核酸擴(kuò)增技術(shù)課件

核酸擴(kuò)增技術(shù)課件核酸擴(kuò)增技術(shù)課件1大綱要求：掌握PCR的原理和反應(yīng)過(guò)程掌握PCR反應(yīng)體系掌握PCR產(chǎn)物的檢測(cè)熟悉實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理和方法了解以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)Special大綱要求：掌握PCR的原理和反應(yīng)過(guò)程Special2二、教學(xué)內(nèi)容第一節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)第二節(jié)以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)第三節(jié)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)第X節(jié)實(shí)時(shí)熒光定量PCR現(xiàn)在位置P169二、教學(xué)內(nèi)容第一節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)現(xiàn)在位置P1693基礎(chǔ)知識(shí)遺傳中心法則現(xiàn)在位置P169基礎(chǔ)知識(shí)遺傳中心法則現(xiàn)在位置P1694+基礎(chǔ)知識(shí)+基礎(chǔ)知識(shí)5基礎(chǔ)知識(shí)基礎(chǔ)知識(shí)6DNA加熱變性DNA冷卻復(fù)性一、核酸分子雜交的基本原理基礎(chǔ)知識(shí)DNA加熱變性DNA冷卻復(fù)性一、核酸分子雜交的基本原理基礎(chǔ)知7DNA變性(denaturation)定義：在某些理化因素作用下，DNA分子內(nèi)堿基對(duì)之間的氫鍵斷裂，使規(guī)則有序的雙螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)椴灰?guī)則無(wú)序的單鏈線團(tuán)樣結(jié)構(gòu)的過(guò)程?；A(chǔ)知識(shí)DNA變性(denaturation)基礎(chǔ)知識(shí)8基礎(chǔ)知識(shí)基礎(chǔ)知識(shí)9融解溫度（Tm）定義：

在DNA熱變性時(shí)，其A260的升高達(dá)最大值一半時(shí)的溫度?；A(chǔ)知識(shí)meltingtemperature，融解溫度（Tm）定義：

在DNA熱變性時(shí)，其A26010DNA復(fù)性定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過(guò)程，稱復(fù)性或雜交。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過(guò)程稱為退火(annealing)?；A(chǔ)知識(shí)DNA復(fù)性定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿11基礎(chǔ)知識(shí)基礎(chǔ)知識(shí)12基礎(chǔ)知識(shí)dNTPdATPdCTPdGTPdTTPdNTP基礎(chǔ)知識(shí)dNTPdNTP13 PCR概念：在體外特異地復(fù)制一段已知序列的DNA片段的過(guò)程。第一節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)現(xiàn)在位置P169 PCR概念：在體外特異地復(fù)制一段已知序列的DNA片段的過(guò)程14一、PCR的原理和反應(yīng)過(guò)程PCR反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行DNA復(fù)制的過(guò)程，使DNA得以擴(kuò)增，每一次復(fù)制包括3個(gè)步驟：變性（denaturation）退火（annealing）延伸（extension）現(xiàn)在位置P125一、PCR的原理和反應(yīng)過(guò)程PCR反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行DNA復(fù)制的過(guò)程15變性（denaturation）

將待復(fù)制的雙鏈DNA經(jīng)加熱至94℃～95℃）左右一定時(shí)間后，DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，使之成為單鏈分子，作為反應(yīng)的模板（template)，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；

現(xiàn)在位置P170變性（denaturation）將待復(fù)制的雙鏈DN16退火（annealing）溫度降低至寡核苷酸（oligonucleotide）引物的融點(diǎn)溫度以下（40～70℃），使引物能與模板互補(bǔ)結(jié)合，形成雜交鏈；現(xiàn)在位置P125退火（annealing）溫度降低至寡核苷酸（oligo17延伸（extension）將溫度升至72℃左右，使反應(yīng)體系中的DNA聚合酶按照模板鏈的序列以互補(bǔ)的方式依次把dNTP加至引物的3’端，使雜交雙鏈不斷延伸，以至形成新的DNA雙鏈。

