臨床ELISA檢驗影響因素

臨床ELISA檢驗影響因素臨床ELISA測定現(xiàn)通常為采用手工操作的以微孔板條為固相的測定模式，測定操作非常簡單，一般涉及到標本的收集保存、試劑準備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結(jié)果判斷和結(jié)果報告及解釋等方面，其中任一步驟的不當都會影響測定結(jié)果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚?，F(xiàn)分述如下：一.臨床標本的收集和保存

用于ELISA測定的臨床標本最為常用的是血清（漿），有時因為特定的檢測目的，也用到唾液、腦脊液、尿液、糞便等標本。目前臨床上使用血清標本測定的標志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標志物、激素、特種蛋白、細胞因子和治療藥物等。對用于激素和治療藥物測定的血清標本的收集，要注意收集時間甚或體位有可能會對測定結(jié)果產(chǎn)生影響。如可的松在早晨4～6點之間，會有一峰值出現(xiàn)：生長激素、促黃體激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以陣發(fā)性方式釋放，因此，在測定此類激素時，有必要在密切相連的時間間隔內(nèi)采取數(shù)份血樣本，以其中間值為測定值。又如當從臥位變?yōu)檎玖⑽粫r，血清中腎素活性將出現(xiàn)明顯增高。再如治療藥物的檢測，應(yīng)根據(jù)藥代動力學(xué)選擇服藥后的最適時間抽血檢測。用于傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標志物和特種蛋白等的檢測的血清標本的收集則沒有時間和體位方面的影響，只是在處理和保存方面要考慮以下幾個方面：

（1）要注意避免出現(xiàn)嚴重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團，其有類似過氧化物的活性，因此，在以HRP為標記酶的ELISA測定中，如血清標本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色。

（2）樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細菌污染，一則細菌的生長，其所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用；二則一些細菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會對用相應(yīng)酶作標記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾。（3）血清標本如是以無菌操作分離，則可以在2～8℃下保存一周，如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長時間保存，應(yīng)在-70℃以下。

（4）冰凍保存的血清標本須注意避免因停電等造成的反復(fù)凍融。標本的反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機械剪切力將對標本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結(jié)果。此外，凍融標本的混勻亦應(yīng)注意，不要進行劇烈振蕩，反復(fù)顛倒混勻即可。

（5）標本在保存中如出現(xiàn)細菌污染所致的混濁或絮狀物時，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測。

二、試劑準備

在臨床實驗室，對試劑準備一般不太注意，通常的做法是，在實驗時將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法有可能影響后面溫育時間不夠的問題，其直接的后果是對一些弱陽性標本的檢測出現(xiàn)假陰性。因此在ELISA測定中試劑的準備最為關(guān)鍵的是，在實驗開始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鐘以上后，再進行測定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是為了在后面的溫育反應(yīng)步驟中，能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度能較快地達到所要求的高度，以滿足測定要求。其次，目前的商品ELISA試劑盒中的洗板液均需在實驗室使用時對所提供的濃縮液稀釋配制，因此稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。此外，當試劑盒以O(shè)PD為底物時，則底物溶液應(yīng)在反應(yīng)顯色前臨時配制。

三、加血清樣本及反應(yīng)試劑

在現(xiàn)在的ELISA商品試劑盒中，血清樣本的加入幾乎是唯一的要使用微量加樣器加入樣本的步驟。使用微量加樣器加樣必須注意的關(guān)鍵點是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會對鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。試劑的加入在國產(chǎn)試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象，這樣就會在孔內(nèi)的非包被區(qū)出現(xiàn)非特異吸附，從而引起非特異顯色。所以，有時候一份標本用相同的試劑盒這次測定為陽性，下次測定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致。

四、溫育

溫育是ELISA測定中影響測定成敗最為關(guān)鍵的一個因素。ELISA作為一種固相免疫測定，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原完全結(jié)合，必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時間。溫育所需時間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時間相對較短。最為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。

