生物技術(shù)綜合實(shí)驗(二)

理論內(nèi)容部分第一頁，共五十八頁。第二頁，共五十八頁。一、超氧化物歧化酶簡稱：SOD.是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。對人體不斷地補(bǔ)充SOD具有抗衰老的特殊效果。它們以銅和鋅、或錳、鐵、或鎳作為輔因子第三頁，共五十八頁。超氧化物歧化酶的來源超氧化物歧化酶的來源有很多途徑，可以根據(jù)當(dāng)?shù)氐脑蟻碓?，成本需求，技術(shù)要求來選取不同的提取途徑。其中根據(jù)不同的分類有以下幾個途徑獲取該酶。1、植物提取2、動物提取3、微生物的生產(chǎn)發(fā)酵4、人工合成第四頁，共五十八頁。發(fā)展歷史超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,EC1.15.1.1,SOD）是1938年Marn等人首次從牛紅血球中分離得到超氧化物歧化酶開始算起，人們對SOD的研究己有七十多年的歷史。1969年McCord等重新發(fā)現(xiàn)這種蛋白，并且發(fā)現(xiàn)了它們的生物活性，弄清了它催化過氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)的性質(zhì)，所以正式將其命名為超氧化物歧化酶。第五頁，共五十八頁。超氧化物歧化酶的作用機(jī)理氧氣在有機(jī)體內(nèi)代謝還原，提供了生物能量，最后生成水，共接受4個電子。在這還原過程中，每接受一個電子就生成一個氧自由基或活性氧。但氧自由基，能引起細(xì)胞損傷，導(dǎo)致疾病發(fā)生。O2+e→O2O2+2e+2H+→H2O2O2+3e+3H+→H2O+·OHO2+4e+4H+→2H2O而SOD是體內(nèi)專一清除超氧陰離子自由基的一個抗氧化酶。SOD的催化過程如下：O2-+O2-+2H+

→H2O2+O2SOD將O2-歧化生成雙氧水。國內(nèi)外對SOD的毒性進(jìn)行了廣泛的研究，大量資料表明SOD無毒、無副作用。第六頁，共五十八頁。二、SOD用途及前景1、抗氧化2、抗衰老3、預(yù)防慢性病及其并發(fā)癥4、抗疲勞5、化療副作用的消除劑6、避免手術(shù)的二次傷害手術(shù)會引起大量自由基，故建議手術(shù)前后口服抗氧化劑來迅速恢復(fù)體力加速傷口復(fù)原。第七頁，共五十八頁。超氧化物歧化酶的應(yīng)用

健康上的應(yīng)用

SOD是人體內(nèi)最主要的抗氧化物質(zhì)，是氧自由基的克星和專一清除劑；它清除人體內(nèi)一些自由基。它保護(hù)細(xì)胞對抗毒性，調(diào)節(jié)H2O2的濃度，對付微生物的侵害，并且增強(qiáng)抗氧化酶的活性，迅速清除過剩的自由基，保持身體健康，體力充沛，面容體態(tài)年輕。全球118位科學(xué)家發(fā)表聯(lián)合聲明：自由基是百病之源，SOD是健康之本。體內(nèi)的SOD活性越高，壽命就越長。第八頁，共五十八頁。藥物類主要集中在炎癥病患者，尤其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、心肌梗塞、心血管病、腫瘤患者以及放射性治療炎癥病患者；用于生化制藥作為一種生化酶制劑，廣泛應(yīng)用于臨床和科研上，具有極強(qiáng)的抗衰老，抗腫瘤、調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌系統(tǒng)作用；第九頁，共五十八頁。用于化妝品類

可添加在化妝品中，具有抗氧化抗腐蝕的優(yōu)良性能。有減少皺紋、祛斑的功效以SOD為主要成份的產(chǎn)品風(fēng)靡世界，引發(fā)了化妝品歷史上的一場革命，使人類永葆青春美麗夢想成真；

