原核真核啟動子及BL21相關知識

原核真核啟動子及BL21相關知識原核真核啟動子及BL21相關知識原核真核啟動子及BL21相關知識xxx公司原核真核啟動子及BL21相關知識文件編號：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準審核制定方案設計，管理制度感受態(tài)BL21、BL21(DE3)及BL21(DE3)pLysSBL21沒有T7RNA聚合酶基因,因此不能表達T7啟動子控制的目的基因,但是可以表達大腸桿菌啟動子lac、tac、trc及trp控制的基因。

BL21(DE3)是λDE3溶原菌，帶有T7RNA聚合酶，可用于表達T7啟動子控制的目的基因，也可以表達大腸桿菌啟動子lac、tac、trc及trp控制的基因。

BL21（DE3）pLysS含有pLysS質粒，一種與pET共存的表達T7裂解酶的質粒，可以減少目的基因的本底表達，提供更嚴緊的控制。真核原核啟動子原核：幾個常用的啟動子和誘導調(diào)控表達系統(tǒng)1.最早應用于的表達系統(tǒng)的是Lac乳糖操縱子，由啟動子lacP+操縱基因lacO+結構基因組成。其轉錄受CAP正調(diào)控和lacI負調(diào)控。

突變能夠在沒有CAP的存在下更有效地起始轉錄，該啟動子在轉錄水平上只受lacI的調(diào)控，因而隨后得到了更廣泛采用。lacI產(chǎn)物是一種阻遏蛋白，能結合在操縱基因lacO上從而阻遏轉錄起始。乳糖的類似物IPTG可以和lacI產(chǎn)物結合，使其構象改變離開lacO，從而激活轉錄。這種可誘導的轉錄調(diào)控成為了大腸桿菌表達系統(tǒng)載體構建的常用元件。

啟動子是trp啟動子和lacUV5的拼接雜合啟動子，且轉錄水平更高，比lacUV5更優(yōu)越。

啟動子是trp啟動子和lac啟動子的拼合啟動子，同樣具有比trp更高的轉錄效率和受lacI阻遏蛋白調(diào)控的強啟動子特性。

5.在常規(guī)的大腸桿菌中，lacI阻遏蛋白表達量不高，僅能滿足細胞自身的lac操縱子，無法應付多拷貝的質粒的需求，導致非誘導條件下較高地表達，為了讓表達系統(tǒng)嚴謹調(diào)控產(chǎn)物表達，能過量表達lacI阻遏蛋白的lacIq突變菌株常被選為Lac/Tac/trc表達系統(tǒng)的表達菌株?，F(xiàn)在的Lac/Tac/trc載體上通常還帶有l(wèi)acIq基因，以表達更多l(xiāng)acI阻遏蛋白實現(xiàn)嚴謹?shù)恼T導調(diào)控。

廣泛用于誘導表達系統(tǒng)，但是IPTG有一定毒性，有人認為在制備醫(yī)療目的的重組蛋白并不合適，因而也有用乳糖代替IPTG作為誘導物的研究。另外一種研究方向是用lacI的溫度敏感突變體，30℃下抑制轉錄，42℃開始發(fā)揮作用。熱誘導不用添加外來的誘導物，成本低，但是由于發(fā)酵過程中加熱升溫比較慢而影響誘導效果，而且熱誘導本身會導致大腸桿菌的熱休克蛋白激活，一些蛋白酶會影響產(chǎn)物的穩(wěn)定。

7.以λ噬菌體轉錄啟動子PL、PR構建的載體也為大家所熟悉。這兩個強啟動子受控于λ噬菌體cI基因產(chǎn)物。cI基因的溫度敏感突變體cI857(ts)常常被用于調(diào)控PL、PR啟動子的轉錄。同樣也是30℃下阻遏啟動子轉錄，42℃下解除抑制開始轉錄。同樣的，PL、PR表達載體需要以cI857(ts)作為表達菌株，現(xiàn)在更常見的做法是在載體上攜帶cI857(ts)基因，所以可以有更大的宿主選擇范圍。另外一種思路是通過嚴謹調(diào)控cI產(chǎn)物來間接調(diào)控PL、PR啟動子的轉錄。比如Invitrogen的PL表達系統(tǒng)，就是將受trp啟動子嚴謹調(diào)控的cI基因溶源化到宿主菌染色體上，通過加入酪氨酸誘導抑制trp啟動子，抑制cI基因的表達，從而解除強大的PL啟動子的抑制。