溫育這一步是臨床ELISA測定中最容易出現(xiàn)問題的步驟。通常目前國內(nèi)ELISA商品試劑盒的反應(yīng)溫育時間為37℃30分鐘～1小時，進口ELISA試劑盒則通常為37℃1～2小時才能有較完全的結(jié)合，低于1小時，可能會影響測定下限。因此，關(guān)于溫育，在實際測定操作中一定要注意以下幾點：（1）要保證在設(shè)定的溫度下有足夠的反應(yīng)時間。一般來說，加完樣本和/或反應(yīng)試劑后，將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時，孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃，需要一定的時間，尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態(tài)下，這段升溫時間可能還比較長，而在臨床實驗室中，很少有人注意這個問題，通常是將微孔板一放入溫箱即開始計時，這樣就很容易造成實際測定中溫育時間不夠，弱陽性樣本測不出來的問題。這可能就與南方冬天室內(nèi)溫度較低有關(guān)，此時微孔板轉(zhuǎn)入溫箱后37℃溫育時間不夠，以致弱陽性樣本測定為陰性。因此，為保證37℃下足夠的溫育時間，臨床實驗室可自行確定本實驗室不同季節(jié)（不同室溫下）微孔板從室溫拿至溫箱后需要多長時間孔內(nèi)溫度才能達到37℃，從而適當延長板條在溫箱中的放置時間。具體的做法是，用一小溫度計放置板孔反應(yīng)溶液中測量觀察即可。

（2）溫育溫度的選擇。在有的ELISA試劑盒的說明書中，指出溫育溫度可有兩種，例如，一種是37℃下1小時，另一種則為43℃下45分鐘。從免疫測定的抗原抗體反應(yīng)的本質(zhì)來看，在較低的溫度下反應(yīng)較長的時間最為完全。如2～8℃下反應(yīng)24小時。較高的反應(yīng)溫度，由于分子運動的加憐惜，反應(yīng)時間縮短，這一點對分子含量較多的強陽性樣本的測定沒有問題，但對分子含量少的弱陽性樣本則有漏檢的可能。因此，建議在臨床ELISA測定中盡量使用較低溫育溫度較長反應(yīng)時間的條件。

（3）“邊緣效應(yīng)”的排除。以前在使用96孔板的ELISA測定中，常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應(yīng)”，即外周孔顯色較中心孔深，產(chǎn)生這種“邊緣效應(yīng)”的原因可能為96孔板周孔與中心孔表面或熱力學(xué)特征的不同。但有研究證實在溫育中的熱力學(xué)梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體，在實驗室的常規(guī)ELISA測定中，將板從室溫（通常在25℃左右）置于37℃溫箱，板也升溫時，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。因此使用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37℃），就可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)”，并且可提高測定的重復(fù)性。

總而言之，在臨床ELISA測定中，要保證好的測定效果，可采用下述簡單辦法來確保溫育條件，即盡量采用水浴，溫育中讓微孔板浮于水面上，或?qū)⒔杆纳巢挤湃胍淮箫埡兄谐梢粷窈?，放于溫箱中，這樣就會因為板條孔底部直接與37℃水或濕布的接觸，以及水浴箱或濕盒內(nèi)的高溫度，而使反應(yīng)溶液的溫度迅速與溫室平衡。五、洗板

固相免疫測定技術(shù)是一種非均相免疫測定技術(shù)，需以洗滌操作將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反應(yīng)溫育過程中吸附的非特異成份分離開來，以保證ELISA測定的特異性。因此，洗板對于ELISA測定來說，也是極其關(guān)鍵的一步。以HRP作為標記酶的ELISA試劑盒中使用的洗板液一般為含0.05%Tween20的中性PBS，Tween20為一種非離子去垢劑，既含親水基團，也含疏水基團，其在洗滌中的作用機理是，借助其疏水基團與經(jīng)疏水性相互作用被動吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基團形成疏水鍵，從而削弱蛋白與固相的吸附，同時在其親水基團與液相中水分子的結(jié)合作用下，促使蛋白質(zhì)脫離固相而進入液相，這樣就可達到去掉非特異吸附物的目的，但由于抗體或抗原的包被通常也是通過在堿性條件下與固相的疏水性相互作用而被動吸附于固相，因此要注意非離子去垢劑的使用濃度，洗板液中Tween20濃度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗體解吸附而影響試驗的測定下限

在臨床實驗室中，ELISA測定的洗板一般有兩種方式，即手工和洗板機洗板。手工洗板即是在每次反應(yīng)溫育后，將反應(yīng)液吸出或甩干，然后在板孔中加滿洗液，放置2～3分鐘后，將洗液吸出或甩干，再在吸水紙上拍干。重復(fù)上述洗滌步驟3～4次，最后在吸水紙上拍干，即可進行下一步測定操作。洗板機洗板則是將上述手工操作改由洗板機進行，使用洗板機洗板的一個特點是，每次洗板后不能拍干，故有較多的液體殘留，液體殘留量小的洗板機洗板至徹底所需的次數(shù)要少于殘留量大的洗板機。

