分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)理論考試

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)理論考試分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)理論考試分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)理論考試V:1.0精細(xì)整理，僅供參考分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)理論考試日期：20xx年X月2012-2013學(xué)年第二學(xué)期分子生物實(shí)驗(yàn)考試題庫PCR原理是什么？答：PCR技術(shù)是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法。它的特異性是由兩個(gè)人工合成的引物序列決定。引物就是與待擴(kuò)增DNA片段兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苷酸。雙鏈DNA是在臨近沸點(diǎn)的溫度下加熱時(shí)便會(huì)分離成兩條單鏈DNA分子（變性），兩引物分別與兩條DNA的兩側(cè)序列特異復(fù)性，在適宜條件下，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷三磷酸，在引物的引導(dǎo)下，按5'→3'方向復(fù)制互補(bǔ)DNA，即引物的延伸。在適宜的條件下，這種熱變性→復(fù)性→延伸的過程不斷循環(huán)重復(fù)，前一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物DNA可作為后一個(gè)循環(huán)的模板DNA參與DNA合成，使產(chǎn)物DNA的量按2^n方式擴(kuò)增。PCR一般體系應(yīng)加入哪些試劑？答：10*PCR緩沖液（含Mg+）、模板DNA、四種dNTP、一對(duì)引物、耐熱Taq聚合酶。PCR防止其它DNA污染，應(yīng)注意哪些問題？

答：標(biāo)本放置時(shí)密封要嚴(yán)避免溢于容器外，容器要清潔避免造成相互間交叉污染；移液器使用要規(guī)范避免污標(biāo)本間污染;無菌工作臺(tái)操作，避免氣體中有雜菌。影響PCR產(chǎn)物產(chǎn)量的因素主要有哪些？答：引物、酶的種類及濃度、dNTP的質(zhì)量（優(yōu)劣）與濃度、模板核酸的量與純化程度、Mg2+濃度、溫度與時(shí)間、循環(huán)次數(shù)。引物設(shè)計(jì)應(yīng)注意哪些問題？答：①引物長度不宜過長20bp左右較佳；②引物擴(kuò)增片段的長度以200-500為宜；③引物堿基的中G+C的含量應(yīng)在40-60%為宜，G+C太少則擴(kuò)增效果不佳，G+C過多則易出現(xiàn)非特異條帶；④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩天引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)否則會(huì)形成二聚體結(jié)構(gòu)；⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。簡述克隆某一原核生物基因片段一般操作步驟？

答：克隆某一原核生物基因片段是可用PCR技術(shù)對(duì)基因進(jìn)行大量擴(kuò)增，首先準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)材料大體為：需擴(kuò)增的模板DNA、DNA聚合酶、dNTP混合液、PCR緩沖液、引物等、其過程大體分為3個(gè)步驟：第一步：變形：通過加熱使DNA模板雙螺旋鏈解離為單鏈，第二步：退火：當(dāng)溫度突然降低時(shí)。由于模板DNA結(jié)構(gòu)復(fù)雜難再互補(bǔ)，而引物建構(gòu)簡單且數(shù)量巨多易于模板DNA互補(bǔ)雜交從而使引物結(jié)合到模板上DNA上，第三部：延生：在DNA聚合酶和四種底物及鎂離子存在條件下DNA連開始延伸。以上3個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)，數(shù)小時(shí)后即可得到大量擴(kuò)增的目的片段。什么是質(zhì)粒質(zhì)粒的基本性質(zhì)有哪些

