實(shí)時(shí)熒光定量PCR介紹課件

實(shí)時(shí)熒光定量PCR介紹寶生物工程（大連）有限公司11/12/2022實(shí)時(shí)熒光定量PCR介紹寶生物工程（大連）有限公司11/10/主要內(nèi)容RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)12RealTimePCR實(shí)驗(yàn)方法3RealTimePCR解析方法4RealTimePCR應(yīng)用實(shí)例主要內(nèi)容RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)12RealRealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的檢測方法RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)1RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)1.RealTimeRealTimePCR的用途RealTimePCR用途定性分析定量分析病毒及病原菌定量分析導(dǎo)入基因拷貝數(shù)解析GMO定量檢測差異顯示結(jié)果驗(yàn)證基因芯片結(jié)果驗(yàn)證siRNA效果確認(rèn)mRNA表達(dá)量分析病毒及病原菌檢測物種鑒定基因分型絕對定量相對定量RealTimePCR的用途RealTimePCR用RealTimePCR的原理

激發(fā)光發(fā)射光使用RealTimePCR擴(kuò)增裝置實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行分析的方法。RealTimePCRCt值RealTimePCR的原理RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的檢測方法RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)1RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)1.RealTimeTaqManProbeCyclingProbeMolecularBeaconetc.SYBRGreenI熒光染料嵌合法熒光探針法RealTimePCR的檢測方法TaqManProbeCyclingMolecularetc熒光染料嵌合法（SYBRGreenI）SYBRGreenI：是一種能結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的 具有綠色激發(fā)波長的染料。SYBRGreenI熒光染料嵌合法（SYBRGreenI）SYBRGreePrimer退火FFFFSYBRGreenI法作用機(jī)理示意圖Pol.FPrimerPol.延伸FFFFFFPrimer熱變性FFFFPrimer退火FFFFSYBRGreenI法TaqMan法作用機(jī)理TaqMan探針為一寡核苷酸，5’端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告基團(tuán)（Reporter），3’端標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)（Quencher）。RQTaqMan法作用機(jī)理TaqMan探針為一寡核苷酸，RQRQPrimerRQPrimerRQPrimerPol.Pol.熱變性退火延伸TaqManProbe法原理示意圖

RQPrimerRQPrimerRQPrimerPol.PoOne-StepRT-PCR特異性高多重PCR檢出Probe設(shè)計(jì)要求高

Probe法

Probe合成費(fèi)用高SYBRGreenI法與Probe法比較常用于mRNA表達(dá)量分析等SYBRGreenI法

簡便易行價(jià)格便宜要求反應(yīng)的特異性不能進(jìn)行多重PCR常用于SNP解析，病毒、病源菌檢測One-StepRT-PCR特異性高多重PCR檢主要內(nèi)容2RealTimePCR實(shí)驗(yàn)方法反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)RealTimePCR反應(yīng)主要內(nèi)容2RealTimePCR實(shí)驗(yàn)方法反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)RT

Primer的選擇

RandomPrimer

OligodTPrimerGeneSpecificPrimerRandom6merPrimerGeneSpecificPrimerOligodTPrimerPCRR-PrimerPCRF-PrimerRTPrimer的選擇RandomPrimerRa目的片段在距Poly(A)Tail1.5kbp以內(nèi)適用，RT效率較高。OneStepRT-PCR只能使用GeneSpecificPrimer，但不適用于復(fù)數(shù)基因的檢出。5’3’GeneSpecificPrimer目的片段RFAAA···5’3’目的片段RF1,500baseOligodTPrimerRandom目的片段5’3’RF目的片段在mRNA任何位置都能使用。通常mRNA表達(dá)量分析最適。OligodTPrimer5’3’RFAAA···目的片段Random適用于mRNA表達(dá)量分析，提升反應(yīng)檢測的靈敏度。RT