現(xiàn)在位置P125延伸（extension）將溫度升至72℃左右，使反18PCR的基本反應(yīng)過(guò)程變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C現(xiàn)在位置P170（40-70?C）PCR的基本反應(yīng)過(guò)程變性延伸退火現(xiàn)在位置P170（40-719PCR的擴(kuò)增效率現(xiàn)在位置P170循環(huán)次數(shù)：0123…n產(chǎn)物數(shù)量：2222…20123n每一次循環(huán)后，一分子模板被擴(kuò)增為兩個(gè)分子每個(gè)循環(huán)所產(chǎn)生的DNA片段，即為下一個(gè)循環(huán)的模板PCR產(chǎn)物量以指數(shù)形式增長(zhǎng)PCR的擴(kuò)增效率現(xiàn)在位置P170循環(huán)次數(shù)：01220模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶dNTPsMg2+

二、PCR體系基本組成成分現(xiàn)在位置P170模板DNA二、PCR體系基本組成成分現(xiàn)在位置P17021模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶dNTPs緩沖液二、PCR體系基本組成成分現(xiàn)在位置P170模板DNA二、PCR體系基本組成成分現(xiàn)在位置P17022模板(template)

模板就是將要被復(fù)制的核酸片段，包括基因組DNA、RNA、質(zhì)粒DNA和線粒體DNA等。在用RNA作為模板時(shí)，須先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA作為PCR反應(yīng)的模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。現(xiàn)在位置P125模板(template)模板就是將要被復(fù)制的核酸片段23耐熱DNA聚合酶

TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）是從一種生活在熱泉（80～90℃）中的水棲噬熱菌（Thermusaquaticus）中提取的，有很高的耐熱穩(wěn)定性。TaqDNA聚合酶的作用是催化DNA合成，即在模板指導(dǎo)下，以dNTP為原料，在引物的3’-OH端,加上dNTP,在二者間生成3’，5’-磷酸二酯鍵，使DNA鏈沿5’→3’方向延伸?，F(xiàn)在位置P170耐熱DNA聚合酶TaqDNA聚合酶（TaqDNAp24dNTPs即dATP、dCTP、dGTP和dTTP四種脫氧核苷三磷酸的混合物。反應(yīng)體系中4種核苷酸的濃度必須一致四種核苷酸間濃度的不平衡會(huì)增加反應(yīng)時(shí)DNA聚合酶錯(cuò)配的機(jī)率。濃度過(guò)高會(huì)加快反應(yīng)速度，但導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增降低在dNTP濃度會(huì)提高反應(yīng)的特異性一般為20~200umol/L現(xiàn)在位置P170dNTPs即dATP、dCTP、dGTP和dTTP四種脫氧核25鎂離子濃度鎂離子濃度在擴(kuò)增反應(yīng)中是一個(gè)至關(guān)重要的因素，因?yàn)殒V離子對(duì)于反應(yīng)系統(tǒng)本身、穩(wěn)定核苷酸和提高TaqDNA聚合酶的活性有直接的影響。Mg2+濃度過(guò)低使酶活力降低Mg2+濃度過(guò)高又會(huì)使酶催化非特異性擴(kuò)增。一般為1.5mmol/L現(xiàn)在位置P172鎂離子濃度鎂離子濃度在擴(kuò)增反應(yīng)中是一個(gè)至關(guān)重要的因素，因?yàn)?6

引物(Primer)引物是化學(xué)合成的已知序列的寡核苷酸(oligonucleotide)分子。引物決定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和長(zhǎng)度。

