高三生物動物細(xì)胞培養(yǎng)

高三生物動物細(xì)胞培養(yǎng)高三生物動物細(xì)胞培養(yǎng)高三生物動物細(xì)胞培養(yǎng)V:1.0精細(xì)整理，僅供參考高三生物動物細(xì)胞培養(yǎng)日期：20xx年X月動物細(xì)胞培養(yǎng)【教學(xué)目標(biāo)】1.能夠簡述動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程、條件及應(yīng)用。2.運用材料，使學(xué)生進(jìn)一步了解動物細(xì)胞培養(yǎng)中的研究熱點、發(fā)展趨勢和應(yīng)用前景，以開拓視野，增強(qiáng)科技意識?！窘虒W(xué)方法】運用講授、自學(xué)以及討論相結(jié)合的方法【教學(xué)重點】細(xì)胞培養(yǎng)的過程、條件及應(yīng)用【教學(xué)難點】細(xì)胞培養(yǎng)中的相關(guān)名詞、動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用前景【教學(xué)過程】1.創(chuàng)設(shè)情景，導(dǎo)入新課應(yīng)用目前人類面臨的一些困惑或難題，如皮膚燒傷的植皮等問題，引出進(jìn)行動物細(xì)胞培養(yǎng)的目的，解決兩個問題：（1）為什么要進(jìn)行動物細(xì)胞培養(yǎng)（2）什么是動物細(xì)胞培養(yǎng)

2.利用材料，引導(dǎo)自學(xué)與討論（1）運用錄像資料，引導(dǎo)學(xué)生自學(xué)動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程，并通過相互討論，嘗試解決動物細(xì)胞中的有關(guān)名詞，如接觸抑制、貼壁生長、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等；（2）聯(lián)系已有的知識，引導(dǎo)學(xué)生嘗試解決第三個問題：如何進(jìn)行動物細(xì)胞培養(yǎng)？包括動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程、條件等。3.歸納總結(jié)，聯(lián)系實際，聯(lián)系實際，拓展延伸通過對上述三個問題的解決，學(xué)生初步了解動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，在此基礎(chǔ)上，以實例為抓手，聯(lián)系實際，進(jìn)一步了解動物細(xì)胞培養(yǎng)中的研究熱點、發(fā)展趨勢和應(yīng)用前景，以開拓視野，增強(qiáng)科技意識。實驗一動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)是用無菌操作的方法將動物體內(nèi)的組織(或器官)取出，模擬動物體內(nèi)的生理條件，在體外進(jìn)行培養(yǎng)．使其不斷地生長、繁殖，人們借以觀察細(xì)胞的生長、繁殖、細(xì)胞分化以及細(xì)胞衰老等過程的生命現(xiàn)象。細(xì)胞培養(yǎng)的突出優(yōu)點，一是便于研究各種物理、化學(xué)等外界因素對細(xì)胞生長發(fā)育和分化等的影響；二是細(xì)胞培養(yǎng)便于人們對細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)(如細(xì)胞骨架等)、細(xì)胞生長及發(fā)育等過程的觀察。因而細(xì)胞培養(yǎng)是探索和指示細(xì)胞生命活動規(guī)律的—種簡便易行的實驗技術(shù)，同時我們也不可忽略的另一個因素，那就是它脫離樂生物機(jī)體后的—些變化。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)目前已廣泛地被應(yīng)用于生物學(xué)的各個領(lǐng)域。