用作保健食品、飲料

如SOD糖、SOD口服液、SOD干啤等都非常暢銷!在飲料、糖果、糕點(diǎn)等食品中加入SOD既可利用其抗腐蝕性延長保質(zhì)期，又可調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌系統(tǒng)第十頁，共五十八頁?？傊?，超氧化物歧化酶可以清除體內(nèi)過量的自由基，提高人體免疫力，延緩衰老；有效降低血脂、膽固醇、血壓；抗疲勞，增強(qiáng)肝腎功能；抗輻射；對糖尿病有明顯的恢復(fù)作用；調(diào)節(jié)女性生理周期，推遲更年期。第十一頁，共五十八頁。應(yīng)用前景SOD是一種新型的抗炎癥藥,尤其對關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有明顯療效,根據(jù)SOD作用機(jī)制和毒性試驗,它對治療因O2引起的各種疾病都有一定的療效。為此,SOD可作為抗衰老、抗炎癥、自身免疫疾病患者廣泛應(yīng)用的醫(yī)藥品。此外,SOD對治療貝切特氏癥、心肌梗塞等血虛性心臟病、膠原病、新生兒呼吸困難綜合癥、防御放射性傷害等也可望有效。近年來美、日、德、英國等對SOD作為藥品開發(fā)應(yīng)用進(jìn)行了一系列研究和臨床試驗并得到廣泛應(yīng)用。第十二頁，共五十八頁?？梢灶A(yù)言,隨著人們對SOD更廣泛深入的研究,不同類型SOD、SOD修飾物及人工有機(jī)合成SOD模擬酶將在醫(yī)療、保健、食品、農(nóng)業(yè)增產(chǎn)等方面發(fā)揮出更大的作用.第十三頁，共五十八頁。三、SOD提取方法第十四頁，共五十八頁。第十五頁，共五十八頁。第十六頁，共五十八頁。實(shí)驗部分(P40-70）第十七頁，共五十八頁。一、基本內(nèi)容：細(xì)胞破碎及酶的抽提。兩種蛋白質(zhì)含量測定方法及酶的活力測定。；離子交換柱分離操作及分析。SDS電泳測定蛋白質(zhì)分子量。固定化酶的制備技術(shù)。6.酶的柱層析分離操作，包括裝柱，恒流泵及部分收集器的試調(diào)，上樣，洗脫等。7.IEF測蛋白質(zhì)PI；8.POD同工酶分析；9.細(xì)胞器的分離及其標(biāo)志物（酶）的測定

第十八頁，共五十八頁。二.目的要求

學(xué)習(xí)提取分離純化超氧化物歧化酶的方法，掌握酶分離純化的基本操作技術(shù)。包括以下內(nèi)容：

1．細(xì)胞破碎及酶的抽提；

2．酶的柱層析分離操作；

3．酶的活力測定。第十九頁，共五十八頁。三.基本原理

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD,EC1.15.1.1)是一種歧化超氧負(fù)離子自由基O2─生成H2O2和O2的金屬蛋白，為胞內(nèi)酶，在生物體內(nèi)具有延緩機(jī)體衰老，對腫瘤、自身免疫性疾病和輻射損傷具有重要的防御作用，是一種重要的藥用酶。根據(jù)所含的金屬離子，SOD可分為三類：Cu、Zn–SOD、Mn–SOD和Fe–SOD。SOD在生物界中分布極廣，原核生物和真核生物中都有存在。第二十頁，共五十八頁。本實(shí)驗從血中提取SOD，提取液經(jīng)葡聚糖凝膠柱上層析，分離出SOD，然后用鄰苯三酚法測定其酶活力。鄰苯三酚在自氧化過程中產(chǎn)生有色中間物（紅桔酚）和O2-,使溶液顏色變褐加深。加入SOD能歧化O2-阻止中間物（紅桔酚）的積累，通過分光光度計比色分析反應(yīng)液的顏色而測定其酶活力。第二十一頁，共五十八頁。超氧化物歧化酶的工藝流程動物血液材料中制備超氧化物歧化酶分離純化工藝分為三個主要步驟：原材料的預(yù)處理→乙醇-氯仿除去血紅蛋白→粗酶液的制備→有機(jī)溶劑沉淀→離子交換柱層析精制→SOD成品第二十二頁，共五十八頁。原材料的預(yù)處理材料材料試劑：3.8%檸檬酸三鈉，0.9%氯化鈉，95%乙醇，氯仿，牛血。器材：恒溫水浴，離心機(jī)，布氏漏斗，抽慮瓶，燒杯，量筒，攪棒實(shí)驗步驟收集：取新鮮牛血，加入到3.8%檸檬酸三鈉液中，新鮮豬血與抗凝液的比例為3:1,輕輕攪拌均勻，4000r/min,離心20min,收集紅細(xì)胞。浮選：紅細(xì)胞用3倍體積生理鹽水洗滌，4000r/min離心20min,重復(fù)3次。溶血：向洗凈的紅細(xì)胞加入1~1.1倍體積去離子水，在5℃下攪拌30min,得到溶血物。