啟動子是當今大腸桿菌表達系統(tǒng)的主流，這個功能強大兼專一性高的啟動子經(jīng)過巧妙的設計而成為原核表達的首選，尤其以Novagen公司的pET系統(tǒng)為杰出代表。強大的T7啟動子完全專一受控于T7RNA聚合酶，而高活性的T7RNA聚合酶合成mRNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍——當二者同時存在時，宿主本身基因的轉錄競爭不過T7表達系統(tǒng)，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白；誘導表達后僅幾個小時目的蛋白通?？梢哉嫉郊毎偟鞍椎?0%以上。由于大腸桿菌本身不含T7RNA聚合酶，需要將外源的T7RNA聚合酶引入宿主菌，因而T7RNA聚合酶的調(diào)控模式就決定了T7系統(tǒng)的調(diào)控模式——非誘導條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀態(tài)而不轉錄，從而避免目的基因毒性對宿主細胞以及質粒穩(wěn)定性的影響；通過控制誘導條件控制T7RNA聚合酶的量，就可以控制產(chǎn)物表達量，某些情況下可以提高產(chǎn)物的可溶性部分。有幾種方案可用于調(diào)控T7RNA聚合酶的合成，從而調(diào)控T7表達系統(tǒng)。1.噬菌體DE3是lambda噬菌體的衍生株，含有l(wèi)acI抑制基因和位于lacUV5啟動子下的T7RNA聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表達菌株，構建好的表達載體可以直接轉入表達菌株中，誘導調(diào)控方式和lac一樣都是IPTG誘導。2.另一種策略是用不含T7RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的蛋白對宿主細胞的潛在毒性而造成的質粒不穩(wěn)定。然后用λCE6噬菌體侵染宿主細胞——CE6是lambda噬菌體含溫度敏感突變(cI857ts)和pL/pR啟動子控制T7RNA聚合酶表達的衍生株，在熱誘導條件下可以激活T7RNA聚合酶的合成。此了噬菌體之外，還可以通過共轉化質粒提供T7RNA聚合酶。比如有人用受溶氧濃度控制的啟動子調(diào)控T7RNA聚合酶合成，據(jù)說這比較適合工業(yè)化發(fā)酵的條件控制。由于T7RNA聚合酶的調(diào)控方式仍有可能有痕量的本底表達，控制基礎表達的手段之一是培養(yǎng)基外加葡萄糖，有助于控制本底表達水平；之二是采用帶有T7lac啟動子的載體——在緊鄰T7啟動子的下游有一段lacI操縱子序列編碼表達lac阻遏蛋白(lacI)，lac阻遏蛋白可以作用于宿主染色體上T7RNA聚合酶前的lacUV5啟動子并抑制其表達，也作用于載體T7lac啟動子，以阻斷任何T7RNA聚合酶導致的目的基因轉錄。pLacI工轉化也是同樣的原理。如果這還不夠，更為嚴謹調(diào)控手段還有——在宿主菌中表達另一個可以結合并抑制T7RNA聚合酶的基因——T7溶菌酶基因，降低本底。常用的帶溶菌酶質粒有pLysS和pLysE，相容的ori都不會影響后繼的表達質粒轉化，前者表達的溶菌酶的水平要比后者低得多，對細胞生長影響小，而pLysE會明顯降低宿主菌的生長水平，容易出現(xiàn)過度調(diào)節(jié)，增加蛋白表達的滯后時間，從而降低表達水平。通過幾種不同方法來巧妙調(diào)控T7聚合酶合成，T7啟動子發(fā)展出了史上功能最強大，最豐富的表達系統(tǒng)。真核：真核表達系統(tǒng)的研究進展

