實驗四 微生物平板菌落計數(shù)法

實驗四微生物平板菌落計數(shù)法實驗四微生物平板菌落計數(shù)法實驗四微生物平板菌落計數(shù)法V:1.0精細(xì)整理，僅供參考實驗四微生物平板菌落計數(shù)法日期：20xx年X月實驗四微生物平板菌落計數(shù)法一、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)并掌握平板菌落計數(shù)的基本原理和方法。二、實驗原理平板菌落計數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個單細(xì)胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個單細(xì)胞。統(tǒng)計菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。但是，由于待測樣品往往不易完全分散成單個細(xì)胞，所以，長成的一個單菌落也可能來自樣品中的2～3或更多個細(xì)胞。因此平板菌落計數(shù)的結(jié)果往往偏低，為了清楚地闡述平板菌落計數(shù)的結(jié)果，現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位（cfu）而不以絕對菌落數(shù)來表示樣品的活菌含量。平板菌落計數(shù)法雖然操作較繁，結(jié)果需要培養(yǎng)一段時間才能取得，而且測定結(jié)果易受多種因素的影響，但是該計數(shù)方法的最大優(yōu)點是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗（如活菌制劑），以及食品、飲料和水（包括水源水）等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測。三、實驗器材1．菌種：酵母菌。2．培養(yǎng)基：YEB培養(yǎng)基。3．儀器或其他用具：1ml無菌吸管，無菌平皿，盛有4.5ml無菌水的試管，試管架，恒溫培養(yǎng)箱等。四、實驗步驟1．編號取無菌平皿9套，分別用記號筆標(biāo)明10-4、10-5、10-6（稀釋度）各2套，另取6支盛有4.5ml無菌水的試管，依次標(biāo)是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。2．稀釋用1ml無菌吸管吸取1ml已充分混勻的大腸桿菌菌懸液（待測樣品），精確地放0.5ml至10-1的試管中，此即為10倍稀釋。將多余的菌液放回原菌液中。將10-1試管置試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。另取一支1ml吸管插入10-1試管中來回吹吸菌懸液三次，進(jìn)一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時不要太猛太快，吸時吸管伸入管底，吹時離開液面，以免將吸管中的過濾棉花浸濕或使試管內(nèi)液體外溢。用此吸管吸取10-1菌液1ml，精確地放0.5ml至10-2試管中，此即為100倍稀釋?！ぁぁぁぁぁて溆嘁来晤愅?。放菌液時吸管不要碰到液面，即每一支吸管只能接觸一個稀釋度的菌懸液，否則稀釋不精確，結(jié)果誤差較大。3．倒平板法：1）取樣。用三支1ml無菌吸管分別吸取10-4、10-5和10-6的稀釋菌懸液各1ml，對號放入編好號的無菌平皿中，每個平皿放0.2ml。不要用1ml吸管每次只靠吸管尖部吸0.2ml稀釋菌液放入平皿中，這樣容易加大同一稀釋度幾個重復(fù)平板間的操作誤差。2）倒平板。盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至45℃左右的LB培養(yǎng)基約15毫升/平皿，置水平位置迅速旋動平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，而又不使培養(yǎng)基蕩出平皿或濺到平皿蓋上。由于細(xì)菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培養(yǎng)皿后，應(yīng)盡快倒入融化并已冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基，立即搖勻，否則細(xì)菌將不易分散或長成的菌落連在一起，影響計數(shù)。3）待培養(yǎng)基凝固后，將平板倒置于4.涂布法：涂抹平板計數(shù)法與倒平板法基本相同，所不同的是先將培養(yǎng)基熔化后趁熱倒入無菌平板中，待凝固后編號，然后用無菌吸管吸取0.1ml菌液對號接種在不同稀釋度編號的瓊脂平板上（每個編號設(shè)三個重復(fù)）。再用無菌刮鏟將菌液在平板上涂抹均勻（圖22-3），每個稀釋度用一個滅菌刮鏟，更換稀釋度時需將刮鏟灼燒滅菌。在由低濃度向高濃度涂抹時，也可以不更換刮鏟。將涂抹好的平板平放于桌上20—30min，使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，然后將平板倒轉(zhuǎn)，保溫培養(yǎng)，至長出菌落后即可計數(shù)。5．計數(shù)培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平板，算出同一稀釋度三個平板上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進(jìn)行計算：每毫升中菌落形成單位（cfu）=同一稀釋度三次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×5一般選擇每個平板上長有30～300個菌落的稀釋度計算每毫升的含菌量較為合適，同一稀釋度的三個重復(fù)對照的菌落數(shù)不應(yīng)相差很大，否則表示試驗不精確。實際工作中同一稀釋度重復(fù)三個對照平板不能少于三個，這樣便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計，減少誤差。由10-4、10-5和10-6三個稀釋度計算出的每毫升菌液中菌落形成單位數(shù)也不應(yīng)相差太大。平板菌落計數(shù)法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的，一般三個連續(xù)稀釋度中的第二個稀釋度倒平板培養(yǎng)后，所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個左右為好，否則要適當(dāng)增加或減少稀釋度加以調(diào)整。五、實驗結(jié)果將培養(yǎng)后菌落計數(shù)結(jié)果填入下表：稀釋度10-410-510-6123平均123平均123平均Cfu數(shù)/平板

每毫升中的cfu數(shù)

六、思考題（1）為什么融化后的培養(yǎng)基要冷卻至45℃（2）要使平板菌落計數(shù)準(zhǔn)確，需要掌握哪幾個關(guān)鍵為什么

（3）試比較平板菌落計數(shù)