HPLC流動相配制與使用注意事項(xiàng)

HPLC流動相配制與使?注意事項(xiàng)！引?？流動相是影響液相?譜的關(guān)鍵因素。?個理想的液相?譜流動相溶劑應(yīng)具有低粘度、與檢測器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。?效液相?譜法中的流動相主要??性溶劑、有機(jī)溶劑或它們的混合液，但是如何配制。選擇配制的?法不同，分析結(jié)果特別是保留時間，是會有顯著差別的。??效液相?譜法中的流動相主要??性溶劑、有機(jī)溶劑或它們的混合液，?性溶劑也常?于緩沖液。常因資料上表?的內(nèi)容和實(shí)際的配制?法不同，?產(chǎn)?流動相的差異，影響了?譜圖和分析結(jié)果。?般來說，溶劑的混合按體積?（V/V）或重量?（W/W）進(jìn)?。溶液的體積因溫度?變化，所以按重量?混合可調(diào)制再現(xiàn)性較好的混合溶劑，但由于操作較?煩，通常多?體積?混合。只要沒有特別標(biāo)明，就可按體積?進(jìn)?混合，但在特殊情況下，如胺類粘度?的溶液混合時，有時?重量—體積?（W/V）的?法。液相?譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換?達(dá)到分離的?的，因此要求流動相具備以下的特點(diǎn)：a、流動相對樣品具有?定的溶解能?，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。流動相溶解度達(dá)不到要求時，盡量選?流動相中含有的?例較?的成分，以減輕進(jìn)樣對流動相的影響造成基線不穩(wěn)。b、流動相與樣品不產(chǎn)?化學(xué)反應(yīng)，選?流動相配置對?譜峰影響最?。c、流動相的黏度要盡量?，以便得到好的分離效果；降低柱壓降，延長泵的使?壽命(可運(yùn)?提?溫度的?法降低流動相的黏度)。d、流動相的物化性質(zhì)要與使?的檢測器相適應(yīng)。如使?UV檢測器，最好使?對紫外吸收較低的溶劑配制。流動相組成溶劑均達(dá)不到要求時，選取的溶劑應(yīng)保證在設(shè)定波長內(nèi)?紫外吸收。e、流動相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)??泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)?法進(jìn)?。f、在流動相配制好后，?定要進(jìn)?脫?。除去溶解在流動相中的微量?體既有利于檢測，還可以防?流動相中的微量氧與樣品發(fā)?作?。下?21項(xiàng)注意讓你更懂液相流動相。1、選擇流動相應(yīng)注意過濾溶劑溶劑在使?前?定要?0.5μm的過濾器過濾，如果使?固體化學(xué)試劑（緩沖鹽）配制流動相，過濾特別重要，不能讓固體微粒污染泵，阻塞進(jìn)樣器和柱頭過濾?。本實(shí)驗(yàn)室有?溶性和脂溶性兩種過濾膜供選擇（反光?朝上），過濾?溶性流動相時（如甲醇/?），先?1～2mL甲醇潤濕過濾膜，有助于快速抽濾。2、注意保持儲液瓶的清潔?普通溶劑瓶作流動相儲液器應(yīng)不定期廢棄瓶?，最后?次應(yīng)?HPLC級的?或溶劑清洗，不能在清洗過程中留下污跡。3、注意保證溶劑的質(zhì)量?定要?HPLC級的溶劑，?也應(yīng)達(dá)到HPLC級，同樣也要使??純度的緩沖鹽。4、注意流動相脫?不充分流動相受熱，或者流動相不同組分混合時會有?體產(chǎn)?，?泡進(jìn)?泵內(nèi)引起壓?波動，增加噪?，?譜圖上出現(xiàn)?刺。可試?下列?法解決問題：流動相再脫?；采?更有效的脫??法或兩種?法配合使?；改系統(tǒng)內(nèi)混合為系統(tǒng)外預(yù)混合。HPLC所?流動相必須預(yù)先脫?，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出?泡，影響泵的?作。合。HPLC所?流動相必須預(yù)先脫?，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出?泡，影響泵的?作。系統(tǒng)中?泡的產(chǎn)?：流動相本?存在，梯度淋洗混合后放出?泡；?泡的影響：存在于管路中，系統(tǒng)壓?不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有偏差；存在于單向閥中，易造成液體回流，流量不準(zhǔn)確，甚?