六、顯色

在目前的以HRP作為標記酶的商品ELISA試劑盒中，如以TMB為底物，則提供的底物為A和B兩瓶應(yīng)用液；如以O(shè)PD為底物，則試劑盒提供OPD片劑或粉劑，臨用前配制。一般商品試劑盒顯色反應(yīng)條件為37℃或室溫反應(yīng)15～30分鐘。從理論上說，37℃30分鐘才可以使HRP的底物催化反應(yīng)完全，盡管在最初的10分鐘內(nèi)，絕大部份催化反應(yīng)即可完成。因此，為使弱陽性樣本孔能有充分的顯色，建議在37℃下反應(yīng)25～30分鐘后，終止反應(yīng)比色測定。此外，在加入底物開始顯色反應(yīng)前，最好是先檢查一下底物溶液的有效性，即可將A和B兩種液各加一滴于清潔的空板孔或eppendorf管中，觀察是否有顯色出現(xiàn)，如有，則說明底物已變質(zhì)。以O(shè)PD為底物，配好后應(yīng)為無色，否則就不能使用。以TMB為底物，整個顯色反應(yīng)過程無需避光，而以O(shè)PD為底物，則需避光進行。關(guān)于TMB和OPD的顯色反應(yīng)特點及注意點可參考前面有關(guān)章節(jié)內(nèi)容。顯色反應(yīng)完成后，加入酸終止反應(yīng)，振蕩混勻后即可進行下面的比色測定或肉眼判斷結(jié)果。

七、比色

ELISA的比色測定由酶標儀進行，有的同行可能會認為，既然由酶標儀進行，那么此時便可以萬事大吉了，其實不然，因為當代較為先進的酶標儀器儀表，均有較多的功能，使用不當，會得到令人難以理解的結(jié)果。如使用酶標儀比色測定后，有許多陰性測定孔的吸光度值為負數(shù)或測定假陽性率大大增加等等。這主要是沒有正確地理解和使用酶標儀所致。至于如何正確理解和使用酶標儀詳見后面有關(guān)章節(jié)。此處，只是強調(diào)下面兩點：

（1）比色測定時，一定要注意酶標儀的波長是否已調(diào)至合適或所用濾光片是否正確。由于有的臨床實驗室在進行ELISA測定時，以TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長為450nm，后者為492nm，濾光片需根據(jù)要求隨時更換。因此，容易出現(xiàn)濾光片錯用的問題。

（2）單波長或雙波長比色選擇的問題。中檔以上的酶標儀基本上都同時具有單波長和雙波長比色功能。所謂的單波長比色即是通常的以對顯色具有最大吸收的波長如450nm或492nm進行比色測定；而雙波長雙色則酶標儀在敏感波長如450nm和非敏感波長如630nm下各測定一次，敏感波上下的吸光度測定值為樣本測定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長下測定即改變波長至一定值，使得樣本測定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度值為零，此時測得的吸光度即為臟物的吸光度值。最后酶標儀給出的數(shù)值為敏感波長下的吸光度值與非常感波長下的吸光度值的差。因此，雙波長比色測定具有能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響的優(yōu)點，一般不必設(shè)空白孔。如在使用雙波長比色時，仍設(shè)空白孔，就可能會造成前面提到的測定孔吸光度為負數(shù)的現(xiàn)象。由于ELISA測定中單個空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說每次測定或同次測定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測定值，故而在ELISA測定比色時，最好是使用雙波長比色。

八、結(jié)果判定

臨床ELISA測定按其表示測定結(jié)果的方式分為定性和定量測定兩大類。定性測定只是對標本中是否含有待測抗原或抗體作出“有”或“無”的結(jié)論，分別用“陽性”和“陰性”來表示?？梢姸ㄐ詼y定通常是用于傳染性病原體的抗原或抗體的測定，以判斷特定病原體感染的存在與否。而定量測定則是對標本中待測抗原的多少進行量值測定，以具體數(shù)值表示。定量測定基本上是用于非病原體抗原物質(zhì)的測定，如激素、細胞因子、腫瘤標志物、小分子藥物等。ELISA定性測定的“陽性”和“陽性”的判定依據(jù)是試劑盒所確定的陽性判定值（Cut-off）。定量測定的“量值”依據(jù)是試劑盒中所帶標準品同時測定得出的劑量反應(yīng)曲線（又稱標準曲線）。

