現(xiàn)酵母參與RNAi的Dicer和RdRPs的基因同源序列的去除會導致一系列的生理異常，主要表現(xiàn)為著絲粒的異染色質(zhì)重復序列的轉錄本異常積累，同時插入著絲粒區(qū)的外源基因開始不受抑制地表達，并且伴隨著組蛋白H3賴氨酸-9的去甲基化和著絲粒不能進行配對。因此RNAi在保持著絲粒區(qū)重復序列的異染色質(zhì)狀態(tài)，保證細胞的正常分裂中起著重要作用。此外Glazov在擬南芥中鑒別到1個與PTGS和RNAi相關的基因（WernerSyndrome-likeexonuclease（WEX）gene），這個基因與人的WernerSyndromeprotein（WRN）相似，具有RNaseD的結構域，但缺乏雙鏈RNA解鏈的結構域，它可以與RNA解旋酶互作來參與PTGS和RNAi它的缺失可以造成擬南芥提前開花。3RNAi在植物遺傳改良中的應用3.1雙鏈RNA的合成對于線蟲而言，雙鏈RNA在生物體中的表達通過注射或者喂食的方法都可以產(chǎn)生很好的效果。但這種簡單有效的方法對于其它生物來說并不可行。對于植物和哺乳動物來說，要有穩(wěn)定的抑制效果就必須有穩(wěn)定表達雙鏈RNA的合適方法，這還得要借助遺傳轉化的方法。目前已經(jīng)建立了多種適合產(chǎn)生雙鏈RNA的方法。1） 化學合成。早期的RNAi研究中主要是在體外分別合成2條RNA單鏈，然后經(jīng)過退火后形成雙鏈RNA。這種方法產(chǎn)生的雙鏈RNA成本高，且對操作要求嚴格。2） 體外生物合成?？梢酝ㄟ^單啟動子或雙啟動子借助于原核生物的體外高效表達大量合成單鏈或雙鏈RNA。這種方法簡單、快速，而且不受量的限制。3） 體內(nèi)生物合成。將序列構建在合適的表達載體上后，通過遺傳轉化的方法導人生物體內(nèi)，可以組成型表達，也可以通過啟動子的調(diào)控來控制雙鏈RNA的合成。對于大多數(shù)生物來說，注射雙鏈RNA產(chǎn)生的抑制效果是暫時性的，隨著細胞的增殖，RNAi產(chǎn)生的沉默效果逐漸減弱直至消失。因此人們目前研究基因的表達與調(diào)控時主要還是選擇了第3種產(chǎn)生雙鏈RNA的方法。根據(jù)研究的對象和要求，人們已經(jīng)設計出了不同的方法在哺乳動物和植物上應用。植物的功能基因學研究除了對RNAi的產(chǎn)生機制及生物學功能研究外，人們更關心的是它廣泛的應用前景。在老鼠、擬南芥、水稻和人等的基因組測序完成后，生物學研究進入后基因組時代。人們研究的重點放在基因的功能注釋，基因的表達調(diào)控及改造以及基因間的相互聯(lián)系研究上。RNAi為大規(guī)模高效及復雜的功能基因組學研究提供了一個便捷的平臺。Kamath等構建了一個可重復利用的線蟲RNAi文庫，通過對線蟲19427個候選基因進行功能研究，86%的基因功能被抑制，其中只有1722個基因能在形態(tài)上看到變異。他們同時發(fā)現(xiàn)一些具有相似功能的基因成簇地分布在不同的染色體上，有的區(qū)域甚至跨躍了幾百萬個堿基，這些基因具有相同的表達譜。Kaveh等同樣利用該技術對線蟲的16757個基因進行沉默，他們得到了305個失活后導致身體脂肪減少的基因和112個失活后導致身體脂肪增加的基因，其中部分基因與脂肪代謝調(diào)節(jié)基因同源。Waterhouse等認為RNAi對于植物的全基因組基因的高通量分析同樣應該有效。在水稻和擬南芥的基因組測序完成后，人們獲得了眾多的候選基因，RNAi為注釋和認識這些基因在植物體中所起的作用提供了一種快速、高效的鑒定方法。對小麥、棉花等異源多倍體基因組測序是一項艱巨的工作。生物之間由于進化的關系或多或少在某些方面具有一定的同源性，因此在比較接近的物種可以通過比較基因組來加快其研究進展。但有時通過傳統(tǒng)的基因敲除或反義RNA的方法來使基因沉默以研究基因家族的功能往往并不能達到效果。Lawrence等在Arabidopsissuecica使用RNAi的方法證實了通過合理設計雙鏈RNA就可以有效地同時沉默1個基因家族，這為多倍體物種的功能基因組學研究指明了方向。利用RNAi在水稻、蕓薑屬和油菜以及煙草上已經(jīng)進行了一些基因功能驗證的相關研究。植物的品質(zhì)改良植物產(chǎn)品為人們的生產(chǎn)生活提供了必要的物質(zhì)基礎，隨著生活水平的提高，人們對品質(zhì)的要求也日益提高。例如油料產(chǎn)品中的硫甙含量、不飽和脂肪酸的含量，咖啡中的咖啡因的含量等。傳統(tǒng)育種很難同時改變作物多個品質(zhì)性狀，如營養(yǎng)成分的組成比例等。人們對一些生化物質(zhì)代謝途徑的認識使得分子改良成為可能。Liu等利用RNAi技術對棉籽油的成份進行了改良，提高了棉花籽油中硬脂酸與油酸的比例。普通棉籽油含26%的棕櫚酸、15%油酸及58%亞麻油酸。加工過的棉籽油會產(chǎn)生反式脂肪酸，生成膽固醇，增加人體的心血管疾病發(fā)病幾率。因此目前傾向于使用低棕櫚酸、高油酸及硬脂酸的油類。棉花種子的硬脂酸經(jīng)棕櫚酸合成后，經(jīng)由&9去飽和酶形成油酸，再由&12去飽和酶作用形成亞麻油酸，最后形成次亞麻油酸，各脂肪酸的含量比例會因參與酶活性的不同而有所差異。其中ghSAD-1與ghFAD2-1