RNAi及其在植物遺傳改良中的應(yīng)用

RNAi及其在植物遺傳改良中的應(yīng)用123RNAi即RNA干涉(或RNA干擾)是指雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞后并被切割成21?23個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的短核苷酸雙鏈，在其它作用因子的參與下能夠特異地與其同源的mRNA結(jié)合并導(dǎo)致其降解，從而使得內(nèi)源基因不能表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)源基因的沉默。自1998年Fire等首次在線蟲中發(fā)現(xiàn)并闡明以來(lái)，RNAi已經(jīng)在其它動(dòng)物、植物和真菌中被證實(shí)。研究表明參與該過(guò)程的許多基因具有高度的保守性，這可能是生物調(diào)控基因表達(dá)及抵御病毒侵染或轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)DNA突變的一種共有的古老生理機(jī)制。RNAi所具有的特異性、穩(wěn)定性、高效、快速以及不改變基因組的遺傳組成等特性為人們研究未知功能的基因提供了新的反向遺傳學(xué)手段。在擬南芥和水稻等基因組測(cè)序完成后，RNAi這一新技術(shù)在植物功能基因組學(xué)研究及植物的遺傳改良等方面提供了一個(gè)強(qiáng)有力的手段。植物的轉(zhuǎn)基因沉默Napoli等將1個(gè)查爾酮合成酶基因(chs)置于1個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子后導(dǎo)人矮牽牛(Petuniahybrida)，試圖加深花朵的紫顏色。結(jié)果部分花的顏色并非期待中的深紫色，而是形成了花斑狀甚至白色，而且這種性狀可以遺傳。因?yàn)閷?dǎo)入的基因和其同源的內(nèi)源基因同時(shí)都被抑制，他們將這種現(xiàn)象命名為共抑制(co-suppression)。類似的結(jié)果同樣在真菌脈胞菌(Neurosporacrassa)中和其它轉(zhuǎn)基因植物中存在。對(duì)于部分轉(zhuǎn)基因植物來(lái)說(shuō)，基因沉默可能是因?yàn)樘禺惢虻募谆鴮?dǎo)致，這被稱為轉(zhuǎn)錄水平基因沉默。但確實(shí)部分植物中的基因沉默是在轉(zhuǎn)錄后發(fā)生的，這被稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默。實(shí)驗(yàn)表明在發(fā)生PTGS的個(gè)體中同源轉(zhuǎn)錄確實(shí)存在，但是很快在胞漿中被降解，沒(méi)有積聚。Palauqui等進(jìn)一步證實(shí)，在植物中將出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因沉默的植株嫁接到另一沒(méi)有基因沉默的轉(zhuǎn)基因植株中同樣可以導(dǎo)致PTGS，但對(duì)非轉(zhuǎn)基因植株卻無(wú)效。Cogoni等證實(shí)PTGS由一種可擴(kuò)散的反式作用分子所介導(dǎo)。RNAi及其機(jī)制RNAi的發(fā)現(xiàn)Guo等在對(duì)線蟲基因par-1進(jìn)行功能研究時(shí)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)他們給線蟲注射par-1的反義RNA以阻斷該基因的表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)作為正對(duì)照的正義RNA和反義RNA得到的結(jié)果相似，即兩者都阻斷了par-1基因的表達(dá)。Fire等分別將正義RNA、反義RNA和雙鏈RNA注射進(jìn)線蟲中來(lái)研究unc22，fem1,unc54和hlh1等基因的功能。他們發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA比任一單鏈單獨(dú)使用所產(chǎn)生的基因沉默效果要好的多，雙鏈RNA能產(chǎn)生高效和特異的效果，并且每個(gè)細(xì)胞只需要幾個(gè)雙鏈分子，這種干涉的效果還可以持續(xù)到其子代，他們將這種現(xiàn)象稱為RNA干涉。