Primer的選擇目的片段在距Poly(A)Tail1.5kbp以內(nèi)適RealTimePCR引物設(shè)計(jì)目的是獲得目的基因，對非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求不嚴(yán)格。目的是讓目的基因按照理論值進(jìn)行擴(kuò)增，對非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求嚴(yán)格。RealTimePCR用引物與普通PCR引物設(shè)計(jì)要求不同=>對引物設(shè)計(jì)要求嚴(yán)格普通PCR引物RealTimePCR引物RealTimePCR引物設(shè)計(jì)目的是獲得目的基因，對非特兩條引物的Tm值盡量接近，應(yīng)用專用軟件計(jì)算Tm值★★★Tm值40-60%(最好45-55%)

★GC含量Primer長度80-150bp(盡量限制在300bp以內(nèi))★擴(kuò)增片段大小★17-25base使用BLAST檢索，確認(rèn)引物特異性★★★特異性

△

引物內(nèi)部或兩條引物之間避免3base以上的互補(bǔ)序列

△

引物3’末端避免2base以上的互補(bǔ)序列★★★互補(bǔ)性3’末端序列

△

整體上堿基不能過偏

△

個(gè)別部分避免GCrich或ATrich(特別是3’端)

△

避免T/C連續(xù)，A/G連續(xù)★序列★

△

3’末端避免GCrich或ATrich

△

3’末端堿基最好為G或C

△

3’末端堿基盡量避免為T盡量在Exonjunction上設(shè)計(jì)引物，限制基因組DNA擴(kuò)增★★★RT-PCR用引物RealTimePCR引物設(shè)計(jì)原則兩條引物的Tm值盡量接近，應(yīng)用專用軟件計(jì)算Tm值★★★T探針的Tm比引物高8-10℃★★★Tm值20-24bp★★Probe長度探針5’末端的第一個(gè)堿基不能是G★5’末端序列△目的序列GC含量相對較高的區(qū)域設(shè)計(jì)

△整體上堿基不能過偏

△個(gè)別部分避免GCrich或ATrich(特別是3’端)；避免T/C

連續(xù)，A/C連續(xù)★序列Probe內(nèi)部或Probe與兩條引物之間避免3base以上的互補(bǔ)序列★★★互補(bǔ)性BLAST檢索確認(rèn)Probe特異性★★★特異性RealTimePCR用TaqMan探針設(shè)計(jì)原則RealTimePCR探針設(shè)計(jì)原則探針的Tm比引物高8-10℃★★★Tm值20-24bp線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)檢測靈敏度確認(rèn)PCR擴(kuò)增效率（E）：0.8-1.235Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果。如果采用SYBR檢測方法，30Cycles內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。NoTemplateControl確認(rèn)30Cycles內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生。相關(guān)系數(shù)（r2）：大于0.98反應(yīng)性能確認(rèn)線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)檢測靈敏度確認(rèn)PCR擴(kuò)增效率（E）：0主要內(nèi)容3RealTimePCR解析方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線分析2.融解曲線分析3.絕對定量和相對定量解析方法主要內(nèi)容3RealTimePCR解析方法1.標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作擴(kuò)增曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)品梯度的選擇：5～6個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)的選擇：標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)通常為10105104103102101100

105

104103102101100標(biāo)準(zhǔn)曲線制作擴(kuò)增曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)品梯度的選擇：5～6個(gè)梯度1標(biāo)準(zhǔn)品的種類基因組DNA

質(zhì)粒TotalRNA&cDNA

體外轉(zhuǎn)錄RNADNA樣品定量標(biāo)準(zhǔn)品

RNA樣品定量標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品的種類基因組DNATotalRNA&cDNA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建流程基因組DNAPCR目的基因克隆目的基因目的基因目的基因質(zhì)粒質(zhì)粒提取，OD值定量。將質(zhì)粒梯度稀釋至105-101copies/ul，作為標(biāo)準(zhǔn)品。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建流程基因組DNAPCR目的基因克隆目的基因目的體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建流程RNA純化后，測OD定量。將RNA梯度稀釋至105-101copies/ul，作為標(biāo)準(zhǔn)品。T7RNApolymerase體外轉(zhuǎn)錄RNATotalRNAPCRcDNARTT7PromoterTTTT???TPCR產(chǎn)物目的基因目的基因目的基因AAAA???AAAAA???A體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建流程RNA純化后，測OD定量。將RN理想的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線基線平整NegativeControl為水平線指數(shù)區(qū)較明顯，陡度大平臺(tái)區(qū)匯于一起線性范圍寬理想的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線基線平整理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線