如分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫痛學(xué)及病毒學(xué)等為此有必要使學(xué)生在細(xì)胞培養(yǎng)方面得到一些初步的感性知識，了解動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作過程，觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長特征，對原代細(xì)胞與傳代細(xì)胞有一個基本概念。本實驗分兩次進(jìn)行．即清洗與消毒和傳代細(xì)胞的培養(yǎng)與觀察。Ⅰ清洗與滅菌一、實驗?zāi)康哪塥毩⒌剡M(jìn)行用于細(xì)胞培養(yǎng)的各種器皿的清洗與消毒，掌握干熱滅菌法、濕熱滅菌法和濾過除菌法的操作，了解化學(xué)消毒法的使用方法。二、實驗原理清洗與消毒是組織培養(yǎng)實驗的第一步，是組織培養(yǎng)中工作量最大，也是最基本的步驟。體外培養(yǎng)細(xì)胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對清潔和無菌的要求程度很高。細(xì)胞養(yǎng)不好與清洗不徹底有很大關(guān)系。清洗后的玻璃器皿，不僅要求干凈透明，無油跡，而且不能殘留任何物質(zhì)。如有毒的化學(xué)物質(zhì)，哪怕殘留0．1個，也可能影響細(xì)胞生長。滅菌手段的選擇十分重要，對不同的物品需采用不同的滅菌方法。假如選用的方法不對，即使達(dá)到了無菌卻使被滅菌藥品喪失了營養(yǎng)價值、生物學(xué)特性或其他使用價值也不行。以下在每種滅菌步驟中都介紹其使用范圍。三、實驗材料、用品材料：無臭氧型紫外燈，微孔濾膜(直徑25)：孔徑為0．22μm，微孔濾膜(直徑90)：孔徑為0．22μm，過濾器(直徑25)。藥品：70％或75％酒精，0．1％新潔爾滅，煤酚皂溶液(來蘇兒水)，0．5％過氧乙酸，乳酸，37％甲醛，高錳酸鉀，NaOH，鹽酸，重鉻酸鉀，濃硫酸(工業(yè))，DEPC水[體積分?jǐn)?shù)0．1％的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate)]。儀器：超凈臺，干燥箱，高壓鍋，過濾器，過濾泵。四、實驗步驟(一)清洗1．新玻璃器皿的清洗先用自來水刷洗，再浸泡5％稀鹽酸以中和玻璃表面的堿性物質(zhì)和其他有害物質(zhì)。2．使用過的玻璃器皿的清洗(1)使用過的培養(yǎng)用品應(yīng)立即浸入清水，避免干涸難洗。(2)用洗滌劑清洗玻璃器皿，自來水清洗數(shù)遍，倒置自然干燥。(3)浸酸性洗液過夜。(4)從酸性洗液撈出后自來水沖洗10．15次去除殘余酸液，蒸餾水涮洗3次，倒置烘干。(5)包裝(牛皮紙或一般紙)。(6)高壓(15磅20min)或干熱(17(7)貯存?zhèn)溆谩?．膠塞的處理(1)新膠塞應(yīng)先用清水清洗之后再用0．2％NaOH煮沸l(wèi)O-20min。(2)自來水清洗10次。(3)再用1％稀鹽酸浸泡30min。(4)自來水清洗10次，蒸餾水涮洗3次。晾干，高壓滅菌(見(二)消毒與滅菌)。舊膠塞不必用酸堿處理可直接用洗滌劑煮沸和清洗數(shù)次，過蒸餾水，晾干，包裝并高壓滅菌后，便可使用。（二）消毒1．物理消毒法(1)紫外線消毒用于消毒空氣、操作臺面和一些不能用干熱、濕熱滅菌的培養(yǎng)器皿，如塑料培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板等。這是常使用的消毒方法之一。(2)干熱滅菌主要用于玻璃器皿的滅菌。將用于細(xì)胞培養(yǎng)的器皿放人干燥箱內(nèi)，加熱至160℃，保溫90－120min。用于RNA提取實驗的用品則需180℃，保溫5－8h。(3)濕熱滅菌此方法也稱為高壓蒸汽滅菌，是最有效的一種滅菌方法。