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文檔簡介
瓊脂糖凝膠電泳操作
及其注意事項歡迎大家一起交流!第一頁,共二十七頁。?什么是電泳?
帶電顆粒在電場作用下,向著與其電性相反的電極移動,稱為電泳。
生物大分子如蛋白質(zhì),核酸,多糖等大多都有陽離子和陰離子基團,稱為兩性離子在電場中,帶電顆粒向正極或負極遷移,遷移的方向取決于它們帶電的符號。第二頁,共二十七頁。按分離原理的不同,電泳分為4類:
移動界面電泳區(qū)帶電泳等電聚焦電泳等速電泳?電泳有幾類?第三頁,共二十七頁。瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法,以瓊脂凝膠作為支持物,利用DNA分子在泳動時的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng),達到分離混合物的目的。?瓊脂糖凝膠電泳原理第四頁,共二十七頁。?瓊脂糖凝膠電泳的操作操作步驟配膠
點樣
電泳
成像拍照EB染色
膠圖分析第五頁,共二十七頁。1、配膠
按所要分離的DNA分子的大小,稱取適量的瓊脂糖粉末,放入錐形瓶,加適量1×TAE電泳緩沖液;
然后置微波爐內(nèi)加熱搖勻至完全溶化呈透明狀,適當冷卻后倒入膠托;膠完全冷凝后放入電泳槽,電泳槽里的緩沖液必須沒過膠面。
第六頁,共二十七頁。第七頁,共二十七頁。2、點樣!根據(jù)樣品不同可分兩種點樣體系:A、樣品+6XloadingbufferB、樣品可直接點樣(如ssp)最后記得點marker,并擺正膠的位置第八頁,共二十七頁。點樣第九頁,共二十七頁。3、電泳!點完樣后連接電源,設(shè)置好電源的參數(shù),開始電泳。當溴酚蘭的帶(藍色)的移動至一定長度即可停止電泳。電壓要求:≤20V/CM膠,在樣品出孔用低壓(3V/CM,15min),然后調(diào)回標準電壓,跑出的條帶較好。第十頁,共二十七頁。電泳槽第十一頁,共二十七頁。4、EB染色溴化乙錠是一種扁平分子,可以嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間。在紫外線照射EB-DNA復(fù)合物時,出現(xiàn)不同的效應(yīng)。注意:嚴格區(qū)分污染區(qū)和非污染區(qū),不把污染區(qū)的物品拿到非污染區(qū),碰過EB的手套要及時丟棄!第十二頁,共二十七頁。EB染膠區(qū)第十三頁,共二十七頁。5、成像拍照Tanon-2500數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)把圖像攝錄、處理、打印一體化。采用高分辨率CCD,高質(zhì)量、高清晰度,保證攝錄凝膠圖像在低照度下的靈敏度、不掉失條帶。第十四頁,共二十七頁。Tanon-2500數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)第十五頁,共二十七頁。6、膠圖分析
以SBT-PCR為例,主要做A、B、DR三個位點,每個位點條帶大小不同.第十六頁,共二十七頁。
注意事項注意事項第十七頁,共二十七頁。一、配膠1.電子稱的使用,要時刻注意保持電子稱的精確性,保持清潔,根據(jù)不同的濃度的膠稱瓊脂糖。2.加TAE的量要適當,以免配出來的膠太薄導(dǎo)致膠孔太淺或濃度太低。3.倒膠前膠托一定要洗干凈,并擦干;倒膠時要待膠冷到一定溫度搖勻盡量不要產(chǎn)生氣泡。若膠液的溫度太高要頂在膠托防止膠托變形。第十八頁,共二十七頁。二、點樣電泳1.96孔塑料板要干凈,loading要點均勻,控制在1~2ul的量,并做好對應(yīng)標記。2.加樣時,槍頭要上緊,吸樣均一準確,排液時吸頭不要有殘留。3.點完樣后及時蓋上膠墊,注意不要蓋反。4.點電泳前最好檢查待用膠是否合格;點電泳時要對準膠孔,盡量點完所有的樣。5.點完樣勿忘點marker并擺正膠位,電泳儀正負極不要插反,電泳槽的蓋子要蓋緊。第十九頁,共二十七頁。三、EB染色1.切膠要準,取膠要穩(wěn),泡膠要慎,避免EB濺起。2.碰到EB的手套要及時丟棄。3.EB液要適時跟換,盤子要清洗。4.抹布要嚴格區(qū)分,不可交叉使用。第二十頁,共二十七頁。四、TanonTanon-2500數(shù)碼凝膠圖像分析儀的使用
1.使用前要注意清潔,以免影響膠圖的清晰度。2.照膠時盡量減少開紫外燈的時間。3.拍照時先關(guān)攝像頭再關(guān)紫外燈,不可顛倒,嚴格按照照膠的流程進行。4.照好的膠及時丟棄。第二十一頁,共二十七頁。瓊脂糖凝膠電泳中常見“問題”
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