是不吸液存在于檢測器中，出現(xiàn)?峰，影響檢測準(zhǔn)確性。所以做液相對流動相的?泡和雜質(zhì)要求?較嚴(yán)格。?泡會影響柱的分離效率，檢測器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚?使?法檢測。（噪聲增?，基線不穩(wěn)，突然跳動）。此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚?固定相（如烷基胺）反應(yīng)。溶解?體還會引起溶劑pH的變化，對分離或分析結(jié)果帶來誤差。溶解氧能與某些溶劑（如，甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡(luò)合物，此絡(luò)合物會提?背景吸收（特別是在260nm以下），并導(dǎo)致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會在梯度淋洗時造成基線漂移或形成?峰（假峰）。在熒光檢測中，溶解氧在?定條件下還會引起淬滅現(xiàn)象，特別是對芳?烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應(yīng)可降低達(dá)95%。在電化學(xué)檢測中（特別是還原電化學(xué)法），氧的影響更?。除去流動相中的溶解氧將??提?UV檢測器的性能，也將改善在?些熒光檢測應(yīng)?中的靈敏度。常?的脫??法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對混合溶劑，若采?抽?或煮沸法，則需要考慮低沸點(diǎn)溶劑揮發(fā)造成的組成變化。（1）氦?脫?：氦?脫?是很有效的脫??法。氦?緩緩的通過流動相趕去溶?的空?，如果使?得當(dāng)，在10min內(nèi)可除去80%～90%的溶??體。由于氦?在流動相中的溶解度極低，所以?氦?脫?保護(hù)的流動相可以認(rèn)為是?個??體溶解體系。其缺點(diǎn)是氦?價格?較昂貴，會增加檢驗(yàn)成本。?般說來有機(jī)溶劑中的?體易脫除，??溶液中的?體較頑固。在溶液中吹氦是相當(dāng)有效的脫??法，這種連續(xù)脫?法在電化學(xué)檢測時經(jīng)常使?。但氦?昂貴，難于普及。（2）真空脫?：也是?較常?的脫??法?，F(xiàn)在多數(shù)企業(yè)都最常?這種辦法，貯液器被抽成部分真空，溶?的?體蒸發(fā)形成?泡溢出，其效果僅次于氦?脫?。象Agileng1200液相?譜使?的是在線脫?機(jī)。在線脫?只適合脫完?之后的流動相，在使?過程中的微量脫?。（3）超聲波脫?：將配制好的流動相連容器放?超聲?槽中脫?10～20min。這種?法?較簡便，?基本上能滿??常分析操作的要求，所以，?前仍?泛采?。這種?法只能除去30%的溶解?體，有時還會引起?體溶解度的增加。對氧敏感的檢測器不宜?此法。超聲脫??較好，10~20分鐘的超聲處理對許多有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑/?混合液的脫?是?夠了（?般500ml溶液需超聲20~30min?可），關(guān)于超聲時間問題眾說紛紜，各實(shí)驗(yàn)室內(nèi)5～30分鐘不等，?般來說流動相組成為?機(jī)（緩沖鹽溶液）時，5～15分鐘即可，流動相為是?和有機(jī)容積混合時，超聲時間要相對長?些，這個?法只能除去30%的溶解?體，時間的延長不和效果成正?，且其中?泡對?譜峰基線穩(wěn)定性與信噪?有?定影響，?般來說影響不?，15min超聲即可?夠。此法不影響溶劑組成。超聲時應(yīng)注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內(nèi)液?不要?出??太多。（4）加熱回流脫?：該?法雖然效果很好，但是適?范圍較窄。對于有機(jī)溶劑或混合流動相不適合?此法，因?yàn)閾]發(fā)性組分會損失掉，改變流動相的組成。綜合來說，?真空抽濾后，再?超聲脫?還是最常?的辦法，?氦?的?法是效果最好的辦法，?在線脫?本?也是真空脫?，但它可以放到儀器上使?，是?種保證性的辦法。A.離線（系統(tǒng)外）脫?法不能維持溶劑的脫?狀態(tài)，在你停?脫?后，?體?即開始回到溶劑中。在1~4?時內(nèi)，溶劑?將被環(huán)境?體所飽和。B.在線（系統(tǒng)內(nèi)）脫?法?此缺點(diǎn)。