主要應(yīng)用范圍是布類、橡膠制品(如膠塞)、金屬器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加熱后不發(fā)生沉淀的無機(jī)溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。手動高壓滅菌鍋操作如下：①首先查看高壓鍋內(nèi)的水是否充足，放人物品蓋好蓋。②加熱高壓鍋。將放氣閥打開，放氣5—10min，以排除鍋內(nèi)的冷空氣。③待鍋內(nèi)水沸騰后，落下放氣閥繼續(xù)升溫升壓，玻璃器皿等用15磅(121℃)30min，膠塞、塑料制品、溶液等可用10磅(115℃)20min。調(diào)節(jié)火力大小保持該壓力。④停止加熱，待壓力自然下降至0再打開放氣閥排汽，開蓋，取出高壓滅菌的物品烘干。電熱自動滅菌鍋使用說明(型號：SANYOAutoclaveMLS-3020)：①放氣筒加水至LOW水平線處，將與高壓鍋相連的導(dǎo)氣管插入放氣筒里，然后將放氣筒歸于原位。②打開高壓鍋蓋，加入蒸餾水至高壓鍋底的水位線，水位線位于V型凹槽的1／3－2／3處。③打開電源。④設(shè)定高壓溫度及時間，高壓鍋的溫度范圍為105－121℃，高壓滅菌一般采用121℃20—30min。⑤把待高壓的物品置于高壓鍋內(nèi)，順時針方向?qū)xhaust鈕旋至close位置。⑥關(guān)閉高壓鍋蓋，旋至顯示屏上左上角的紅亮點剛出現(xiàn)為止。⑦按start鈕，開始高壓，在溫度達(dá)80℃時顯示器開始顯示溫度，當(dāng)溫度達(dá)到所需的設(shè)定溫度時，在顯示屏的左下角有一長形的指示燈閃亮，直到高壓時間結(jié)束后指示燈滅，此時蜂鳴器報警一聲。當(dāng)壓力降至0MPa時，蜂鳴器再報警一聲。溫度降至80℃時，蜂鳴器報警10次。顯示屏溫度指示消失，此時才可打開鍋蓋。⑧關(guān)電源，開高壓鍋蓋，取出已滅菌的物品，烘干。(4)濾過除菌用于培養(yǎng)用液和各種不能高壓滅菌的溶液的滅菌。采用金屬濾器和小型的塑料濾器，配上可以更換的微孔濾膜，極大地方便了操作。濾器型號按直徑大小劃分。如過濾量大的培養(yǎng)用液常用較大型號的金屬濾器(直徑90mm、100mm、142mm……等)，配以過濾泵使用。過濾量較小的液體常用注射器推動的塑料小濾器(直徑20mm、25mm等)。濾膜孔徑有0．60μm、0．45μm、0．35μm、0．22μm、0．10μm等，以0．22μm除菌最為保險，但對于較粘稠難濾過的液體，仍需選用孔徑較大的濾膜。①在過濾器上裝上微孔濾膜，孔徑為0．22μm。②用布包好，濕熱滅菌后使用。2．化學(xué)消毒法常用的消毒液有如下幾種：(1)70％(或75％)酒精：超凈臺里常備70％酒精棉球(衛(wèi)生級酒精)，用于手和一些金屬器械或工作臺面的消毒。(2)0．1％新潔爾滅：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超凈臺面的清潔。超凈臺旁應(yīng)常備盛有0．1％新潔爾滅溶液的容器及紗布。(3)來蘇兒水(煤酚皂溶液)：主要用于無菌室桌椅、墻壁、地面的消毒和清洗，以及空氣噴撒消毒，特別是污染細(xì)胞的消毒處理。使用濃度請按瓶上說明。(4)0．5％過氧乙酸：是強(qiáng)效消毒劑，10min即可將芽孢菌殺死。用于各種物品的表面消毒，用噴撒和擦拭方式進(jìn)行。(5)乳酸蒸氣：將乳酸放入坩鍋內(nèi)用酒精燈或電爐加熱至沸騰為止。將門窗緊閉1—3d。可將空氣中漂浮的微生物殺死。(6)37％甲醛加高錳酸鉀：使用前先緊閉門窗。將37％甲醛用酒精燈或電爐加熱至沸騰后斷電或滅火。用一張紙盛好適量的高錳酸鉀，迅速放人已加熱好的甲醛中形成蒸氣。1—3d后方可達(dá)到消毒空氣的目的。3．煮沸消毒急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15min后使用。五、注意事項1．