現(xiàn)在位置P170引物(Primer)引物是化學(xué)合成的已知序列的寡核苷酸(27引物設(shè)計(jì)時(shí)必須遵循的原則（6條）用于PCR反應(yīng)的引物需要二條，分別設(shè)在被擴(kuò)增目標(biāo)片段的二端，并分別與模板正負(fù)鏈序列互補(bǔ)。引物的長(zhǎng)度一般以18～25個(gè)核苷酸為宜引物過(guò)長(zhǎng)容易產(chǎn)生寡核苷酸的鏈內(nèi)互補(bǔ)，形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，引物過(guò)短則會(huì)降低擴(kuò)增的特異性；現(xiàn)在位置P171引物設(shè)計(jì)時(shí)必須遵循的原則（6條）用于PCR反應(yīng)的引物需要二條28引物設(shè)計(jì)時(shí)必須遵循的原則二條引物之間（尤其在3’端）的序列不可有互補(bǔ)，以免形成引物二聚體；引物的堿基組成應(yīng)平衡，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堿基堆積。C＋G的比例一般為45~55%。現(xiàn)在位置P171引物設(shè)計(jì)時(shí)必須遵循的原則二條引物之間（尤其在3’端）的序列不29PCR擴(kuò)增中的退火溫度是根據(jù)引物的Tm值而決定的，二條引物的Tm值不能差別太大。根據(jù)需要，合成引物時(shí)在其5’端可以加修飾成分 如加入酶切位點(diǎn)，用生物素、熒光素、地高辛等標(biāo)記，引入突變位點(diǎn)，引入啟動(dòng)子序列，引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列等?，F(xiàn)在位置P171引物設(shè)計(jì)時(shí)必須遵循的原則PCR擴(kuò)增中的退火溫度是根據(jù)引物的Tm值而決定的，二條引物的30三、反應(yīng)條件1、溫度①變性溫度：一般把變性溫度定在95～97℃之間，以使模板DNA和產(chǎn)物雙鏈完全打開(kāi)。②退火溫度：退火溫度決定PCR反應(yīng)的特異性，退火溫度的設(shè)定取決于引物的Tm，通常PCR的退火溫度應(yīng)低于引物Tm5℃左右。③延伸溫度：一般為72℃，在這個(gè)溫度下TaqDNA聚合酶具有較高的酶促活性，有利于DNA的復(fù)制。現(xiàn)在位置P172三、反應(yīng)條件1、溫度現(xiàn)在位置P172312、時(shí)間

PCR循環(huán)中每個(gè)步驟所需的時(shí)間取決于所擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。以長(zhǎng)度為200～1000bp的擴(kuò)增片段為例，循環(huán)中變性、退火和延伸三個(gè)步驟的持續(xù)時(shí)間一般均為30秒～1分鐘。在模板（尤其是基因組DNA）進(jìn)行第1次變性時(shí)應(yīng)給予足夠長(zhǎng)的時(shí)間（5～7分鐘，根據(jù)變性溫度高低而異）以使模板徹底變性，然后再進(jìn)入循環(huán)。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)降低擴(kuò)增的特異性?，F(xiàn)在位置P1732、時(shí)間PCR循環(huán)中每個(gè)步驟所需的時(shí)間取決于所擴(kuò)增片段的長(zhǎng)323、循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)一般為20～45次。PCR擴(kuò)增效率呈S型曲線，有平臺(tái)效應(yīng)平臺(tái)效應(yīng)的原因：初始模板量引物二聚體和反應(yīng)產(chǎn)物抑制擴(kuò)增反應(yīng)體系的組份被消耗引物與模板DNA間競(jìng)爭(zhēng)