相關(guān)系數(shù)（r2）：大于0.98，越接近1，結(jié)果可信度越高。擴(kuò)增效率（E）：0.8-1.2，越接近1，越理想。擴(kuò)增效率

相關(guān)系數(shù)

擴(kuò)增效率（E）計(jì)算方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線X軸表示起始模板濃度（log10)，Y軸表示Ct值時(shí)

E=10-1/a-1

標(biāo)準(zhǔn)曲線X軸表示Ct值，Y軸表示起始模板濃度（log10)E=10-a-1理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)（r2）：大于0.98，越接近1，結(jié)RealTimePCR解析方法3RealTimePCR解析方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線分析2.融解曲線分析3.絕對定量和相對定量解析方法RealTimePCR解析方法3RealTimePC融解曲線分析

Tm值是指雙鏈DNA分子解鏈一半時(shí)的溫度。

SYBRGreenI法進(jìn)行檢出時(shí)，要根據(jù)融解曲線確認(rèn)PCR產(chǎn)物的特異性。融解曲線分析Tm值是指雙鏈DNA分子解鏈一半時(shí)的溫度。特異性產(chǎn)物非特異產(chǎn)物引物二聚體對PCR產(chǎn)物特異性進(jìn)行分析融解曲線分析特異性產(chǎn)物非特異產(chǎn)物引物二聚體對PCR產(chǎn)物特異性進(jìn)行分析融解3RealTimePCR解析方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線分析2.融解曲線分析3.絕對定量和相對定量解析方法RealTimePCR解析方法3RealTimePCR解析方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線分析2.絕對定量解析方法提取樣品引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)品制備RealTimePCR反應(yīng)數(shù)據(jù)分析流程絕對定量解析方法提取樣品引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)品制備RealTime絕對定量解析方法通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定樣品的初始模板拷貝數(shù)或濃度。通常應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、衣原體、支原體的定量檢測及轉(zhuǎn)基因食品的檢測。105104103101擴(kuò)增曲線圖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

檢測樣品檢測樣品102絕對定量解析方法通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定樣品的初始模板拷貝數(shù)或相對定量解析方法以上條件不可能同時(shí)得到滿足，必須用內(nèi)對照基因（管家基因）校正，進(jìn)行相對表達(dá)量分析。SampleBSampleA目的基因擴(kuò)增效率相同RNA提取效率相同細(xì)胞起始數(shù)相同進(jìn)行相對表達(dá)量分析必要性實(shí)際上目的基因表達(dá)量分析相對定量解析方法以上條件不可能同時(shí)得到滿足，必須用內(nèi)對照基因相對定量解析方法管家基因

維持細(xì)胞基本代謝活動(dòng)所必須的基因,如：GAPDH、β-actin等。篩選方法

根據(jù)文獻(xiàn)提供通過具體實(shí)驗(yàn)篩選相對定量解析方法管家基因篩選方法根據(jù)文獻(xiàn)提供主要內(nèi)容RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)12RealTimePCR實(shí)驗(yàn)方法3RealTimePCR解析方法4RealTimePCR應(yīng)用實(shí)例

對SARS病毒基因進(jìn)行定量分析絕對定量相對定量

分析小鼠PAH基因在不同組織中的表達(dá)量變化主要內(nèi)容RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)12Real絕對定量應(yīng)用例

對SARS樣品中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量檢測方法

TaqMan?

probe法

檢測樣品3個(gè)從SARS樣品中提取的TotalRNA

目的基因

SARS病毒RNA

內(nèi)參

SARSInternalControl

RNA

標(biāo)準(zhǔn)品

SARSControlRNA

試劑

OneStepPrimeScript?RT-PCRKit（PerfectRealTime）（DRR064）

儀器

SmartCyclerⅡ絕對定量應(yīng)用例對SARS樣品中所含SARS病毒RN

SYN247F02SYN247R03SYN247F01SYN247R02SYN247R01SYN247F01BamHⅠ

HindⅢpBluescriptIISK(+)VectorT7PromoterBamHⅠ

HindⅢSacⅠsiteSARSControlRNA構(gòu)建絕對定量應(yīng)用例

對SARS培養(yǎng)液中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量SYN247F02SYN247R03SYN247F0