下面再解釋一下在ELISA定性測定結(jié)果判定中常用的一些縮寫。

（1）S/CO：其中S為Sample(樣本)或Specimen(標本)的簡寫，表示的是標本測定的吸光度值，CO為Cut-off值的簡寫。除競爭抑制法外，其它ELISA定性測定模式中，當S/CO值大于或等于1時，標本的測定為陽性，小于1時為陰性。

（2）S/N或P/N：其中S同（1），N為Negative(陰性對照)的簡寫，P為Patient（患者）的簡寫。較早的試劑盒很多都使用S/N或P/N≥2.1為陽性判定標準，現(xiàn)仍有一些試劑盒使用這種方式。這種方式與S/CO方式無根本性區(qū)別，只不過是前者將陰性對照（N）的2.1倍視為Cut-off值而已。

九、結(jié)果報告及解釋

臨床ELISA測定結(jié)果的報告較為簡單。定性測定報陰性或陽性即可；定量測定則報出具體的數(shù)值。結(jié)果解釋比較起來要復(fù)雜的多，它要求實驗室技術(shù)人員對所測定的項目有較為全面的知識基礎(chǔ)?，F(xiàn)在，檢驗不再是單純的實驗室測定，而已成為一門臨床醫(yī)學(xué)學(xué)科，即檢驗醫(yī)學(xué)，這就要求從事醫(yī)學(xué)檢驗工作的檢驗醫(yī)師，對所做的測定項目除了知其然，還要知其所以然，否則就難免為時代所淘汰。

綜上所述，盡管ELISA測定的操作步驟非常簡單，但有可能會影響測定結(jié)果的因素卻較多，分布在測定操作的各步之中，尤以加樣、溫育和洗板為甚。為幫助大家分析查找測定中出現(xiàn)問題的可能原因，特對常見問題及原因歸納總結(jié)于下表。臨床ELISA測定中可能會出現(xiàn)的問題及可能的原因

失控原因?qū)嶒灡憩F(xiàn)

S/Co值

處理方法

質(zhì)控品因素

加入質(zhì)控品量錯誤（多或少）質(zhì)控孔顯色加深或變淺高或低加入正確質(zhì)控品量，重新檢測質(zhì)控品加樣器不準，加入質(zhì)控品量質(zhì)控孔顯色加深或變淺高或低校準或使用新的加樣器不準確具，重新檢測質(zhì)控品加樣頭未固定好，加入質(zhì)控質(zhì)控孔顯色變淺低加樣頭充分固定在加樣器品量不準確上，重新檢測質(zhì)控品加樣器吸入、排出過快或未質(zhì)控孔顯色變淺低采用適當?shù)奈?、排液操作排至第二停點使加入質(zhì)控品方法，重新檢測量不準確質(zhì)控品開啟時間過長、反復(fù)質(zhì)控孔顯色變淺低更換同批號質(zhì)控品，重新凍融或保存不當致待檢物效檢測質(zhì)控品價降低質(zhì)控品過期、污染質(zhì)控孔顯色加深或變淺高或低更換同批號質(zhì)控品，重新檢測質(zhì)控品質(zhì)控品密封不好，水分揮發(fā)質(zhì)控孔顯色加深高更換同批號質(zhì)控品，重新檢測質(zhì)控品設(shè)置CO公式錯誤S/Co值錯誤高或低未超過比色時間，修正公式，重新比色選擇比色波長不正確OD值低一般為低未超過比色時間，糾正比色波長，重新比色

失控原因?qū)嶒灡憩F(xiàn)

S/Co值

處理方法試劑因素

試劑過期全板顯色淺低更換有效試劑，重新實驗試劑保存不當（如置入冷凍層全板顯色淺低選用保存妥當?shù)脑噭┗蛸徺I或室溫保存等）合格試劑，重新實驗酶標板、試劑在室溫平衡不夠，

造成酶標板包被物潮解或試劑全板顯色淺

低

使用在室溫充分平衡的試劑反應(yīng)不足重新檢測

酶失效（酶污染長菌、保存不全板顯色淺低更換新的符合質(zhì)量要求的酶當?shù)龋┲匦聦嶒灻笜税迨Вòb拆封時間長、全板顯色淺

低

注意拆封后的保存方法和沒有密封保存等）使用期限，使用合格的酶標板，重新實驗試劑盒存在質(zhì)量問題

不顯色或低

更換質(zhì)量可靠的試劑，加強顯色淺對制劑盒質(zhì)量的監(jiān)測，必要時重新評價實驗室靶值和控制限

失控原因?qū)嶒灡憩F(xiàn)