答：a質(zhì)粒是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器和細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的脫氧核糖核酸(DNA)分子?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來專指細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。b具有復(fù)制起點(diǎn)。攜帶易于篩選的選擇標(biāo)記。具有多種限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)。具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量和較高的拷貝數(shù)。質(zhì)粒抽提實(shí)驗(yàn)中溶液I、II、III各有什么作用？答：溶液I:由葡萄糖,EDTA,TrisCl組成.葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,減少抽提過程中的機(jī)械剪切作用,防止破壞質(zhì)粒DNA;EDTA的作用是絡(luò)和掉Mg2+等二價(jià)金屬離子,防止DNA酶對(duì)質(zhì)粒分子的降解作用;TrisCl能使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍。溶液II:由SDS與NaOH組成.SDS的作用是解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性;NaOH(pH>12)的作用是破壞氫鍵,使DNA分子變性。溶液III:由KAc與HAc組成,是pH值為5.5的高鹽溶液.能中和溶液II的堿性,使染色體DNA復(fù)性而發(fā)生纏繞并使質(zhì)粒DNA復(fù)性.K+離子會(huì)與SDS形成溶解度很低的鹽并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去.溶液中的染色體DNA也會(huì)與蛋白質(zhì)-SDS形成相互纏繞的大分子物質(zhì),很容易與小分子的質(zhì)粒DNA分離,此外,高鹽溶液也有利于各種沉淀的形成。堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA的基本原理是什么？答：堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA之間在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而達(dá)到分離目的。PH介于12.0~12.5時(shí)，線性DNA變性，雙鏈打開，而質(zhì)粒DNA雖變性，但兩條互補(bǔ)鏈彼此纏繞，當(dāng)PH恢復(fù)到中性時(shí)，質(zhì)粒DNA可迅速準(zhǔn)確的完成復(fù)性，而線性DNA復(fù)性較困難，纏繞成網(wǎng)狀，通過離心可沉淀除去。在堿裂解法提取質(zhì)粒DNA操作中應(yīng)注意哪些問題？答：（1）正確使用移液器。（2）溶液ll必須新鮮配制。（3）加入酚-氯仿后必須充分混勻。（4）混勻的過程不能太過劇烈。（5）每次棄上清液時(shí)都應(yīng)用移液器吸去管壁上黏附的水珠。（6）吸取酚-氯仿溶液時(shí)要將Tip頭插入液體分層的下側(cè)。【可根據(jù)第一次試驗(yàn)自己寫的注意事項(xiàng)進(jìn)行補(bǔ)充】11、在堿裂解法提取質(zhì)粒DNA時(shí)，酚/氯仿的作用是什么？答：酚是強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)變性劑，能有效使蛋白質(zhì)變性而除去，氯仿有強(qiáng)烈的脂溶性，去除脂類雜質(zhì)，本身酚：氯仿：異戊醇=25：24：1的主要作用是抽提蛋白質(zhì)堿裂解法提取的質(zhì)粒DNA分子一般有幾種構(gòu)象電泳時(shí)移動(dòng)速率有何差異