純化的SARSControlRNAOD值測定結(jié)果

體外轉(zhuǎn)錄的SARSControlRNA電泳照片M1M2M1:-HindⅢdigestM2:DL2,000MarkerDNaseI處理前DNaseI處理后絕對定量應(yīng)用例

對SARS樣品中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量純化的SARSControlRNAOD值測定結(jié)果DNA

BNITMSARAs2AdaptorRSacⅠsiteBamHⅠsiteBNITMSARS1AdaptorFT7PromoterSARSInternalControlRNA的構(gòu)建AApBluescriptIISK(+)Vector

絕對定量應(yīng)用例

對SARS樣品中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量DNABNITMSARAs2AdaptorRSac探針的選擇

TemplatePrimerTaqMan?Probe5’端報(bào)告基團(tuán)3’端淬滅基團(tuán)SARSControlRNAorSARSGenomicRNA共用FAM標(biāo)記Eclipse標(biāo)記SARSInternalControlRNA共用ROX標(biāo)記Eclipse標(biāo)記絕對定量應(yīng)用例

對SARS樣品中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量探針的選擇TemplatePrimerTaqMan?PrSARSControlRNA105-101擴(kuò)增曲線SARSGenomicRNASample1、２、３擴(kuò)增曲線

SARSInternalControlRNA擴(kuò)增曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線絕對定量應(yīng)用例

對SARS樣品中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量SARSControlRNA105-101擴(kuò)增曲線S定量結(jié)果對三個(gè)樣品所含SARS病毒RNA進(jìn)行了準(zhǔn)確定量。絕對定量應(yīng)用例

對SARS樣品中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量定量結(jié)果對三個(gè)樣品所含SARS病毒RNA進(jìn)行了準(zhǔn)確定量。絕對相對定量應(yīng)用例

分析小鼠不同組織中PAH基因表達(dá)量的變化情況檢測方法

SYBRGreenI熒光嵌合法管家基因

GAPDH基因目的基因

PAH基因標(biāo)準(zhǔn)品

cDNA試劑

PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（DRR047）SYBR?

PremixExTaqTMII(TliRNaseHPlus)（DRR820）儀器

ThermalCyclerDice?RealTimeSystem（TP800）

相對定量應(yīng)用例分析小鼠不同組織中PAH基因表達(dá)量的變化情TotalRNA提取TotalRNA基因組DNA去除標(biāo)準(zhǔn)品RNA制備標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及預(yù)實(shí)驗(yàn)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)資料獲取實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及引物設(shè)計(jì)、合成樣品RealTimePCR反應(yīng)相對定量計(jì)算及數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)整理及論文撰寫相對定量應(yīng)用例

分析小鼠不同組織中PAH基因表達(dá)量的變化情況TotalRNA基因組標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及預(yù)實(shí)驗(yàn)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)資料獲提取TotalRNA后電泳照片提取試劑：TaKaRaRNAisoPlus

（D9108）相對定量應(yīng)用例

分析小鼠不同組織中PAH基因表達(dá)量的變化情況MCLBMM：DL2,000DNAMarkerC：ControlRNAL：LiverRNAB：BrainRNA提取TotalRNA后電泳照片提取試劑：TaKaRaRN目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線制作結(jié)果擴(kuò)增曲線圖融解曲線圖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖管家基因標(biāo)準(zhǔn)曲線制作結(jié)果相對定量應(yīng)用例