Timmons等在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)RNAi具有擴(kuò)散性，將雙鏈RNA注射到線蟲的某一部位后可以在全身其它細(xì)胞中看到干涉現(xiàn)象，并且他們通過(guò)喂食的方法將雙鏈RNA導(dǎo)人線蟲體內(nèi)也獲得了類似的結(jié)果。RNAi的產(chǎn)生機(jī)制Hamilton等和Ketting等分別在發(fā)生共抑制的煙草和西紅柿中鑒定了一些大約25個(gè)堿基大小的RNA,這些RNA分別與沉默基因的正義鏈和反義鏈互補(bǔ)。Zamore等在果蠅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)被注射進(jìn)入的雙鏈RNA被切割為21?23堿基長(zhǎng)短的雙鏈RNA片段。同時(shí)與雙鏈RNA同源的內(nèi)源基因的mRNA，只在和雙鏈RNA對(duì)應(yīng)的部位被切割成為21?23核苷酸長(zhǎng)的片段，造成mRNA在細(xì)胞中的含量大大降低，因此他們認(rèn)為這些siRNA在RNAi過(guò)程中起著重要作用。生化鑒定表明這些siRNA具有一些共性：一般為長(zhǎng)21?23個(gè)堿基對(duì)的雙鏈；3'端具有2個(gè)突出的堿基，多為尿嘧啶，也可以是胸腺嘧啶且具有羥基；5'端被磷酸化。這些特點(diǎn)可能是其與別的RNA相區(qū)別，能被特異地識(shí)別。而這一特點(diǎn)也是RNaseIII酶切后的特征。研究表明mRNA被特異性切割發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)雙鏈RNA進(jìn)入細(xì)胞后，能與類似RNaseIII的Dicer結(jié)合，隨即被切割成21?23個(gè)堿基的siRNA。siRNA與RISC（RNAinducedsilencingcomplex）結(jié)合，若雙鏈5'端未被磷酸化，則會(huì)啟動(dòng)其磷酸激酶活性，將其磷酸化并被解螺旋。反義鏈RNA與RISC結(jié)合后將其內(nèi)切酶活性激活，激活的RISC在細(xì)胞質(zhì)中尋找能與反義RNA同源的mRNA，并在雙鏈的中心部位、距雙鏈RNA5'端第10個(gè)堿基處將其切割，從而使mRNA降解。在對(duì)RNAi的研究中，往往一個(gè)細(xì)胞中含有幾個(gè)雙鏈RNA分子就可以將靶基因沉默，即使是沉默高豐度表達(dá)基因也是如此。因此人們推測(cè)在RNAi過(guò)程中還應(yīng)包括一個(gè)雙鏈RNA的復(fù)制過(guò)程。Sijen等認(rèn)為雙鏈RNA在RNAi初期的作用是為RdRP（RNAdependentRNAPolymerase）提供引物，并以靶mRNA為模板合成更多的雙鏈RNA。這一假設(shè)在其它物種中得到證實(shí)。目前人們已經(jīng)在線蟲、果蠅、擬南芥及脈胞菌等物種中鑒定了多個(gè)與RNAi過(guò)程相關(guān)的基因，如線蟲基因ego-1，rde-1和rde-4，脈胞菌的qde-2,擬南芥的ago1基因等。RNAi在生物體的進(jìn)化與發(fā)育過(guò)程中具有相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦?。AGO1，QDE2,和RDE1在植物的轉(zhuǎn)基因沉默、真菌的壓抑現(xiàn)象和動(dòng)物的RNAi中起著相似的作用。Boutla等從產(chǎn)生基因沉默的植物中提取RNA,在注射到線蟲后引起了特異基因的沉默。但不同物種間在RNAi上仍有較大的差異。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中用21個(gè)堿基對(duì)的雙鏈RNA可以引起特異的抑制反應(yīng)，而較長(zhǎng)的雙鏈RNA（超過(guò)30個(gè)堿基對(duì)）轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞會(huì)引起非特異的基因抑制，這和在其他生物中的特異抑制不同。這種抑制可能是由于一種抗病毒應(yīng)答反應(yīng)造成。長(zhǎng)的雙鏈RNA激活蛋白激酶PKR,激活的PKR通過(guò)一系列的磷酸化使翻譯起始因子eIF2a失活，導(dǎo)致翻譯抑制或者長(zhǎng)dsRNAs激活RNaseL,導(dǎo)致非特異的RNA降解。