自上世紀70年代基因工程技術誕生以來，基因表達技術已滲透到生命科學研究的各個領域。并隨著人類基因組計劃實施的進行，在技術方法上得到了很大發(fā)展，時至今日已取得令人矚目的成就。

在各種表達系統(tǒng)中，最早被采用進行研究的是原核表達系統(tǒng)，這也是目前掌握最為成熟的表達系統(tǒng)。該項技術的主要方法是將已克隆入目的基因DNA片段的載體(一般為質粒)轉化細菌(通常選用的是大腸桿菌)，通過IPTG誘導并最終純化獲得所需的目的蛋白。其優(yōu)點在于能夠在較短時間內(nèi)獲得基因表達產(chǎn)物，而且所需的成本相對比較低廉。但與此同時原核表達系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點：如目的蛋白常以包涵體形式表達，導致產(chǎn)物純化困難；而且原核表達系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達產(chǎn)物的生物活性較低。因此，利用真核表達系統(tǒng)來表達目的蛋白越來越受到重視。目前，基因工程研究中常用的真核表達系統(tǒng)有酵母表達系統(tǒng)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)。

1．酵母表達系統(tǒng)

最早應用于基因工程的酵母是釀酒酵母后來人們又相繼開發(fā)了裂殖酵母、克魯維酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表達系統(tǒng)是目前應用最廣泛的酵母表達系統(tǒng)。目前甲醇酵母主要有HPolymorpha，CandidaBodini，PichiaPastris3種。以PichiaPastoris應用最多。

甲醇酵母的表達載體為整合型質粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中。大部分甲醇酵母的表達載體中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一1(A0x1)，在該基因的啟動子(PAXOI)作用下，外源基因得以表達。PAXOI是一個強啟動子，在以葡萄糖或甘油為碳源時。甲醇酵母中AOx1基因的表達受到抑制，而在以甲醇為唯一碳源時PAXOI可被誘導激活，因而外源基因可在其控制下表達,將目的基因多拷貝整合入酵母染色體后可以提高外源蛋白的表達水平及產(chǎn)量。此外甲醇酵母的表達載體都為／PichiaPastoris的穿梭載體，其中含有復制起點和篩選標志，可在獲得克隆后采用細胞大量擴增.目前，將質粒載體轉入酵母菌的方法主要有原生質體轉化法、電擊法及氯化鋰法等。甲醇酵母一般先在含甘油的培養(yǎng)基中生長。培養(yǎng)至高濃度。再以甲醇為碳源。誘導表達外源蛋白。這樣可以大大提高表達產(chǎn)量。利用甲醇酵母表達外源性蛋白質其產(chǎn)量往往可達克級。與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動物細胞，不會發(fā)生超糖基化。

利用PAXOI表達外源蛋白時,一般需很長時間才能達到峰值水平，而甲醇是高毒性、高危險性化工產(chǎn)品。使得實驗操作過程中存在不小的危害性。且不宜于食品等蛋白生產(chǎn)。因此那些不需要甲醇誘導的啟動子受到青睞包括GAP、FLD1、PEX8、YPTI等多種。利用三磷酸甘油醛脫氫酶(GAP)啟動子代替PAXOI，不需要甲醇誘導。培養(yǎng)過程中無需更換碳源，操作更為簡便，可縮短外源蛋白到達峰值水平的時間。

酵母表達系統(tǒng)作為一種后起的外源蛋白表達系統(tǒng)，由于兼具原核以及真核表達系統(tǒng)的優(yōu)點，正在基因工程領域中得到日益廣泛的應用。

2．昆蟲細胞表達系統(tǒng)