分析小鼠不同組織中PAH基因表達(dá)量的變化情況目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線制作結(jié)果擴(kuò)增曲線圖融解曲線圖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖管家基擴(kuò)增曲線圖樣品目的基因定量結(jié)果樣品管家基因定量結(jié)果管家基因GAPDH目的基因PAH定量結(jié)果平均值定量結(jié)果平均值通過GAPDH校正的PAH校正值小鼠肝臟和腦中PAH的相對表達(dá)量樣品a12288002221751966002011750.9053757212700204400樣品a2227300207100219900196600樣品b133360034097576.8082.182.41×10-4134030092.65樣品b235410082.4633590076.80相對定量應(yīng)用例

分析小鼠不同組織中PAH基因表達(dá)量的變化情況擴(kuò)增曲線圖樣品目的基因定量結(jié)果樣品管家基因定量結(jié)果管家基因通過雙標(biāo)準(zhǔn)曲線方法計(jì)算得出，苯丙氨酸羥化酶（PAH）基因在小鼠肝臟中的表達(dá)量明顯高于其在腦組織中的表達(dá)水平，二者的表達(dá)量比例約為3757：1。相對定量應(yīng)用例

分析小鼠不同組織中PAH基因表達(dá)量的變化情況通過雙標(biāo)準(zhǔn)曲線方法計(jì)算得出，苯丙氨酸羥化酶（PRealTimePCR試劑使用SYBR?GreenI法檢測使用探針法檢測使用熒光探針檢測使用Cycling探針檢測擴(kuò)增的模板GC含量高或含有重復(fù)序列RealTimePCR試劑使用SYBR?GreenRealTimeRT-PCR試劑使用SYBR?GreenI法檢測使用探針法檢測使用熒光探針檢測使用Cycling探針檢測RealTimeRT-PCR試劑使用SYBR?Gr高質(zhì)量的產(chǎn)品、完善的服務(wù)HighQualityProducts&RapidReliableServiceThankYou!高質(zhì)量的產(chǎn)品、完善的服務(wù)HighQualityProdu

剛才的發(fā)言，如有不當(dāng)之處請多指正。謝謝大家！52剛才的發(fā)言，如有不當(dāng)之處請多指正。謝謝大家！5實(shí)時(shí)熒光定量PCR介紹寶生物工程（大連）有限公司11/12/2022實(shí)時(shí)熒光定量PCR介紹寶生物工程（大連）有限公司11/10/主要內(nèi)容RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)12RealTimePCR實(shí)驗(yàn)方法3RealTimePCR解析方法4RealTimePCR應(yīng)用實(shí)例主要內(nèi)容RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)12RealRealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的檢測方法RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)1RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)1.RealTimeRealTimePCR的用途RealTimePCR用途定性分析定量分析病毒及病原菌定量分析導(dǎo)入基因拷貝數(shù)解析GMO定量檢測差異顯示結(jié)果驗(yàn)證基因芯片結(jié)果驗(yàn)證siRNA效果確認(rèn)mRNA表達(dá)量分析病毒及病原菌檢測物種鑒定基因分型絕對定量相對定量RealTimePCR的用途RealTimePCR用RealTimePCR的原理

激發(fā)光發(fā)射光使用RealTimePCR擴(kuò)增裝置實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行分析的方法。RealTimePCRCt值RealTimePCR的原理RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)1.RealTimePCR的用途及原理2.RealTimePCR的檢測方法RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)1RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)1.RealTimeTaqManProbeCyclingProbeMolecularBeaconetc.SYBRGreenI熒光染料嵌合法熒光探針法RealTimePCR的檢測方法TaqManProbeCyclingMolecularetc熒光染料嵌合法（SYBRGreenI）SYBRGreenI：是一種能結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的 具有綠色激發(fā)波長的染料。SYBRGreenI熒光染料嵌合法（SYBRGreenI）SYBRGreePrimer退火FFFFSYBRGreenI法作用機(jī)理示意圖Pol.FPrimerPol.延伸FFFFFFPrimer熱變性FFFFPrimer退火FFFFSYBRGreenI法TaqMan法作用機(jī)理TaqMan探針為一寡核苷酸，5’端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告基團(tuán)（Reporter），3’端標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)（Quencher）。RQTaqMan法作用機(jī)理TaqMan探針為一寡核苷酸，RQRQPrimerRQPrimerRQPrimerPol.Pol.熱變性退火延伸TaqManProbe法原理示意圖