現(xiàn)在位置1733、循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)一般為20～45次?，F(xiàn)在位置17333四、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制硬件方面實(shí)驗(yàn)室規(guī)范化設(shè)置軟件方面樣本采集核酸提取擴(kuò)增產(chǎn)物分析測(cè)定結(jié)果的報(bào)送現(xiàn)在位置P173四、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制硬件方面現(xiàn)在位置P17334（一）實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室必須包括四個(gè)工作區(qū)域：①試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)；②標(biāo)本制備區(qū)；③擴(kuò)增反應(yīng)區(qū)；④產(chǎn)物分析區(qū)。這四個(gè)區(qū)域必須互相獨(dú)立，并嚴(yán)格按照上述順序設(shè)置。每一區(qū)域都必須配置專用儀器，所用物品、試劑和耗材不得從某一個(gè)區(qū)域移至另一個(gè)區(qū)域使用?，F(xiàn)在位置P174（一）實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室必須包括四個(gè)35（二）PCR技術(shù)的質(zhì)量保證PCR技術(shù)用于臨床檢驗(yàn)的質(zhì)量保證主要涉及基因擴(kuò)增檢驗(yàn)全過(guò)程的質(zhì)量保證、室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量評(píng)價(jià)?，F(xiàn)在位置P129（二）PCR技術(shù)的質(zhì)量保證PCR技術(shù)用于臨床檢驗(yàn)的質(zhì)36（二）PCR技術(shù)的質(zhì)量保證樣本采集核酸提取擴(kuò)增產(chǎn)物分析測(cè)定結(jié)果的報(bào)送現(xiàn)在位置P129（二）PCR技術(shù)的質(zhì)量保證現(xiàn)在位置P12937（一）目的基因的克?。ǘ┗虻捏w外突變（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列測(cè)定（五）基因突變分析四、PCR的主要用途現(xiàn)在位置P（一）目的基因的克隆四、PCR的主要用途現(xiàn)在位置P38第二節(jié)以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)第二節(jié)以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)39（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（二）巢式（三）定量PCR技術(shù)（＊＊＊＊＊）（四）多重PCR技術(shù)（五）PCR誘導(dǎo)定點(diǎn)突變（六）原位PCR技術(shù)（七）差異顯示PCR技術(shù)（X）免疫PCR技術(shù)現(xiàn)在位置P174以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)現(xiàn)在位置P174以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)40（一）、逆轉(zhuǎn)錄PCR逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscriptionPCR,RT-PCR）是以細(xì)胞內(nèi)總RNA或mRNA為材料進(jìn)行體外擴(kuò)增的技術(shù)。