2.3RNAi的特點(diǎn)RNAi所產(chǎn)生的基因沉默具有如下特點(diǎn)：1） 高效性。Elbashir等在研究中發(fā)現(xiàn)分別為25nmol/L與100nmol/L的起始雙鏈RNA產(chǎn)生的結(jié)果是一樣的，只是高濃度起始的更有效些。將雙鏈RNA濃度降低到1.5nmol/L時(shí)產(chǎn)生的基因沉默效果變化不大，只有當(dāng)濃度降低到0.05nmol/L時(shí)，沉默的效果才消失。Holen等也證實(shí)1?100nmol/L的雙鏈RNA濃度對(duì)基因沉默的效果是一致的。這說(shuō)明雙鏈RNA介導(dǎo)的基因沉默效率是相當(dāng)高的。2） 需要ATP。Zamore等認(rèn)為RNAi過(guò)程中至少有2個(gè)步驟需要能量的供給：一是長(zhǎng)的雙鏈RNA被Dicer所酶切產(chǎn)生雙鏈RNA；二是在雙鏈RNA與RISC結(jié)合解鏈后形成有活性的RISC。3） 特異性。Elbashir等和Brummelkamp等發(fā)現(xiàn)在21?23個(gè)堿基對(duì)中有1?2個(gè)堿基錯(cuò)配會(huì)大大降低對(duì)靶mRNA的降解效果。4） 位置效應(yīng)。Holen等根據(jù)人TF（tissuefactor）不同的位置各合成了4組雙鏈RNA來(lái)檢測(cè)不同位置的雙鏈RNA對(duì)基因沉默效率的影響。在不同濃度和不同類型的細(xì)胞中，hTF167i和hTF372i能夠抑制85%?90%的基因活性，hTF562i只能抑制部分基因活性，而hTF478i則幾乎沒(méi)有抑制基因的活性。他們還以hTF167為中心依次相差3個(gè)堿基對(duì)在其左右各合成了幾組雙鏈RNA,有趣的是它們所能抑制該基因活性的能力以hTF167為中心依次遞減。特別是hTF158i和hTF161i只與hTF167i相距9個(gè)和6個(gè)堿基，但它們幾乎沒(méi)有抑制該基因活性的能力。結(jié)果還表明雙鏈RNA對(duì)mRNA的結(jié)合部位有堿基偏好性，相對(duì)而言，GC含量較低的mRNA被沉默效果較好。5） 競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)。Hoten等將10nmol/L和30nmol/L的hTF167i相比，兩者的沉默基因效果無(wú)差異，但將20nmol/L基因抑制效果很差的PSK314i和10nmol/L的hTF167i相混和后，hTF167i產(chǎn)生的抑制效果明顯降低。6） 可傳播性。在線蟲中，雙鏈RNA可以從起始位置傳播到遠(yuǎn)的地方，甚至于全身。Feinberg和Hunter在線蟲細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)一種跨膜蛋白SID1，它可以將雙鏈RNA轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，因此系統(tǒng)性的RNAi包括了SID1介導(dǎo)的雙鏈RNA在細(xì)胞間的運(yùn)輸。但在果蠅上并未發(fā)現(xiàn)有此基因的同源物，因此在果蠅上通過(guò)注射產(chǎn)生的RNAi不能擴(kuò)散。2.4RNAi的生物學(xué)功能從低等的真菌到高等的哺乳動(dòng)物都有RNAi,在不同的物種間既有差異，又有很高的保守性，這說(shuō)明RNAi應(yīng)該出現(xiàn)在生命出現(xiàn)的早期，它的存在是生物進(jìn)化與發(fā)育的重要組成部分。目前來(lái)看，RNAi的生物學(xué)功能主要表現(xiàn)在如下3個(gè)方面：1） 一種抗病毒的應(yīng)答反應(yīng)。真核生物也編碼類似RdRPs的酶，它們與病毒的RdRPs沒(méi)有同源性，但兩者在功能上卻有很多相似的地方。rde-2，rde-3和mut-7對(duì)于線蟲PTGS是必須的，它們同時(shí)在RNAi中起著關(guān)鍵作用，因此對(duì)RNAi和PTGS來(lái)說(shuō)，這是兩者在功能上的相似之處。煙草的RdRPs基因NtRdRP1能被病毒侵染和水楊酸所誘導(dǎo)，在它被反義RNA沉默后，突變株系中病毒RNA的積累很快，并且產(chǎn)生了很嚴(yán)重的感病反應(yīng)。2） 基因組的免疫系統(tǒng)。在復(fù)雜的基因組中存在著許多重復(fù)因子，包括數(shù)目眾多的轉(zhuǎn)座子。