RQPrimerRQPrimerRQPrimerPol.PoOne-StepRT-PCR特異性高多重PCR檢出Probe設(shè)計(jì)要求高

Probe法

Probe合成費(fèi)用高SYBRGreenI法與Probe法比較常用于mRNA表達(dá)量分析等SYBRGreenI法

簡便易行價(jià)格便宜要求反應(yīng)的特異性不能進(jìn)行多重PCR常用于SNP解析，病毒、病源菌檢測One-StepRT-PCR特異性高多重PCR檢主要內(nèi)容2RealTimePCR實(shí)驗(yàn)方法反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)RealTimePCR反應(yīng)主要內(nèi)容2RealTimePCR實(shí)驗(yàn)方法反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)RT

Primer的選擇

RandomPrimer

OligodTPrimerGeneSpecificPrimerRandom6merPrimerGeneSpecificPrimerOligodTPrimerPCRR-PrimerPCRF-PrimerRTPrimer的選擇RandomPrimerRa目的片段在距Poly(A)Tail1.5kbp以內(nèi)適用，RT效率較高。OneStepRT-PCR只能使用GeneSpecificPrimer，但不適用于復(fù)數(shù)基因的檢出。5’3’GeneSpecificPrimer目的片段RFAAA···5’3’目的片段RF1,500baseOligodTPrimerRandom目的片段5’3’RF目的片段在mRNA任何位置都能使用。通常mRNA表達(dá)量分析最適。OligodTPrimer5’3’RFAAA···目的片段Random適用于mRNA表達(dá)量分析，提升反應(yīng)檢測的靈敏度。RT

Primer的選擇目的片段在距Poly(A)Tail1.5kbp以內(nèi)適RealTimePCR引物設(shè)計(jì)目的是獲得目的基因，對非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求不嚴(yán)格。目的是讓目的基因按照理論值進(jìn)行擴(kuò)增，對非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求嚴(yán)格。RealTimePCR用引物與普通PCR引物設(shè)計(jì)要求不同=>對引物設(shè)計(jì)要求嚴(yán)格普通PCR引物RealTimePCR引物RealTimePCR引物設(shè)計(jì)目的是獲得目的基因，對非特兩條引物的Tm值盡量接近，應(yīng)用專用軟件計(jì)算Tm值★★★Tm值40-60%(最好45-55%)

★GC含量Primer長度80-150bp(盡量限制在300bp以內(nèi))★擴(kuò)增片段大小★17-25base使用BLAST檢索，確認(rèn)引物特異性★★★特異性

△

引物內(nèi)部或兩條引物之間避免3base以上的互補(bǔ)序列

△

引物3’末端避免2base以上的互補(bǔ)序列★★★互補(bǔ)性3’末端序列

△

整體上堿基不能過偏

△

個(gè)別部分避免GCrich或ATrich(特別是3’端)

△

避免T/C連續(xù)，A/G連續(xù)★序列★

△

3’末端避免GCrich或ATrich

△

3’末端堿基最好為G或C

△

3’末端堿基盡量避免為T盡量在Exonjunction上設(shè)計(jì)引物，限制基因組DNA擴(kuò)增★★★RT-PCR用引物RealTimePCR引物設(shè)計(jì)原則兩條引物的Tm值盡量接近，應(yīng)用專用軟件計(jì)算Tm值★★★T探針的Tm比引物高8-10℃★★★Tm值20-24bp★★Probe長度探針5’末端的第一個(gè)堿基不能是G★5’末端序列△目的序列GC含量相對較高的區(qū)域設(shè)計(jì)