由于耐熱的DNA聚合酶不能以RNA或mRNA作為模板，因此首先必須將總RNA或mRNA作逆轉(zhuǎn)錄，以生成與之互補(bǔ)的cDNA，然后再以cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到所需的目的基因片段。RT-PCR主要用于克隆cDNA、合成cDNA探針、檢測(cè)RNA病毒和分析基因表達(dá)等?，F(xiàn)在位置174（一）、逆轉(zhuǎn)錄PCR逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetrans41（二）、巢式PCR巢式PCR（nestedPCR）是對(duì)靶基因進(jìn)行二次擴(kuò)增。二次擴(kuò)增所用的引物不能相同，第二次擴(kuò)增所用的引物必須位于第一次擴(kuò)增所用引物的內(nèi)側(cè)先用第一對(duì)引物擴(kuò)增出一個(gè)較大的片段，再用第二對(duì)引物進(jìn)行第二次擴(kuò)增第二次擴(kuò)增的模板是第一次擴(kuò)增的產(chǎn)物現(xiàn)在位置174（二）、巢式PCR巢式PCR（nestedPCR）是對(duì)靶基42（二）、巢式PCR現(xiàn)在位置174引物1引物2nest要擴(kuò)增的目標(biāo)基因（二）、巢式PCR現(xiàn)在位置174引物1引物2nest要擴(kuò)增43（三）、定量PCR相對(duì)定量PCR定量PCR（實(shí)時(shí)熒光PCR）現(xiàn)在位置175（三）、定量PCR相對(duì)定量PCR現(xiàn)在位置17544（四）多重PCR技術(shù)多重PCR（multiplexPCR）即在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，以同時(shí)擴(kuò)增一份DNA樣品中多個(gè)不同序列的靶片段?，F(xiàn)在位置P179（四）多重PCR技術(shù)多重PCR（multiplex45（四）多重PCR技術(shù)多重PCR必須滿足的兩個(gè)條件：PCR反應(yīng)條件適合所有被擴(kuò)增的DNA片段同一反應(yīng)內(nèi)各擴(kuò)增片段的大小應(yīng)不同，以便檢測(cè)時(shí)能通過(guò)電泳將各片段充分分離現(xiàn)在位置P179（四）多重PCR技術(shù)多重PCR必須滿足的兩個(gè)條件：現(xiàn)在位置46（四）多重PCR技術(shù)現(xiàn)在位置P179（四）多重PCR技術(shù)現(xiàn)在位置P17947（四）多重PCR技術(shù)現(xiàn)在位置P179（四）多重PCR技術(shù)現(xiàn)在位置P17948（五）PCR誘導(dǎo)定點(diǎn)突變DNA重組技術(shù)使我們能夠首先用各種方法對(duì)克隆的DNA片段進(jìn)行突變，在對(duì)產(chǎn)生的突變作DNA序列分析以后，再對(duì)突變體的特殊功能作進(jìn)一步研究。現(xiàn)在位置P180（五）PCR誘導(dǎo)定點(diǎn)突變DNA重組技術(shù)使我們能夠首先49（六）原位PCR技術(shù)（insituPCR）組織固定處理細(xì)胞內(nèi)的DNA或RNA，并以其作為靶序列進(jìn)行PCR反應(yīng)的過(guò)程稱為原位PCR。原位PCR與普通PCR的主要區(qū)別在于模板的制備。經(jīng)脫蠟處理的組織切片或滴加在載玻片上的細(xì)胞懸液都可作為擴(kuò)增樣品，所有步驟均在載玻片上進(jìn)行。現(xiàn)在位置P134（六）原位PCR技術(shù)（insituPCR）組織固50（六）原位PCR技術(shù)（insituPCR）進(jìn)行PCR時(shí)，加入地高辛標(biāo)記的的dUTP，使擴(kuò)增產(chǎn)物帶有地高辛。PCR結(jié)束，加入酶標(biāo)抗地高辛抗體，再加入底物顯色。