注意：收集完新鮮血液后，應(yīng)盡快加抗凝劑去除血紅蛋白過程中，攪拌要均勻第二十三頁，共五十八頁。去血紅蛋白

向溶血液中分別緩慢加入0.25倍體積的預(yù)冷95%乙醇和0.15倍體積的預(yù)冷氯仿，劇烈攪拌15min左右，靜置1h,然后4000r/min離心20min，除去變性血紅蛋白沉淀，取清夜，過濾，收集濾液。第二十四頁，共五十八頁。

1.熱變性原材料的預(yù)處理中獲得的上清液加熱到65℃，保溫10min，然后迅速冷卻到室溫，3000r/min離心20min，棄去沉淀物，收集上清液。2.沉淀清夜在冰浴中冷卻，然后在-5℃一下的操作溫度下，加入1.5倍量預(yù)冷丙酮，邊加邊攪拌均勻，即有白色沉淀產(chǎn)生，靜置2~3min，迅速抽濾，棄去濾液得肉色沉淀。沉淀物用少量蒸餾水溶解，4000r/min離心20min，除去不溶物，用pH7.6的2.5mmol/LK2HPO4-KH2PO4緩沖液透析，即得粗SOD溶液注意迅速冷卻至室溫沉淀過程保持低溫哦第二十五頁，共五十八頁。三．材料器具

材料：動物新鮮血液；SephadexG―75凝膠。儀器：高速組織搗碎機(jī)；高速冷凍離心機(jī)；層析柱（1×40cm）；自動部分收集器；恒流泵；進(jìn)樣器和微量進(jìn)樣器；可見/紫外分光光度計。試劑：（1）pH7.8,5mmol/L磷酸緩沖液（內(nèi)含1mmol/LEDTA）；（2）考馬斯亮藍(lán)溶液：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G―250于50ml95%乙醇中，搖動，待溶解后，加入100ml85%磷酸，反復(fù)震動后加蒸餾水定容至1000ml,過濾待用；（3）pH8.2,50mmol/LTris-HCl緩沖液；（4）50mmol/L鄰苯三酚溶液；（5）10mmol/LHCl溶液第二十六頁，共五十八頁。4.試劑的配法

（1）pH8.2、50mmol/L

Tris-HCl

稱取Tris

0.61g，EDTA-2Na

0.037g，用雙蒸水溶解至80mL左右，用HCl調(diào)節(jié)pH

=8.20（用pH計校正），最后定容至100mL。

（2）10mmol/L

HCl

（3）50

mmol/L鄰苯三酚

稱取鄰苯三酚0.063g，用10mmol/L

HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。

（4）SOD樣液

第二十七頁，共五十八頁。四.實(shí)驗操作

(一)SOD的提取取新鮮血液,冷水浸泡24h,瀝干，加冰凍的pH7.8,5mmol/L磷酸緩沖液適量，用高速組織搗碎機(jī)搗碎。用高速冷凍離心機(jī)以8000rpm離心除去固型物（需4—5次，每次15min）,上清液即SOD酶液。第二十八頁，共五十八頁。（二）SOD的凝膠層析分離純化

1.凝膠的準(zhǔn)備：（1）

稱取SephadexG―75干凝膠2g，加適量洗脫液沸水浴溶脹2小時（也可室溫溶脹24小時）。

（2）用傾斜法傾去表面懸浮的細(xì)小顆粒，室溫儲存于磷酸緩沖液中備用。第二十九頁，共五十八頁。2．裝柱：

（1）將層析柱豎直固定于支架上,連接好恒流泵、部分收集器,調(diào)節(jié)洗脫液的操作壓60cm。

（2）先向?qū)游鲋屑尤?/3高度的pH7.8,5mmol/L磷酸緩沖液,然后用大口進(jìn)樣器吸取上述準(zhǔn)備好的凝膠徐徐注入柱中緩沖液內(nèi),讓其自然沉降，沉降好的柱床頂部離管口1—2cm為宜。若高度不夠，可放去部分緩沖液，攪起管中凝膠界面，繼續(xù)添加凝膠。