△整體上堿基不能過偏

△個(gè)別部分避免GCrich或ATrich(特別是3’端)；避免T/C

連續(xù)，A/C連續(xù)★序列Probe內(nèi)部或Probe與兩條引物之間避免3base以上的互補(bǔ)序列★★★互補(bǔ)性BLAST檢索確認(rèn)Probe特異性★★★特異性RealTimePCR用TaqMan探針設(shè)計(jì)原則RealTimePCR探針設(shè)計(jì)原則探針的Tm比引物高8-10℃★★★Tm值20-24bp線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)檢測靈敏度確認(rèn)PCR擴(kuò)增效率（E）：0.8-1.235Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果。如果采用SYBR檢測方法，30Cycles內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。NoTemplateControl確認(rèn)30Cycles內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生。相關(guān)系數(shù)（r2）：大于0.98反應(yīng)性能確認(rèn)線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)檢測靈敏度確認(rèn)PCR擴(kuò)增效率（E）：0主要內(nèi)容3RealTimePCR解析方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線分析2.融解曲線分析3.絕對定量和相對定量解析方法主要內(nèi)容3RealTimePCR解析方法1.標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作擴(kuò)增曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)品梯度的選擇：5～6個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)的選擇：標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)通常為10105104103102101100

105

104103102101100標(biāo)準(zhǔn)曲線制作擴(kuò)增曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)品梯度的選擇：5～6個(gè)梯度1標(biāo)準(zhǔn)品的種類基因組DNA

質(zhì)粒TotalRNA&cDNA

體外轉(zhuǎn)錄RNADNA樣品定量標(biāo)準(zhǔn)品

RNA樣品定量標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品的種類基因組DNATotalRNA&cDNA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建流程基因組DNAPCR目的基因克隆目的基因目的基因目的基因質(zhì)粒質(zhì)粒提取，OD值定量。將質(zhì)粒梯度稀釋至105-101copies/ul，作為標(biāo)準(zhǔn)品。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建流程基因組DNAPCR目的基因克隆目的基因目的體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建流程RNA純化后，測OD定量。將RNA梯度稀釋至105-101copies/ul，作為標(biāo)準(zhǔn)品。T7RNApolymerase體外轉(zhuǎn)錄RNATotalRNAPCRcDNARTT7PromoterTTTT???TPCR產(chǎn)物目的基因目的基因目的基因AAAA???AAAAA???A體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建流程RNA純化后，測OD定量。將RN理想的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線基線平整NegativeControl為水平線指數(shù)區(qū)較明顯，陡度大平臺(tái)區(qū)匯于一起線性范圍寬理想的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線基線平整理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線

相關(guān)系數(shù)（r2）：大于0.98，越接近1，結(jié)果可信度越高。擴(kuò)增效率（E）：0.8-1.2，越接近1，越理想。擴(kuò)增效率

相關(guān)系數(shù)

擴(kuò)增效率（E）計(jì)算方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線X軸表示起始模板濃度（log10)，Y軸表示Ct值時(shí)

E=10-1/a-1

標(biāo)準(zhǔn)曲線X軸表示Ct值，Y軸表示起始模板濃度（log10)E=10-a-1理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)（r2）：大于0.98，越接近1，結(jié)RealTimePCR解析方法3RealTimePCR解析方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線分析2.融解曲線分析3.絕對定量和相對定量解析方法RealTimePCR解析方法3RealTimePC融解曲線分析

Tm值是指雙鏈DNA分子解鏈一半時(shí)的溫度。

SYBRGreenI法進(jìn)行檢出時(shí)，要根據(jù)融解曲線確認(rèn)PCR產(chǎn)物的特異性。融解曲線分析Tm值是指雙鏈DNA分子解鏈一半時(shí)的溫度。特異性產(chǎn)物非特異產(chǎn)物引物二聚體對PCR產(chǎn)物特異性進(jìn)行分析融解曲線分析特異性產(chǎn)物非特異產(chǎn)物引物二聚體對PCR產(chǎn)物特異性進(jìn)行分析融解3RealTimePCR解析方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線分析2.融解曲線分析3.絕對定量和相對定量解析方法RealTimePCR解析方法3RealTimePCR解析方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線分析2.絕對定量解析方法提取樣品引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)品制備RealTimePCR反應(yīng)數(shù)據(jù)分析流程絕對定量解析方法提取樣品引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)品制備RealTime絕對定量解析方法通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定樣品的初始模板拷貝數(shù)或濃度。通常應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、衣原體、支原體的定量檢測及轉(zhuǎn)基因食品的檢測。105104103101擴(kuò)增曲線圖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