研究中發(fā)現(xiàn)，RNAi經(jīng)常由重復(fù)轉(zhuǎn)座因子引起，并能抑制轉(zhuǎn)座子活性。在線蟲的研究中，缺失RNAi的蟲體表現(xiàn)出了高頻的轉(zhuǎn)座子活性。在植物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA能夠誘導(dǎo)同源的基因序列甲基化，Pelissier等在用番茄的類病毒載體侵染煙草時(shí)發(fā)現(xiàn)，在侵染過(guò)程中，與類病毒互補(bǔ)的大約30個(gè)堿基對(duì)的基因組序列發(fā)生甲基化。在PTGS中常常伴隨有基因組的甲基化，當(dāng)雙鏈RNA與啟動(dòng)子而非表達(dá)序列區(qū)域有同源性時(shí)，常常表現(xiàn)為基因的甲基化，基因在轉(zhuǎn)錄水平被抑制。Schramke等和Zilberman等分別在酵母和擬南芥中鑒定了幾個(gè)參與RNAi的基因，并證實(shí)這些基因主要是甲基化酶，它們的主要功能是由長(zhǎng)的雙鏈RNA誘導(dǎo)相應(yīng)的基因組甲基化，使其在轉(zhuǎn)錄水平沉默。Kovalchuk等也證實(shí)病菌的侵染能誘使植物的DNA發(fā)生重排，這個(gè)過(guò)程中有與RNAi相關(guān)基因的參與。3） 調(diào)節(jié)基因的時(shí)空表達(dá)。許多在RNAi的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用的基因在生物的發(fā)育過(guò)程中同樣起著重要作用，它們的突變往往造成發(fā)育的變異，如擬南芥中的ago1突變體表現(xiàn)為共抑制缺陷的同時(shí)也表現(xiàn)為葉發(fā)育缺陷，因此人們認(rèn)為與RNAi相關(guān)的一些酶或者過(guò)程可能也參與了發(fā)育調(diào)控過(guò)程。VOlpe等發(fā)現(xiàn)酵母參與RNAi的Dicer和RdRPs的基因同源序列的去除會(huì)導(dǎo)致一系列的生理異常，主要表現(xiàn)為著絲粒的異染色質(zhì)重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄本異常積累，同時(shí)插入著絲粒區(qū)的外源基因開(kāi)始不受抑制地表達(dá)，并且伴隨著組蛋白H3賴氨酸-9的去甲基化和著絲粒不能進(jìn)行配對(duì)。因此RNAi在保持著絲粒區(qū)重復(fù)序列的異染色質(zhì)狀態(tài)，保證細(xì)胞的正常分裂中起著重要作用。此外Glazov在擬南芥中鑒別到1個(gè)與PTGS和RNAi相關(guān)的基因（WernerSyndrome-likeexonuclease（WEX）gene），這個(gè)基因與人的WernerSyndromeprotein（WRN）相似，具有RNaseD的結(jié)構(gòu)域，但缺乏雙鏈RNA解鏈的結(jié)構(gòu)域，它可以與RNA解旋酶互作來(lái)參與PTGS和RNAi它的缺失可以造成擬南芥提前開(kāi)花。3RNAi在植物遺傳改良中的應(yīng)用3.1雙鏈RNA的合成對(duì)于線蟲而言，雙鏈RNA在生物體中的表達(dá)通過(guò)注射或者喂食的方法都可以產(chǎn)生很好的效果。但這種簡(jiǎn)單有效的方法對(duì)于其它生物來(lái)說(shuō)并不可行。對(duì)于植物和哺乳動(dòng)物來(lái)說(shuō)，要有穩(wěn)定的抑制效果就必須有穩(wěn)定表達(dá)雙鏈RNA的合適方法，這還得要借助遺傳轉(zhuǎn)化的方法。目前已經(jīng)建立了多種適合產(chǎn)生雙鏈RNA的方法。1） 化學(xué)合成。早期的RNAi研究中主要是在體外分別合成2條RNA單鏈，然后經(jīng)過(guò)退火后形成雙鏈RNA。這種方法產(chǎn)生的雙鏈RNA成本高，且對(duì)操作要求嚴(yán)格。2） 體外生物合成。可以通過(guò)單啟動(dòng)子或雙啟動(dòng)子借助于原核生物的體外高效表達(dá)大量合成單鏈或雙鏈RNA。這種方法簡(jiǎn)單、快速，而且不受量的限制。3） 體內(nèi)生物合成。將序列構(gòu)建在合適的表達(dá)載體上后，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)人生物體內(nèi)，可以組成型表達(dá)，也可以通過(guò)啟動(dòng)子的調(diào)控來(lái)控制雙鏈RNA的合成。