S/Co值

處理方法儀器因素

洗板機洗板次數(shù)設(shè)定過少，

全板顯色加深

高或低

調(diào)整洗板次數(shù)，重新實驗洗板不干凈

洗板機洗板次數(shù)設(shè)定過多，

全板顯色淺

低

調(diào)整洗板次數(shù)，重新實驗洗板過度

洗板機洗板注液速度過快

全板顯色淺

低

調(diào)整洗板速度，重新實驗

洗板機洗板吸液位置過高，全板顯色或花板高或低調(diào)整洗板機吸液位置高度，重新洗板不干凈實驗洗板機洗板注入洗液量不全板顯色或花板高或低如因設(shè)置原因，調(diào)整設(shè)置，重新足，洗板不干凈實驗洗板機洗液不足全板顯色或花板高或低開啟洗板機液面感應(yīng)功能，重新實驗，及時檢查洗液液面洗板機洗板注入洗液量過部分孔顯色加深，高或低設(shè)置調(diào)整，重新實驗多溢出，反應(yīng)孔邊緣酶污染出現(xiàn)花板酶標儀預(yù)熱不夠，未達到穩(wěn)比色結(jié)果不準確、高或低需要等候時間在比色時間允許范圍定工作狀態(tài)重復(fù)性差內(nèi)，等待充分預(yù)熱后重新比色；需要等候時間超出比色時間允許范圍，重新實驗酶標儀故障，比色結(jié)果不準比色結(jié)果不準確、高或低維修酶標儀，重新實驗確重復(fù)性差

失控原因?qū)嶒灡憩F(xiàn)

S/Co值

處理方法操作因素

未加入酶結(jié)合物全板不顯色低重新實驗,按試劑盒要求加入酶結(jié)合物未加入或部分漏加底物全板不顯色或花板高或低重新實驗,按試劑盒要求加入底物試劑或樣本加入量錯誤全板顯色加深或變淺高或低按試劑盒說明要求準確加入試劑或樣本,重新實驗?zāi)骋徊交蚨嗖椒跤龝r間全板顯色加深或變淺高或低按試劑盒說明要求準確控制過長或過短孵育時間,重新實驗加入試劑后未振搖或振全板或部分孔顯色變高或低重新實驗,嚴格按要求實驗搖不充分淺或重復(fù)性差空白孔加酶空白孔顯色低空白孔一般不加酶,按試劑盒要求操作包被反應(yīng)孔條放置不平部分孔顯色加深,高或低重新實驗,將反應(yīng)孔條壓緊、導(dǎo)致洗板不干凈重復(fù)性差壓平人工洗板，操作不規(guī)范全板顯色加深或變淺高或低使用洗板機洗板,重新實驗重復(fù)性差

失控原因?qū)嶒灡憩F(xiàn)

S/Co值

處理方法操作因素洗液中忘記加入濃縮洗滌全板顯色加深一般為低重新按要求配置洗液,造成洗板不干凈液,重新實驗洗液配制濃度過高,導(dǎo)致使全板顯色變淺低重新按要求配置洗液,包被于固相上的抗原或抗重新實驗體解吸附實驗板孵育時重疊過多,導(dǎo)部分孔顯色變淺一般為低孵育時減少重疊或致中間的反應(yīng)板反應(yīng)不充重復(fù)性差不重疊，重新實驗分某一步或多步操作時間過部分孔顯色加深高或低熟練掌握操作方法,長,(如操作不熟練或等待重復(fù)性差將標本收集完后再標本致先后加入標本或試加入標本，盡量縮劑的時間差異較大)短前后加入標本試劑的時間差異,重新試驗

失控原因?qū)嶒灡憩F(xiàn)

S/Co值

處理方法

環(huán)境因素

環(huán)境溫度過低或過高全板顯色加深或變淺高或低使用空調(diào)等設(shè)備調(diào)節(jié)(尤其是室溫孵育法)比色結(jié)果不準確環(huán)境溫度，重新實驗強磁場、電場等干擾重復(fù)性差未超過比色時間,排除酶標儀的比色結(jié)果