桿狀病毒表達系統(tǒng)是目前應用最廣的昆蟲細胞表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)通常采用目宿銀紋夜蛾桿狀病毒(AcNPV)作為表達載體。在AcNPV感染昆蟲細胞的后期，核多角體基因可編碼產(chǎn)生多角體蛋白，該蛋白包裹病毒顆?？尚纬砂w。核多角體基因啟動子具有極強的啟動蛋白表達能力，故常被用來構建桿狀病毒傳遞質粒?？寺∪胪庠椿虻膫鬟f質粒與野生型AcNPV共轉染昆蟲細胞后可發(fā)生同源重組，重組后多角體基因被破壞，因而在感染細胞中不能形成包涵體，利用這一特點可挑選出含重組桿狀病毒的昆蟲細胞但效率比較低，且載體構建時間長，一般需要4～6周。此外，昆蟲細胞不能表達帶有完整N聯(lián)聚糖的真核糖蛋白。

在病毒感染晚期，由于大量外源蛋白的表達引起昆蟲細胞的裂解，胞質內(nèi)的物質釋放出來，與目的蛋白混在一起，從而使蛋白的純化工作變得很困難，另外水解酶的釋放會降解重組蛋白。為了克服以上這些困難，科學工作者先后嘗試用絲蛾肌動蛋白基因啟動子或桿狀病毒ie-1基因啟動子表達外源蛋白，但效果都不明顯。Farrel等介紹了一種新型的鱗翅目昆蟲細胞表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要包括3個調(diào)節(jié)外源蛋白表達序列：(1)Bombyxmori的肌動蛋白基因啟動子；（2）Bombyxmori的核型多角體病毒(BmNPV)的立早基因ie-1(編碼俄IE-1蛋白，該蛋白是種轉錄激活因子，可在體外激活肌動蛋白基因啟動子)；(3)BmNPV的同源重復序列3(HR3)可作為肌動蛋白基因啟動子的增強子。三者協(xié)同作用，可使轉錄活性提高1000倍以上，從而大大地提高外源蛋白的表達水平。另外目前還有一種新型的宿主范圍廣的雜合核多角體病毒(HyNPV)被應用于昆蟲細胞表達系統(tǒng)的構建，該病毒由AcNPV及Bni'qP發(fā)展而來。

一般情況下桿狀病毒表達系統(tǒng)所能表達的外源蛋白只有少部分是分泌性的，大部分為非分泌性。為了解決這個問題將Hsp70(熱休克蛋白70)與外源蛋白共表達可明顯提高重組蛋白的分泌水平，這是因為分泌性多肽被翻譯后必須到達內(nèi)質網(wǎng)進行加工才能被分泌至胞外。如果到達內(nèi)質網(wǎng)前，前體多肽就伸展開來，暴露出疏水殘基，殘基間的相互作用可引起多肽的凝聚，這對最終的表達水平有很大影響。而Hsp70是一種分子伴侶，能夠與新翻譯的多肽結合，抑制前體肽的凝聚使前體肽順利到達內(nèi)質網(wǎng)進行加工，從而提高蛋白的分泌水平。

最近，人們又構建了桿狀病毒-S2表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)能將重組桿狀病毒轉染果蠅S2細胞，以前人們認為桿狀病毒僅能在鱗翅目昆蟲細胞(如sf9、sf21)中復制，不能在其他昆蟲細胞(如果蠅細胞)中復制，然而目前研究表明在一定條件下，桿狀病毒也能感染果蠅細胞。在果蠅細胞中，桿狀病毒的多角體基因啟動子幾乎不發(fā)生作用。桿狀病毒-S2表達系統(tǒng)的表達載體利用的是果蠅啟動子如Hsp70啟動子、肌動蛋白5C啟動子、金屬硫蛋白基因啟動子等，其中，Hsp70啟動子的作用最強。重組桿狀病毒感染S2細胞后不會引起宿主細胞的裂解，且蛋白表達水平與鱗翅目細胞相似，因此，桿狀病毒-S2系統(tǒng)是一個很有應用前景的昆蟲細胞表達系統(tǒng)。昆蟲細胞表達系統(tǒng)，特別是桿狀病毒表達系統(tǒng)由于其操作安全，表達量高，目前與酵母表達系統(tǒng)一樣被廣泛應用于基因工程的各個領域中。

3．哺乳動物細胞表達系統(tǒng)