答：超螺旋DNA＞線性DNA＞開環(huán)DNA提取植物基因組DNA的基本原理是什么在操作過程中應(yīng)該注意什么

答：①基本原理:利用液氮對(duì)植物組織進(jìn)行研磨，從而破碎細(xì)胞。細(xì)胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液經(jīng)異丙醇沉淀。②注意事項(xiàng):⑴材料要新鮮嬌嫩，葉片研磨地越細(xì)越好；⑵操作應(yīng)為無菌操作；⑶操作應(yīng)溫和，不宜劇烈晃動(dòng)；⑷注意移液器的正確使用。在植物基因組提取過程中，DNA降解的可能原因？答：原因:⑴從植物中提取DNA時(shí)沒對(duì)細(xì)胞內(nèi)的DNA酶進(jìn)行滅活；⑵操作過程中被細(xì)菌污染了；⑶口水等含酶物質(zhì)飛入樣品中；⑷溫度、PH等變化過于劇烈。在植物基因組提取過程中，提高DNA產(chǎn)量的措施？答：應(yīng)當(dāng)選取幼嫩的葉片，因?yàn)橛啄廴~片中的DNA含量高些；組織抽提前要保存在液氮中，以免DNA被破壞；純化時(shí)注意抑制核酸酶污染，使用EDTA等防止DNA降解；整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)該溫和操作，不能劇烈振蕩，混合過程要輕緩，減少抽提，減少DNA片段被認(rèn)為降解，因?yàn)檫^度振蕩會(huì)使DNA斷裂成小片段。在使用苯酚進(jìn)行DNA提取時(shí)應(yīng)該注意什么？答：酚一定要進(jìn)行堿平衡，苯酚具有高度腐蝕性，飛濺到皮膚、粘膜、眼睛會(huì)對(duì)人體造成損傷，應(yīng)當(dāng)注意防護(hù)；它是出去蛋白質(zhì)的，要充分振蕩使蛋白質(zhì)變性，但不能太劇烈而打斷DNA；離心后應(yīng)該避免再次吸入有機(jī)相的苯酚—氯仿，盡量只取上清，不應(yīng)該讓苯酚最后仍有殘留，需抽提干凈。在提取植物基因組DNA過程中，使用苯酚與氯仿的作用是什么？答：用苯酚和氯仿抽取，去除多余的蛋白，保證提取的基因組較純凈。在植物基因組提取過程中，該如何檢測和保證基因組DNA的質(zhì)量？答：檢測：瓊脂糖凝膠電泳；保證DNA活性:用EDTA抑制DNA酶活性，從而保證DNA不被破壞。什么是限制性內(nèi)切酶？答：限制性內(nèi)切酶是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶，有三種類型，Ⅰ類，Ⅱ類，Ⅲ類，他們都有甲基化修飾功能和限制酶功能，Ⅱ類常用于分子克隆常見的Ⅱ型限制性內(nèi)切酶切割雙鏈DNA后會(huì)產(chǎn)生末端或末端。答：粘性，平21、下列有關(guān)限制性內(nèi)切酶的描述，錯(cuò)誤的是：（C）A．一種限制性內(nèi)切酶只能識(shí)別一種特定的脫氧核苷酸序列B．限制性內(nèi)切酶的活性受溫度的影響C．限制性內(nèi)切酶能識(shí)別和切割RNAD．限制性內(nèi)切酶可以從原核中提取現(xiàn)有一長度為l000bp的DNA分子，用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI酶切后得到的DNA分子仍是l000bp，用KpnI單獨(dú)酶切得到400bp和600bp2種長度的DNA分子．用EcoRI，Kpnl同時(shí)酶切后得到200bp和600bp2種長度的DNA分子。請(qǐng)畫出該DNA可能的酶切圖譜。答：這是個(gè)大小為1000bP的環(huán)形的DNA分子，在1bP處和400bP處分別有一個(gè)KpnⅠ位點(diǎn)，在200bP處有一個(gè)EcoRⅠ位點(diǎn)。23、一個(gè)限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)是5ˊ一G↓GATCC一3ˊ，在質(zhì)粒上有該酶的一個(gè)切點(diǎn)，請(qǐng)畫出質(zhì)粒被該限制性內(nèi)切酶切割后所形成的黏性末端。答：--GGATCC--寫在上面，下面為--CCTAGG--該酶為限制性內(nèi)切酶I24、基因工程中，切割目的基因和載體所用的限制酶及切口必備的特點(diǎn)是(A)A．可用不同的限制性內(nèi)切酶，露出的黏性末端必須相同B．必須用相同的限制性內(nèi)切酶，露出的黏性末端可不相同C．必須用相同的限制性內(nèi)切酶，露出的黏性末端必須相同D．可用不同的限制性內(nèi)切酶，露出不同的黏性末端25、在遺傳工程技術(shù)中，限制性內(nèi)切酶主要用于（D）A.目的基因的提取和導(dǎo)入B.目的基因的導(dǎo)入和檢測C.目的基因與運(yùn)載體結(jié)合和導(dǎo)入D.目的基因的提取和與運(yùn)載體結(jié)合在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，常使用微量移液器，請(qǐng)說明在使用微量移液器時(shí)需要注意什么？答：①確定合適的量程，不可超過量程取液。②取液時(shí)按到第一檔，Tip頭垂直進(jìn)入液面3-5毫米取液。移液器注意不能接觸溶液。③打出液體時(shí)貼壁并有一定角度，要按到第二檔將液體全部壓出。④使用完畢后，打下tip頭，放好移液器?，F(xiàn)有量程為0.1-2.5μl；1-10μl；2.5-20μl；10-200μl；100-1000μl的移液器各一支，請(qǐng)問，當(dāng)吸取0.15μl，0.5μl，5μl，15μl，100μl，750μl液體時(shí)，各需要選取那種最佳量程范圍的移液器？

答：分別是0.1-2.5，0.1-2.5，1-10，2.5-20，10-200，100-1000。本學(xué)期我們學(xué)習(xí)了CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和熱休克法轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA，你還知道哪些方法可以制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的方法？