檢測樣品檢測樣品102絕對定量解析方法通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定樣品的初始模板拷貝數(shù)或相對定量解析方法以上條件不可能同時(shí)得到滿足，必須用內(nèi)對照基因（管家基因）校正，進(jìn)行相對表達(dá)量分析。SampleBSampleA目的基因擴(kuò)增效率相同RNA提取效率相同細(xì)胞起始數(shù)相同進(jìn)行相對表達(dá)量分析必要性實(shí)際上目的基因表達(dá)量分析相對定量解析方法以上條件不可能同時(shí)得到滿足，必須用內(nèi)對照基因相對定量解析方法管家基因

維持細(xì)胞基本代謝活動(dòng)所必須的基因,如：GAPDH、β-actin等。篩選方法

根據(jù)文獻(xiàn)提供通過具體實(shí)驗(yàn)篩選相對定量解析方法管家基因篩選方法根據(jù)文獻(xiàn)提供主要內(nèi)容RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)12RealTimePCR實(shí)驗(yàn)方法3RealTimePCR解析方法4RealTimePCR應(yīng)用實(shí)例

對SARS病毒基因進(jìn)行定量分析絕對定量相對定量

分析小鼠PAH基因在不同組織中的表達(dá)量變化主要內(nèi)容RealTimePCR基礎(chǔ)知識(shí)12Real絕對定量應(yīng)用例

對SARS樣品中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量檢測方法

TaqMan?

probe法

檢測樣品3個(gè)從SARS樣品中提取的TotalRNA

目的基因

SARS病毒RNA

內(nèi)參

SARSInternalControl

RNA

標(biāo)準(zhǔn)品

SARSControlRNA

試劑

OneStepPrimeScript?RT-PCRKit（PerfectRealTime）（DRR064）

儀器

SmartCyclerⅡ絕對定量應(yīng)用例對SARS樣品中所含SARS病毒RN

SYN247F02SYN247R03SYN247F01SYN247R02SYN247R01SYN247F01BamHⅠ

HindⅢpBluescriptIISK(+)VectorT7PromoterBamHⅠ

HindⅢSacⅠsiteSARSControlRNA構(gòu)建絕對定量應(yīng)用例

對SARS培養(yǎng)液中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量SYN247F02SYN247R03SYN247F0

純化的SARSControlRNAOD值測定結(jié)果

體外轉(zhuǎn)錄的SARSControlRNA電泳照片M1M2M1:-HindⅢdigestM2:DL2,000MarkerDNaseI處理前DNaseI處理后絕對定量應(yīng)用例

對SARS樣品中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量純化的SARSControlRNAOD值測定結(jié)果DNA

BNITMSARAs2AdaptorRSacⅠsiteBamHⅠsiteBNITMSARS1AdaptorFT7PromoterSARSInternalControlRNA的構(gòu)建AApBluescriptIISK(+)Vector

絕對定量應(yīng)用例

對SARS樣品中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量DNABNITMSARAs2AdaptorRSac探針的選擇

TemplatePrimerTaqMan?Probe5’端報(bào)告基團(tuán)3’端淬滅基團(tuán)SARSControlRNAorSARSGenomicRNA共用FAM標(biāo)記Eclipse標(biāo)記SARSInternalControlRNA共用ROX標(biāo)記Eclipse標(biāo)記絕對定量應(yīng)用例

對SARS樣品中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量探針的選擇TemplatePrimerTaqMan?PrSARSControlRNA105-101擴(kuò)增曲線SARSGenomicRNASample1、２、３擴(kuò)增曲線

SARSInternalControlRNA擴(kuò)增曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線絕對定量應(yīng)用例

對SARS樣品中所含SARS病毒RNA進(jìn)行定量SARSControlRNA105-101擴(kuò)增曲線S定量結(jié)果對三個(gè)樣品所含SARS病毒RNA進(jìn)行了準(zhǔn)確定量。絕對定量應(yīng)用例

對SARS樣品中所含SARS