最常?的在線脫?法為?泡，即在?譜操作前和進(jìn)?時，將惰性?體噴?溶劑中。嚴(yán)格來說，此?法不能將溶劑脫?，它只是??種低溶解度的惰性?體（通常是氦）將空?替換出來。此外還有在線脫?機(jī)。5、注意流動相供給不暢流動相?完，管道中吸??體引起泵壓?不穩(wěn)。應(yīng)經(jīng)常觀察儲液器中流動相的量，加?流動相保證所有的樣品分析完畢。輸液管道上裝沉?沉?瓶底，儲液器蓋上留??孔正好夾住進(jìn)液管，使其不能上下移動。過濾器阻塞引起管道和泵腔空化，壓?不穩(wěn)。過濾器被微粒所阻塞或長霉，去掉過濾器后如果系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)正常，說明已找出問題，換上新的過濾器則可。有時候換上新的過濾器仍然不暢，那就需要查查流動相的制備過程，或者換?孔徑的過濾器。不管如何，流動相都需要重新過濾。流速過?、阻??，造成空化現(xiàn)象，這是由于過濾器孔徑、管道內(nèi)徑、流速和溶劑黏度等引起的。如果流速?于10mL/min，常會出現(xiàn)這種現(xiàn)象。使?下列?法解決：（1）使?低流速；（2）換?孔徑的過濾器；（3）增加進(jìn)液管道內(nèi)徑；（4）抬?或加壓儲液器；（5）不?過濾器，但流動相?定要先過濾；（6）儲液器蓋?太緊，在儲液器內(nèi)形成真空，打出的流動相不連續(xù)。應(yīng)松開蓋?或留有1mm的縫隙；（7）進(jìn)液管道阻塞或彎曲使泵抽不到液，注意調(diào)整進(jìn)液管道或更換新的。其它問題包括滲漏或接頭松動、泵部件損壞等，都能引起供液不正常。6、注意防?流動相和儲液器被污染由于污染，噪?越來越?，檢測器基線上升。污染物可能被泵以穩(wěn)定的濃度打?系統(tǒng)，?再以穩(wěn)定的濃度流出來，所以在?譜圖中不出多余的峰。?梯度洗脫時弱流動相可以使污染物聚在柱頂，流動相強(qiáng)度增加后污染物可能被洗脫出來?個?的偽峰。有時基線噪?突然增?或突然提?，都是因?yàn)榉磸?fù)加進(jìn)新的流動相或系統(tǒng)?得太久（通宵）所造成的。新加進(jìn)的流動相有污染物或者流動相長霉，繁殖了細(xì)菌。臟的儲液器會污染清潔的流動相。每種流動相備有專?的儲液器，或者定期報廢儲液器。流動相污染來?這?個??：試劑質(zhì)量不?，玻璃器?不合格；微?物的影響；配制流動相時操作不當(dāng)?shù)?，因此要?純度化學(xué)試劑和HPLC級溶劑。要注意玻璃器?按規(guī)定清洗?凈；為防?微?物?長，每天要?甲醇清洗系統(tǒng)；懷疑系統(tǒng)內(nèi)?長了微?物，可?稀硝酸沖洗即可（注意不要損壞柱和管道系統(tǒng)）；真空脫?時防?泵油帶?流動相；?清潔的惰性塞?、攪棒、過濾器和玻璃器?配制流動相；已經(jīng)污染的流動相?定要廢棄掉。7、注意選擇流動相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)低交聯(lián)度的離?交換樹脂和排阻?譜填料有時遇到某些有機(jī)相會溶脹或收縮，從?改變?譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動相不能?于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動相不能?于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。8、選擇流動相應(yīng)注意純度?譜柱的壽命與?量流動相通過有關(guān)，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時。9、選擇流動相應(yīng)注意必須與檢測器匹配使?UV檢測器時，所?流動相在檢測波長下應(yīng)沒有吸收，或吸收很?。當(dāng)使??差折光檢測器時，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較?的溶劑作流動相，以提?靈敏度。10、選擇流動相應(yīng)注意粘度要低（應(yīng)<2cp）：?粘度溶劑會影響溶質(zhì)的擴(kuò)散、傳質(zhì)，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延長，最好選擇沸點(diǎn)在100℃以下的流動相。11、選擇流動相應(yīng)注意對樣品的溶解度要適宜如果溶解度?