（3）裝畢，用2—3個床體積的洗脫液洗脫，以使床柱穩(wěn)定。

第三十頁，共五十八頁。第三十一頁，共五十八頁。

3．上樣：

（1）放去床表面上的緩沖液至與凝膠界面平齊。（2）用進(jìn)樣器吸取酶液0.5ml，加樣時將進(jìn)樣器尖端接觸柱內(nèi)壁并在離床表面數(shù)毫米處隨加隨沿內(nèi)壁轉(zhuǎn)動一周，使樣品盡快分布于全表面。然后打開恒流泵，待樣品液面與床柱表面平齊時，關(guān)閉恒流泵，以少許（0.1—1ml）緩沖液沖洗內(nèi)壁數(shù)次，在打開恒流泵，放至液面與床柱表面平齊。（3）先用進(jìn)樣器加1cm高度的緩沖液覆蓋樣品，然后加足緩沖液，連接好進(jìn)液管。

4．洗脫：開啟部分收集器和恒流泵，以pH7.8,5mmol/L磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫。調(diào)節(jié)流速，控制每管收集洗脫液1ml，每管按收集順序做好標(biāo)記。第三十二頁，共五十八頁。5．洗脫液酶蛋白含量的測定：

：

（1）取潔凈試管數(shù)支，分別加入考馬斯亮藍(lán)溶液3ml,搖勻，將其中一支試管不加任何試液作為對照管，其余的分別加入從第五收集管起的洗脫收集液50μl,反復(fù)搖勻。（2）以對照管為調(diào)零液，用1cm比色杯在595nm波長下測定各管的OD595nm值。（3）合并OD595nm值高的原收集液，此即純化的SOD酶液。保留測酶活力。

（4）測定完畢，先用乙醇洗去比色杯的顏色，再用蒸餾水蕩洗，用擦鏡紙拭干水珠，倒扣在培養(yǎng)皿內(nèi)。（5）清理干凈工作臺，在儀器使用登記本上登記使用情況。第三十三頁，共五十八頁。（三）SOD酶活力測定

在一般情況下，SOD活性測定只能應(yīng)用間接活性測定法。其測定方法很多，常見的有化學(xué)法、免疫法和等電點(diǎn)聚焦法。其中化學(xué)法應(yīng)用最普遍，化學(xué)法的原理主要是利用有些化合物在自氧化過程中會產(chǎn)生有色中間物和O2

-，利用SOD分解而間接推算酶活力。

在化學(xué)方法中，最常用的有黃嘌呤氧化酶法，鄰苯三酚法，化學(xué)發(fā)光法，腎上腺素法，NBT-還原法，光化學(xué)擴(kuò)增法，Cyte還原法等。其中改良的鄰苯三酚自氧化法簡單易行較為實(shí)用。本實(shí)驗采用鄰苯三酚自氧化方法。第三十四頁，共五十八頁。鄰苯三酚自氧化法原理：

鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出O2

-

（超氧陰離子自由基），生成帶色的中間產(chǎn)物（紅桔酚），反應(yīng)開始后反應(yīng)液先變成黃棕色，幾分鐘后轉(zhuǎn)綠，幾小時后又轉(zhuǎn)變成黃色，這是因為生成的中間物不斷氧化的結(jié)果。本實(shí)驗中測定的是鄰苯三酚自氧化過程中的初始階段，中間物的積累在滯留30～45s后，與時間成線性關(guān)系，一般線性時間維持在4min的范圍內(nèi)，中間物在325nm波長出有強(qiáng)烈光吸收。當(dāng)有SOD存在時，由于它能催化O2

-與H+結(jié)合生成O2和H2O2，從而阻止了中間有色產(chǎn)物的積累，導(dǎo)致吸光值下降因此，通過測定它們在特定波長下得光吸收變化速率計算出SOD的酶活性。第三十五頁，共五十八頁。