清洗玻璃制品時，浸酸之后一定要用自來水沖洗10—15次。因為殘存的洗液對細(xì)胞粘附有很大影響。清洗塑料制品時要用棉花或柔軟紗布擦洗。千萬不要用硬毛刷，否則損害塑料表面后細(xì)胞不易貼壁。Tip和Tube一定要用超聲清洗處理后逐個清洗。如沒有洗凈會影響下一次使用的效果。2．干熱滅菌時，應(yīng)在白天使用烤箱，并不斷觀察，以免發(fā)生意外。當(dāng)溫度超過100℃時，不能再打開烤箱門。器皿烤完后，待溫度降至100℃之下才能開烤箱門。金屬器械和橡膠、塑料制品不能使用干熱滅菌方法。．3．高壓滅菌后器皿務(wù)必晾干或烘干，以防包裝紙潮濕發(fā)霉。4．牛血清、大部分培養(yǎng)基、胰酶和一些生物制劑是有機(jī)溶液，均不能高壓(如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，異硫氰酸胍，MOPS等)。5．濾過除菌時，濾器在使用前先裝好濾膜(有時可在上面加一層定性濾紙)，包好，經(jīng)高壓滅菌后才能使用。濾過酶類制劑時應(yīng)待濾器溫度降至室溫下再進(jìn)行。過濾時壓力不宜過大，壓力數(shù)字以2為宜。壓力太大時微孔濾膜可能破裂，或使某些微生物變形而通過濾膜。裝濾膜時位置要準(zhǔn)確。另外濾器包裝時，螺釘不要擰得太緊，以防高壓蒸汽不能進(jìn)入，待高壓滅菌之后，再擰緊使用。6．使用化學(xué)消毒法時，配制75％酒精應(yīng)用衛(wèi)生級，不要用化學(xué)純、分析純和優(yōu)質(zhì)純酒精。來蘇兒水不能用于皮膚消毒，它對皮膚有刺激性。空氣消毒時，所有的物品要事先準(zhǔn)備齊全并使消毒者有較方便的退出途徑。因為甲醛或乳酸加熱后放出的蒸氣對人的角膜和呼吸道上皮有嚴(yán)重的刺激和傷害作用。六、思考題1．哪些物品適合于高壓滅菌，并說明理由。2．紫外線消毒的適用范圍和目的是什么?II、傳代細(xì)胞培養(yǎng)與觀察一、實驗?zāi)康牧私鈧鞔?xì)胞的傳代方法及操作過程，學(xué)習(xí)觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生長狀況二、實驗原理傳代培養(yǎng)是指細(xì)胞從一個培養(yǎng)瓶以1：2或1：2以上的比例轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。這種培養(yǎng)，第一步也是制備細(xì)胞懸液，當(dāng)細(xì)胞長成致密單層時，它很容易被蛋白水解酶和EDTA)所破壞。所以—般采用胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸鹽)的混合物，做為消化液。細(xì)胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒灱夹g(shù)。要使細(xì)胞能在體外長期生長，必須滿足兩個基本要求：一是供給細(xì)胞存活所必需的條件，如適量的水、無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸堿度和滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴(yán)格控制無菌條件。三、實驗用品1、器材解剖剪、解剖鑷、眼科剪(尖頭、彎頭)、眼科鑷(尖頭、彎頭)、培養(yǎng)皿、量筒、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、培養(yǎng)瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均須徹底清洗、烤干、包裝好，9．9xl04Pa(15磅)滅菌30min此外，還有顯微鏡、血細(xì)胞計數(shù)器、血細(xì)胞計數(shù)板、酒精燈、酒精棉球、碘酒棉球、試管架、標(biāo)記筆、解剖板等。2、試劑L磷酸鹽緩沖液(PBs)無鈣、鎂溶液細(xì)胞消化液：o．