答：氯化銣法，甘油—聚乙二醇法，一步法在質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌時(shí)，是如何進(jìn)行篩選的？答：因?yàn)橘|(zhì)粒pETBlue-2帶有青霉素抗性基因,所以轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌細(xì)胞能在含羧芐青霉素的瓊脂糖平板上生長形成菌落.所以用含羧芐青霉素的瓊脂糖平板可以篩選出轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌。藍(lán)白班篩選的原理是什么？答：見實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)92面的實(shí)驗(yàn)原理的后半部分在質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，如果將用來浸泡玻璃棒的酒精引燃起火該如何處理？答：用水打濕的毛巾，著火時(shí)用毛巾蓋上就行了衛(wèi)星菌落出現(xiàn)的原因是什么該如何避免

答：①衛(wèi)星菌落是氨芐降解后生長的雜菌。可能是感受態(tài)細(xì)胞的問題也可能是轉(zhuǎn)化過程出現(xiàn)操作失誤例如未在冰中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，感受態(tài)在常溫下放置過久失活，轉(zhuǎn)化后搖菌時(shí)間過短，或者搖床速度過慢，沒有把菌搖起來，如果不是轉(zhuǎn)化過程出現(xiàn)的問題就要進(jìn)一步考慮連接是否正確，連接時(shí)間12~16h，體系一般6ul-10ul，目的片段：載體一般1:3~1:10。②可以將培養(yǎng)時(shí)間控制在12h-16h之間，或者更換抗生素為羧芐青霉素。影響所制備感受態(tài)效率的因素有哪些？答：影響因素有（1）大腸桿菌生長狀態(tài)（2）氯化鈣濃度（3）冰上放置時(shí)間（4）保存溫度

34、轉(zhuǎn)化后為什么要溫育1小時(shí)為什么加入的是無抗培養(yǎng)基？答：第一問：溫育就是讓感受態(tài)恢復(fù)一下狀態(tài)，以及一些相關(guān)抗性基因的表達(dá)。畢竟從-70℃環(huán)境中取出，需一段時(shí)間適應(yīng)才可轉(zhuǎn)化。第二問：因?yàn)榧?xì)胞比較脆弱，加無抗培養(yǎng)基是為了讓細(xì)胞生長，促使在轉(zhuǎn)化過程中獲得的新表型得到表達(dá)。如果實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組本不該長出菌落的平板上長出了一些菌落，你將如何解釋這種現(xiàn)象？答：（1）操作過程儀器、器皿等不是無菌的，出現(xiàn)了一些雜菌和雜DNA的污染（2）細(xì)菌在感受態(tài)時(shí)發(fā)生了一些自然變異，對(duì)所加的抗生素有一定的抗性，所以長出一些菌落（3）所加的抑菌抗生素濃度不夠，不能夠抑制住細(xì)菌的生長（4）一些實(shí)驗(yàn)誤差，錯(cuò)將菌液放錯(cuò)36、在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照平皿應(yīng)有什么樣的結(jié)果如何解釋這個(gè)結(jié)果

答：實(shí)驗(yàn)組中長出菌落而對(duì)照組中無任何菌落生長。在學(xué)習(xí)制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，為什么要保證細(xì)胞密度<108/ml甘油的作用是什么

答：細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期時(shí)為宜，密度過高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率，一次要保證細(xì)胞密度<10^8/ml。甘油的目的是為了防止水在凍結(jié)過程中產(chǎn)生過大的冰晶損傷細(xì)胞，抑制大腸桿菌生長，以便保存。通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，你認(rèn)為自己掌握了哪些實(shí)驗(yàn)技能你對(duì)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)有哪些建議與意見

答：此為主觀題，可結(jié)合所學(xué)知識(shí)發(fā)揮，言之有理即可。（比如凝膠電泳，PCR擴(kuò)增等。）這門課程將分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作的理論與實(shí)踐相結(jié)合，不僅使我在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技能方面得到系統(tǒng)的訓(xùn)練，而且讓我對(duì)具體實(shí)驗(yàn)操作的原理有了清晰地認(rèn)識(shí)。作為一門實(shí)驗(yàn)課，它還鍛煉了我運(yùn)用已學(xué)到的理論知識(shí)和已掌握的實(shí)驗(yàn)技能綜合解決科學(xué)問題的能力。39、用瓊脂糖凝膠分離DNA的理論依據(jù)是什么？答：DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場中向正極移動(dòng)。由于糖磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以相同的速率向正極方向移動(dòng)。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小和構(gòu)型