對(duì)于大多數(shù)生物來(lái)說(shuō)，注射雙鏈RNA產(chǎn)生的抑制效果是暫時(shí)性的，隨著細(xì)胞的增殖，RNAi產(chǎn)生的沉默效果逐漸減弱直至消失。因此人們目前研究基因的表達(dá)與調(diào)控時(shí)主要還是選擇了第3種產(chǎn)生雙鏈RNA的方法。根據(jù)研究的對(duì)象和要求，人們已經(jīng)設(shè)計(jì)出了不同的方法在哺乳動(dòng)物和植物上應(yīng)用。植物的功能基因?qū)W研究除了對(duì)RNAi的產(chǎn)生機(jī)制及生物學(xué)功能研究外，人們更關(guān)心的是它廣泛的應(yīng)用前景。在老鼠、擬南芥、水稻和人等的基因組測(cè)序完成后，生物學(xué)研究進(jìn)入后基因組時(shí)代。人們研究的重點(diǎn)放在基因的功能注釋，基因的表達(dá)調(diào)控及改造以及基因間的相互聯(lián)系研究上。RNAi為大規(guī)模高效及復(fù)雜的功能基因組學(xué)研究提供了一個(gè)便捷的平臺(tái)。Kamath等構(gòu)建了一個(gè)可重復(fù)利用的線蟲RNAi文庫(kù)，通過(guò)對(duì)線蟲19427個(gè)候選基因進(jìn)行功能研究，86%的基因功能被抑制，其中只有1722個(gè)基因能在形態(tài)上看到變異。他們同時(shí)發(fā)現(xiàn)一些具有相似功能的基因成簇地分布在不同的染色體上，有的區(qū)域甚至跨躍了幾百萬(wàn)個(gè)堿基，這些基因具有相同的表達(dá)譜。Kaveh等同樣利用該技術(shù)對(duì)線蟲的16757個(gè)基因進(jìn)行沉默，他們得到了305個(gè)失活后導(dǎo)致身體脂肪減少的基因和112個(gè)失活后導(dǎo)致身體脂肪增加的基因，其中部分基因與脂肪代謝調(diào)節(jié)基因同源。Waterhouse等認(rèn)為RNAi對(duì)于植物的全基因組基因的高通量分析同樣應(yīng)該有效。在水稻和擬南芥的基因組測(cè)序完成后，人們獲得了眾多的候選基因，RNAi為注釋和認(rèn)識(shí)這些基因在植物體中所起的作用提供了一種快速、高效的鑒定方法。對(duì)小麥、棉花等異源多倍體基因組測(cè)序是一項(xiàng)艱巨的工作。生物之間由于進(jìn)化的關(guān)系或多或少在某些方面具有一定的同源性，因此在比較接近的物種可以通過(guò)比較基因組來(lái)加快其研究進(jìn)展。但有時(shí)通過(guò)傳統(tǒng)的基因敲除或反義RNA的方法來(lái)使基因沉默以研究基因家族的功能往往并不能達(dá)到效果。Lawrence等在Arabidopsissuecica使用RNAi的方法證實(shí)了通過(guò)合理設(shè)計(jì)雙鏈RNA就可以有效地同時(shí)沉默1個(gè)基因家族，這為多倍體物種的功能基因組學(xué)研究指明了方向。利用RNAi在水稻、蕓薑屬和油菜以及煙草上已經(jīng)進(jìn)行了一些基因功能驗(yàn)證的相關(guān)研究。植物的品質(zhì)改良植物產(chǎn)品為人們的生產(chǎn)生活提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)，隨著生活水平的提高，人們對(duì)品質(zhì)的要求也日益提高。例如油料產(chǎn)品中的硫甙含量、不飽和脂肪酸的含量，咖啡中的咖啡因的含量等。傳統(tǒng)育種很難同時(shí)改變作物多個(gè)品質(zhì)性狀，如營(yíng)養(yǎng)成分的組成比例等。人們對(duì)一些生化物質(zhì)代謝途徑的認(rèn)識(shí)使得分子改良成為可能。Liu等利用RNAi技術(shù)對(duì)棉籽油的成份進(jìn)行了改良，提高了棉花籽油中硬脂酸與油酸的比例。普通棉籽油含26%的棕櫚酸、15%油酸及58%亞麻油酸。加工過(guò)的棉籽油會(huì)產(chǎn)生反式脂肪酸，生成膽固醇，增加人體的心血管疾病發(fā)病幾率。因此目前傾向于使用低棕櫚酸、高油酸及硬脂酸的油類。棉花種子的硬脂酸經(jīng)棕櫚酸合成后，經(jīng)由&9去飽和酶形成油酸，再由&12去飽和酶作用形成亞麻油酸，最后形成次亞麻油酸，各脂肪酸的含量比例會(huì)因參與酶活性的不同而有所差異。其中g(shù)hSAD-1與ghFAD2-1