5％胰蛋白酶和o．4%EDTAEMEM液3%谷氨酰胺o．5％臺盤藍(lán)染液等3、材料喉癌細(xì)胞四、實驗方法在做傳代細(xì)胞培養(yǎng)之前，首先將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下，觀察培養(yǎng)瓶中細(xì)胞是否已長成致密單層，如已長成單層，即可進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。1.營養(yǎng)液配制:EMEM液

90%犢牛血清

10%雙抗(1萬單位／m1)

加至約100單位／m13％谷氛酞胺

1m17．4％NaHCO3

調(diào)pH至6．8—7．02．換液:在酒精燈旁打開瓶塞，倒去瓶中的細(xì)胞營養(yǎng)液。3.消化與分裝在上述瓶中加入1mlEDTA溶液，輕輕搖動，將溶液倒出。重復(fù)上述動作。加入適量消化液（0.02%EDTA或0.04％EDTA1ml十o．5％胰蛋白酶液0.2ml）以蓋滿細(xì)胞為宜，置于室溫，停留1—2min后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，肉眼觀察細(xì)胞單層是否出現(xiàn)縫隙(針孔大小的空隙)，如出現(xiàn)縫隙，即可倒去消化液；如末出現(xiàn)縫隙，則可將瓶翻回，繼續(xù)進(jìn)行消化，直到出現(xiàn)縫隙為讓。此時，可倒去消化液，加入新配制的營養(yǎng)液20m1。然后用吸管吸取培養(yǎng)瓶中的營4．培養(yǎng)分裝好的細(xì)胞瓶上，做好標(biāo)志，注明細(xì)胞代號、日期。置于培養(yǎng)架上，輕搖使細(xì)胞均勻分布，以免堆積成團(tuán)。然后置于37℃培養(yǎng)。5.觀察(1)觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的幾個問題；細(xì)胞培養(yǎng)24h后，即可進(jìn)行觀察，觀察的重點如下：A.首先要觀察培養(yǎng)細(xì)胞是否污染。主要觀察培養(yǎng)液顏色的變化及混濁度B.觀察培養(yǎng)姬顏色變化及細(xì)胞是否生長。C.如細(xì)胞已生長，則要觀察細(xì)胞的形態(tài)特征并判斷其所處的生長階段。觀察時可參照(2)的描述進(jìn)行。D．觀察完畢，可用臺盤藍(lán)染液對細(xì)胞進(jìn)行染色。以確定死、活細(xì)胞的比例。(2)細(xì)胞的生長階段及其形態(tài)特征傳代培養(yǎng)的細(xì)胞需逐日進(jìn)行觀察，注意細(xì)胞有無污染，培養(yǎng)液顏色的變化及細(xì)胞生長的情況。—般中層培養(yǎng)的細(xì)胞，從培養(yǎng)開始，經(jīng)過生長、繁殖、衰老及死亡的全過程。它是一個連續(xù)的生長過程，但為了觀察及描述，人為地將具分為5個時期，但各期間無明顯絕對界限?，F(xiàn)分別描述如下：A．游離期：當(dāng)細(xì)胞經(jīng)消化分散成單個細(xì)胞后，由于細(xì)胞原生質(zhì)的收縮相表面張力以及細(xì)胞膜的彈性。所以，此時細(xì)胞多為圓形，折光率高，此期可延續(xù)數(shù)h。B．吸附期(貼壁)：由于細(xì)胞的附壁持性，細(xì)胞懸液靜置培養(yǎng)一段時間(約7—8h)后，便附著在瓶壁上(此期不同細(xì)胞所需時間不同)。在顯微鏡下觀察時可見瓶壁上有各種形態(tài)的細(xì)胞，如圓形、扁形、短菱形。細(xì)胞的特點，大多立體感強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)顆粒少，透明。C.繁殖期：培養(yǎng)l2h以后直到72h，細(xì)胞進(jìn)入繁殖期，加速了細(xì)胞生長和分裂。此期包括由幾個細(xì)胞形成的細(xì)胞島(即由少數(shù)細(xì)胞緊