佳，樣品會在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會使柱?惡化。12、選擇流動相應(yīng)注意樣品易于回收應(yīng)選?揮發(fā)性溶劑應(yīng)選?揮發(fā)性溶劑13、選擇流動相應(yīng)注意由強(qiáng)到弱?般先?90%的?腈(或甲醇)/?(或緩沖溶液)進(jìn)?試驗(yàn)，這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑(?腈或甲醇)的?例。14、選擇流動相應(yīng)注意三倍規(guī)則每減少10%的有機(jī)溶劑(甲醇或?腈)的量，保留因?約增加3倍，此為三倍規(guī)則。這是?個聰明??省?的辦法。調(diào)整的過程中，注意觀察各個峰的分離情況。15、選擇流動相應(yīng)注意粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)當(dāng)分離達(dá)到?定程度，應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率，直?各組分的分離情況不再改變。16、流動相的配制注意有機(jī)溶劑和?性溶劑的混合?法有機(jī)溶劑和?性溶劑的混合液作為流動相是經(jīng)常的，但由于混合?法不同，有時分析結(jié)果相差很?。如20mM磷酸鈉緩沖液（pH2.5）90%與?腈10%的混合液，混合?為9∶1時，20mM磷酸鈉緩沖液（pH2.5）90%與?腈10%的體積?為9∶1，也就是可以解釋為各?按體積?例的相當(dāng)量稱取后進(jìn)?混合。另外，按10%?腈解釋，?20mM磷酸鈉緩沖液（pH2.5），將?腈稀釋調(diào)制也可以成?。在后者情況下，產(chǎn)?混合體積減少部分，余下的添加20mM磷酸鈉緩沖液。兩者雖然沒有太?的差別，但由于混合?式不同，分析結(jié)果，特別是保留時間，也會有顯著的差別，這點(diǎn)必須注意。17、50%或（V/V＝1/1）?腈?溶液的配制?法對于?V/V＝1/1的表?配制?腈?溶液，多按這種?法進(jìn)?：?量筒測定?腈500mL，?另?量筒測定?500mL，兩種液體在瓶內(nèi)充分搖晃混合。不過50%?腈?溶液的表?時，同樣也多是按上述?法配制，但查化學(xué)辭典時，實(shí)際上是按這種?法進(jìn)?配制：?先將500mL?腈，注?1L的量瓶中，量瓶邊攪拌邊加?，等待液溫達(dá)到室溫，?全量?，使溶液到1L。這樣?來，?%表?和“V/V”體積?表?，最終得出的流動相組成不同。也就是說，混合溶劑的密度，與由原溶劑密度計(jì)算的單純平均值不相同，所以?上述兩種?法調(diào)制的流動相組成差異。如在室溫（25℃）附近?50mL和?腈50mL混合時體積不是100mL，?有所減少，約為96mL。在?般情況下，多?操作簡便的第?種?法。18、流動相的配制注意溶劑體積的溫度影響溶液的密度受周圍溫度的影響。剛從溶劑冷藏箱拿出來的溶液溫度與實(shí)驗(yàn)室的室溫相?，要低不少，?腈和?混合液因發(fā)熱反應(yīng)，溶液溫度升?。因此，為能調(diào)制再現(xiàn)性好的流動相，建議在使?前?恒溫?浴鍋將液溫調(diào)到接近室溫。19、流動相的配制注意?兩臺泵進(jìn)?溶劑混合雙泵主要是在探討流動相的配?或者梯度洗脫是?較?便，知道確切的液相?譜儀條件時，建議配好后使?的話，混合?較均勻，效果較好。在反相分析中，常?的有機(jī)溶劑和?的等濃度法，使??壓兩元梯度系統(tǒng)，?兩臺泵將流動相分別輸液后混合等封閉式混合時與預(yù)先在瓶內(nèi)混合后?1臺泵輸液時，因混合后體積變化的不同，保留時間也有所不同，?定要注意。不僅是流動性的調(diào)制?法，試樣溶液和其他溶液的調(diào)制也經(jīng)常有上述問題，另外，在不同部門（醫(yī)藥部門或化?部門）各?都有??的常識和習(xí)慣。在這種情況下，就要求各部門在制作相關(guān)溶液配制?法時能規(guī)定通則，定義設(shè)計(jì)溶液的調(diào)制?法，這樣避免混亂，以在?常?作中更好地記住這些表??法。20、注意流動相的PH如需在?定PH值下操作，須定期測定流動相的PH值，??中的CO2溶解在流動相內(nèi)將引起PH值的改變，特別是貯液瓶密閉不嚴(yán)時這種影響可能更?。21、注意更換柱?及流動相軟質(zhì)或半軟質(zhì)填料的溶脹率隨溶劑極性的變化?變化，使?新柱時應(yīng)先?25~30倍柱容積的合適流動相平衡。更換流動相時，如果兩種流動相不