由哺乳動物細胞翻譯后再加工修飾產(chǎn)生的外源蛋白質，在活性方面遠勝于原核表達系統(tǒng)及酵母、昆蟲細胞等真核表達系統(tǒng)，更接近于天然蛋白質。哺乳動物細胞表達載體包含原核序列、啟動子、增強子、選擇標記基因、終止子和多聚核苷酸信號等。

將外源基因導入哺乳動物細胞主要通過2類方法：一是感染性病毒顆粒感染宿主細胞，二是通過脂質體法、顯微注射法、磷酸鈣共沉淀法及DEAE一葡聚糖法等非病毒載體的方式將基因導入到細胞中。外源基因的體外表達一般采用質粒表達載體，如將重組質粒導入CHO細胞可建立高效穩(wěn)定的表達系統(tǒng)，而利用COS細胞可建立瞬時表達系統(tǒng)。目前，病毒載體已成為動物體內(nèi)表達外源基因的有力工具，在臨床基因治療的探索中也發(fā)揮了重要作用。痘苗病毒由于其基因的分子量相當大(約187kb)，利用它作為載體可同時插入幾種外源基因，從而構建多價疫苗。另外，逆轉錄病毒感染效率高，某些難轉染的細胞系也可通過其導入外源基因，但要注意的是逆轉錄病毒可整合入宿主細胞染色體，具有潛在的危險性。

由于腺病毒易于培養(yǎng)、純化，宿主范圍廣，故采用該類病毒構建的載體被廣泛應用腺病毒載體的構建依賴于腺病毒穿梭質粒和包裝載體之間的同源重組。但是哺乳動物細胞內(nèi)的這種同源重組效率很低，利用細菌內(nèi)同源重組法構建重組體效率會大大提高，即將外源基因插入到腺病毒穿梭質粒中，形成轉移質粒，將其線性化后與腺病毒包裝質粒共轉化大腸埃希菌。另一種方法是通過CrelaxP系統(tǒng)構建重組腺病毒載體，在轉移質粒和包裝質粒中都插入laxP位點，然后將兩個質粒共轉染表達Cre重組酶的哺乳動物細胞，通過Cre介導兩個laxP位點之間的DNA發(fā)生重組，可獲得重組腺病毒，這種重組效率比一般的細胞內(nèi)同源效率高30倍。最近，人們在桿狀病毒中插入巨細胞病毒的啟動子建立了高效的基因轉移載體。由于桿狀病毒是昆蟲病毒，在哺乳動物細胞中不會引起病毒基因的表達，而且載體的構建容易，因而利用桿狀病毒進行基因轉移為我們提供了很好的途徑。

利用哺乳動物細胞表達外源基因時，大多數(shù)情況下不需要誘導，但當表達產(chǎn)物對細胞有毒性時應采取誘導，這樣可避免表達產(chǎn)物產(chǎn)生早期就對細胞產(chǎn)生影響。哺乳動物細胞中用到的誘導型載體主要與啟動子有關如熱休克蛋白啟動子可在高溫下被誘導，還有重金屬、糖皮質激素誘導的啟動子。但這些系統(tǒng)存在一些共同的缺陷，如誘導表達特異性差；當系統(tǒng)處于關閉狀態(tài)時表達有泄漏誘導劑本身有毒性，常對細胞造成損傷等。

為此，Gossen等構建了受四環(huán)素負調(diào)節(jié)的Tet-on基因表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)由調(diào)節(jié)質粒和反應質粒組成。調(diào)節(jié)質粒中具有編碼轉錄激活因子(fIA)的序列，在沒有四環(huán)素或強力毒素存在的情況下tTA可引起下游目的基因表達。隨后Gossen等又對tTA的氨基酸序列進行了改造，構建了受四環(huán)素正調(diào)節(jié)的Tet-on基因表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)在沒有四環(huán)素的情況下啟動子不被激活，而在加入四環(huán)素或強力毒素后目的基因高效表達。四環(huán)素誘導的基因表達系統(tǒng)是目前應用最廣泛的哺乳動物細胞誘導表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有嚴密、高效可控制性強的優(yōu)點。

外源蛋白的表達會對哺乳動物細胞產(chǎn)生不利影響