鄰苯三酚───────O2

-

+紅桔酚（自氧化：有色物質(zhì)積累，吸光值增加）

O2

-+O2

-+2H+────H202+O2

（SOD催化：阻止中間產(chǎn)物積累，吸光值降低）

pH=8.2SOD第三十六頁，共五十八頁。實(shí)驗步驟：

1．測定鄰苯三酚溶液自氧化速率：取兩支試管按右表加入25℃預(yù)熱過的緩沖液,然后加入預(yù)熱過的鄰苯三酚（空白管用10mmol/L

HCl代替鄰苯三酚

），迅速搖勻，立即傾入1cm比色杯中，在325nm波長處測定光吸收值，每隔30s讀數(shù)一次，測定4min內(nèi)每分鐘光吸收值的變化。要求自氧化速率控制在每分鐘的光吸收值為0.070士0.002（可增減鄰苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。第三十七頁，共五十八頁。2.SOD樣液活力測定：樣品管取代自氧化管。樣品管測定時先加入預(yù)熱的待測酶液，在25℃水浴鍋中保溫10min，再加入預(yù)熱的鄰苯三酚。其余步驟同鄰苯三酚自氧化速率的測定。第三十八頁，共五十八頁。3.數(shù)據(jù)處理3.1加入SOD酶前后鄰苯三酚自氧化速率的計算

第三十九頁，共五十八頁。3.2SOD酶活力計算：(酶活力單位定義:在一定條件下,每1mL反應(yīng)液中每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%時的酶量定義為一個活力單位。)

第四十頁，共五十八頁。SDS技術(shù)及原理第四十一頁，共五十八頁。酶固定化技術(shù)第四十二頁，共五十八頁。酶固定化技術(shù)第四十三頁，共五十八頁。鄰苯三酚的自氧化曲線(25℃pH8.2Tris-HCL緩沖液4.5mL45mL鄰苯三酚溶液0.01mL)Back第四十四頁，共五十八頁。SOD酶對鄰苯三酚自氧化的抑制酶活力測定曲線Back第四十五頁，共五十八頁。清場各組將實(shí)驗臺清理好，實(shí)驗用具清洗干凈，恢復(fù)實(shí)驗開始時的狀態(tài)。派人清掃實(shí)驗室。第四十六頁，共五十八頁。色譜法純化超氧化物歧化酶

操作步驟

1、DEAE-纖維素的預(yù)處理：

DEAE-纖維素第四十七頁，共五十八頁。2、裝柱（1）層析柱用洗滌液洗清潔，柱的下端聯(lián)接塑料管，裝上螺旋夾。關(guān)上螺旋夾，柱內(nèi)裝入緩沖液I，微開螺旋夾。讓緩沖液緩慢流出，趕走死區(qū)及塑料管中的氣泡，柱中保留少量緩沖液，關(guān)閉螺旋夾。（2）將基本平衡好的DEAE-纖維素漿液（約有1倍體積的緩沖液I）放在抽濾瓶中減壓除盡氣泡，然后沿管壁倒人柱中，待沉降至床高約1cm高度時，部分旋松螺旋夾，讓溶液緩慢流出去，注意此時的流速要比正常洗脫時的流速慢，陸續(xù)加入較多的漿液，直至達(dá)到高10cm以上的柱床體積。層析柱第四十八頁，共五十八頁。3、平衡當(dāng)全部交換劑裝入柱中后，用上柱起始緩沖液進(jìn)行平衡。流速可維持在4mL/15min，直至流出液的pH與上柱緩沖液完全相同。（一般要平衡8h以上或過夜。）第四十九頁，共五十八頁。4、層析用毛細(xì)吸管小心吸去交換劑上面大部分液體，打開出口使緩沖液Ⅰ恰流到表面，關(guān)閉出口。用毛細(xì)吸管小心地沿柱壁四周緩緩加入SOD粗酶液，打開出口，使樣品溶液進(jìn)入纖維素內(nèi)，至幾乎露出床面時，柱壁用少量緩沖液小心洗滌2～3次，然后裝入緩沖液Ⅰ，使液面高出創(chuàng)面2～3cm左右。第五十頁，共五十八頁。5、洗脫（1）按圖8-9將梯度洗脫器和層析柱連接好。（2）在洗脫瓶A（貯存器）和洗脫瓶B（混合器）內(nèi)各裝入100mL緩沖液Ⅰ和緩沖液Ⅱ，注意兩洗脫瓶，特別是液面