現(xiàn)在位置P134（六）原位PCR技術(shù)（insituPCR）進(jìn)行P51（六）原位雜交PCR

原位雜交PCR與原位PCR的唯一區(qū)別：擴(kuò)增結(jié)束后，用寡核苷酸探針與擴(kuò)增產(chǎn)物作原位雜交?，F(xiàn)在位置P134（六）原位雜交PCR原位雜交PCR與原位PCR的唯一區(qū)別：52（七）差異顯示PCR

（defferentialdisplayPCR,DD-PCR）現(xiàn)在位置P182一種以逆轉(zhuǎn)錄PCR為基礎(chǔ)的研究基因表達(dá)差異的技術(shù)。DD-PCR主要用于腫瘤和多種疾病的分子遺傳學(xué)研究，是目前篩選基因表達(dá)差異最有效的方法。（七）差異顯示PCR

（defferentialdispl53核酸擴(kuò)增技術(shù)課件54（X）免疫PCR（immuno-PCR,IPCR）結(jié)合PCR技術(shù)和抗原抗體反應(yīng)用于檢測(cè)抗原（蛋白質(zhì)）固相載體上包被有抗體1抗體2上標(biāo)記有DNA，作為PCR的模板現(xiàn)在位置P134（X）免疫PCR（immuno-PCR,IPCR）結(jié)合PCR55（X）免疫PCR（Immuno-PCR,IPCR）第一步：載體－抗體1->抗原<-抗體2－DNA（C－DNA）第二步：C－DNA->PCR現(xiàn)在位置P134（X）免疫PCR（Immuno-PCR,IPCR）第一步：現(xiàn)56核酸擴(kuò)增技術(shù)課件57（X）免疫PCR（immuno-PCR,IPCR）IPCR的靈敏度是ELISA的100-10000倍現(xiàn)在位置P134（X）免疫PCR（immuno-PCR,IPCR）IPCR的58第三節(jié)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)DetectionofthePCRproduct第三節(jié)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)59第三節(jié)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)PCR完成以后，必須對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)有效性和正確性：通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，觀察擴(kuò)增條帶的有無(wú)、擴(kuò)增片段的大小等判斷PCR反應(yīng)的有效性和正確性。PCR產(chǎn)物定量：（專門章節(jié)講）序列是否正確：測(cè)序現(xiàn)在位置P185第三節(jié)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)PCR完成以后，必須對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行60一、PCR—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性是根據(jù)突變序列是否位于限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)內(nèi)而設(shè)計(jì)的對(duì)PCR產(chǎn)物作限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析的技術(shù)。若點(diǎn)突變處于某一限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)內(nèi)，可在突變點(diǎn)二側(cè)設(shè)計(jì)引物，使PCR產(chǎn)物含有該突變序列。一種檢測(cè)點(diǎn)突變的技術(shù)，應(yīng)用十分廣泛?，F(xiàn)在位置P185一、PCR—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性是根據(jù)突變序列是否位于限制性61基因組中某個(gè)基因在同種生物的不同個(gè)體中，同時(shí)和經(jīng)常存在的兩種或兩種以上的變異型，以至于用某種限制性核酸內(nèi)切酶消化基因組的某段序列時(shí)，會(huì)呈現(xiàn)不同長(zhǎng)度的消化片段，形成生物群體的多態(tài)性，這種多態(tài)性稱為限制性核酸內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)基因組中某個(gè)基因在同種生物的不同個(gè)體中，同時(shí)和經(jīng)常存在的兩種62EcoRI5’-GAATTC-3’5’-NNNNNNNGAATTCNNNNNN-3’5’-NNNNNNNGAATTCNNNNNN-3’P1P2EcoRI5’-GAATTC-3’5’-NNNNNNNGA635’-NNNNNNNGAATTCNNNNNN-3’5’-NNNNGAATTCNNN-3’5’-NNNNNNNGTATTCNNNNNN-3’EcoRI5’-NNNNNNNGTATTCNNNNNN-3’EcoRI+_+_5’-NNNNNNNGAATTCNNNNNN-3’5’-NN64RFLP的優(yōu)缺點(diǎn)RFLP用于檢測(cè)點(diǎn)突變可以確定點(diǎn)突變的位置RFLP的優(yōu)缺點(diǎn)RFLP用于檢測(cè)點(diǎn)突變65二、等位基因特異性寡核苷酸Allelespecificoligonucleotide,ASO是用寡核苷酸探針和PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交以檢測(cè)點(diǎn)突變的方法。