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實驗四微生物平板菌落計數(shù)法實驗四微生物平板菌落計數(shù)法實驗四微生物平板菌落計數(shù)法V:1.0精細整理,僅供參考實驗四微生物平板菌落計數(shù)法日期:20xx年X月實驗四微生物平板菌落計數(shù)法一、實驗目的學習并掌握平板菌落計數(shù)的基本原理和方法。二、實驗原理平板菌落計數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當稀釋之后,其中的微生物充分分散成單個細胞,取一定量的稀釋樣液接種到平板上,經(jīng)過培養(yǎng),由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落,即一個單菌落應代表原樣品中的一個單細胞。統(tǒng)計菌落數(shù),根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。但是,由于待測樣品往往不易完全分散成單個細胞,所以,長成的一個單菌落也可能來自樣品中的2~3或更多個細胞。因此平板菌落計數(shù)的結果往往偏低,為了清楚地闡述平板菌落計數(shù)的結果,現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位(cfu)而不以絕對菌落數(shù)來表示樣品的活菌含量。平板菌落計數(shù)法雖然操作較繁,結果需要培養(yǎng)一段時間才能取得,而且測定結果易受多種因素的影響,但是該計數(shù)方法的最大優(yōu)點是可以獲得活菌的信息,所以被廣泛用于生物制品檢驗(如活菌制劑),以及食品、飲料和水(包括水源水)等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測。三、實驗器材1.菌種:酵母菌。2.培養(yǎng)基:YEB培養(yǎng)基。3.儀器或其他用具:1ml無菌吸管,無菌平皿,盛有4.5ml無菌水的試管,試管架,恒溫培養(yǎng)箱等。四、實驗步驟1.編號取無菌平皿9套,分別用記號筆標明10-4、10-5、10-6(稀釋度)各2套,另取6支盛有4.5ml無菌水的試管,依次標是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。2.稀釋用1ml無菌吸管吸取1ml已充分混勻的大腸桿菌菌懸液(待測樣品),精確地放0.5ml至10-1的試管中,此即為10倍稀釋。將多余的菌液放回原菌液中。將10-1試管置試管振蕩器上振蕩,使菌液充分混勻。另取一支1ml吸管插入10-1試管中來回吹吸菌懸液三次,進一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時不要太猛太快,吸時吸管伸入管底,吹時離開液面,以免將吸管中的過濾棉花浸濕或使試管內液體外溢。用此吸管吸取10-1菌液1ml,精確地放0.5ml至10-2試管中,此即為100倍稀釋?!ぁぁぁぁぁて溆嘁来晤愅?。放菌液時吸管不要碰到液面,即每一支吸管只能接觸一個稀釋度的菌懸液,否則稀釋不精確,結果誤差較大。3.倒平板法:1)取樣。用三支1ml無菌吸管分別吸取10-4、10-5和10-6的稀釋菌懸液各1ml,對號放入編好號的無菌平皿中,每個平皿放0.2ml。不要用1ml吸管每次只靠吸管尖部吸0.2ml稀釋菌液放入平皿中,這樣容易加大同一稀釋度幾個重復平板間的操作誤差。2)倒平板。盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至45℃左右的LB培養(yǎng)基約15毫升/平皿,置水平位置迅速旋動平皿,使培養(yǎng)基與菌液混合均勻,而又不使培養(yǎng)基蕩出平皿或濺到平皿蓋上。由于細菌易吸附到玻璃器皿表面,所以菌液加入到培養(yǎng)皿后,應盡快倒入融化并已冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基,立即搖勻,否則細菌將不易分散或長成的菌落連在一起,影響計數(shù)。3)待培養(yǎng)基凝固后,將平板倒置于4.涂布法:涂抹平板計數(shù)法與倒平板法基本相同,所不同的是先將培養(yǎng)基熔化后趁熱倒入無菌平板中,待凝固后編號,然后用無菌吸管吸取0.1ml菌液對號接種在不同稀釋度編號的瓊脂平板上(每個編號設三個重復)。再用無菌刮鏟將菌液在平板上涂抹均勻(圖22-3),每個稀釋度用一個滅菌刮鏟,更換稀釋度時需將刮鏟灼燒滅菌。在由低濃度向高濃度涂抹時,也可以不更換刮鏟。將涂抹好的平板平放于桌上20—30min,使菌液滲透入培養(yǎng)基內,然后將平板倒轉,保溫培養(yǎng),至長出菌落后即可計數(shù)。5.計數(shù)培養(yǎng)48h后,取出培養(yǎng)平板,算出同一稀釋度三個平板上的菌落平均數(shù),并按下列公式進行計算:每毫升中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度三次重復的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×5一般選擇每個平板上長有30~300個菌落的稀釋度計算每毫升的含菌量較為合適,同一稀釋度的三個重復對照的菌落數(shù)不應相差很大,否則表示試驗不精確。實際工作中同一稀釋度重復三個對照平板不能少于三個,這樣便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計,減少誤差。由10-4、10-5和10-6三個稀釋度計算出的每毫升菌液中菌落形成單位數(shù)也不應相差太大。平板菌落計數(shù)法,所選擇倒平板的稀釋度是很重要的,一般三個連續(xù)稀釋度中的第二個稀釋度倒平板培養(yǎng)后,所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個左右為好,否則要適當增加或減少稀釋度加以調整。五、實驗結果將培養(yǎng)后菌落計數(shù)結果填入下表:稀釋度10-410-510-6123平均123平均123平均Cfu數(shù)/平板
每毫升中的cfu數(shù)
六、思考題(1)為什么融化后的培養(yǎng)基要冷卻至45℃(2)要使平板菌落計數(shù)準確,需要掌握哪幾個關鍵為什么
(3)試比較平板菌落計數(shù)
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