被檢基因片段經(jīng)PCR擴(kuò)增并經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到膜上，分別與經(jīng)標(biāo)記的含有正常序列和突變序列的寡核苷酸探針雜交。PCR產(chǎn)物僅與完全互補(bǔ)的探針雜交現(xiàn)在位置P185二、等位基因特異性寡核苷酸Allelespecifico66野生型基因DNA突變型基因DNA野生型基因DNA探針突變型基因DNA探針野生型基因DNA突變型基因DNA野生型基因DNA探針突變型基67野生型基因DNA探針突變型基因DNA探針結(jié)論：不存在點(diǎn)突變野生型基因DNA探針突變型基因DNA探針結(jié)論：不存在點(diǎn)突變68野生型基因DNA探針突變型基因DNA探針結(jié)論：存在點(diǎn)突變野生型基因DNA探針突變型基因DNA探針結(jié)論：存在點(diǎn)突變69DNA片段在瓊脂糖凝膠上電泳分離膜上固定DNA片段在緩沖液中將標(biāo)記的探針加到膜上DNA片段從瓊脂糖凝膠上轉(zhuǎn)印到膜上雜交信號(hào)的檢測(cè)DNA片段在瓊脂糖凝膠上電泳分離膜上固定DNA片段在緩沖液中70ASO的優(yōu)缺點(diǎn)用于檢測(cè)點(diǎn)突變由于探針的序列是已知的，可以確定點(diǎn)突變的位置缺點(diǎn)是成本相對(duì)較高，檢測(cè)一個(gè)點(diǎn)突變即需要一對(duì)引物和一對(duì)寡核苷酸探針現(xiàn)在位置P185ASO的優(yōu)缺點(diǎn)用于檢測(cè)點(diǎn)突變現(xiàn)在位置P18571三、單鏈構(gòu)象多態(tài)性單鏈構(gòu)象多態(tài)性（Singlestrandconformationpolymorphism,SSCP）當(dāng)DNA分子以單鏈存在時(shí)，能在空間內(nèi)自發(fā)地形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，這種二級(jí)結(jié)構(gòu)的空間構(gòu)象取決于DNA分子本身的的堿基構(gòu)成，即使一個(gè)堿基的差別也會(huì)形成不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)。SSCP用于檢測(cè)點(diǎn)突變?nèi)秉c(diǎn)：不能確定突變的位置現(xiàn)在位置P186三、單鏈構(gòu)象多態(tài)性單鏈構(gòu)象多態(tài)性（Singlestrand72三、單鏈構(gòu)象多態(tài)性突變DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后產(chǎn)生與正常DNA空間構(gòu)象不同的兩條單鏈。在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中時(shí)，不同構(gòu)象的單鏈片段具有不同的電泳遷移率，從而能區(qū)別正常與突變的DNA。只適合于檢測(cè)200bp以內(nèi)的DNA靶基因片段實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵是控制各種條件以避免在操作過(guò)程中DAN單鏈分子復(fù)性為雙鏈?，F(xiàn)在位置P186三、單鏈構(gòu)象多態(tài)性突變DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后產(chǎn)生與正常D73四、變性梯度凝膠電泳現(xiàn)在位置P186DNA分子的物理特性之一是當(dāng)DNA分子被加熱至其融點(diǎn)溫度時(shí)雙鏈被打開(kāi)。融點(diǎn)溫度取決于DNA分子本身的序列，不同序列的DNA分子具有不同的融點(diǎn)溫度。四、變性梯度凝膠電泳現(xiàn)在位置P186DNA分子的物理特性74變性梯度凝膠電泳技術(shù)正是利用了DNA分子的這一特性。在設(shè)計(jì)引物時(shí)使被擴(kuò)增目的片段的二端含有不同的Tm值，一端較高，另一端相對(duì)較低。將這一PCR產(chǎn)物在由變性劑形成梯度的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，當(dāng)其泳動(dòng)至相應(yīng)位置時(shí)，片段于Tm值較低一端的雙鏈被部分解鏈，如此形成的構(gòu)象至使該片段的電泳遷移率大大降低?，F(xiàn)在位置P186變性梯度凝膠電泳技術(shù)正是利用了DNA分子的這一特性。現(xiàn)在位置75＋－變性劑濃度由低到高Tm值低Tm值高＋－變性劑濃度由低到高Tm值低Tm值高76變性梯度凝膠電泳的優(yōu)缺點(diǎn)變性梯度凝膠電泳技術(shù)用于檢測(cè)點(diǎn)突變?nèi)秉c(diǎn)：不能確定突變的位置現(xiàn)在位置P186變性梯度凝膠電泳的優(yōu)缺點(diǎn)變性梯度凝膠電泳技術(shù)用于檢測(cè)點(diǎn)突變現(xiàn)77Tm值的大小取決于DNA分子的長(zhǎng)度和其序列中的G/C含量雙鏈DNA可以結(jié)合熒光染料（SYBRGreenI）DNA復(fù)性時(shí)，熒光最強(qiáng)，隨溫度上升，熒光變?nèi)?，形成融點(diǎn)曲線。正常序列和突變序列因不同Tm而產(chǎn)生不同的融點(diǎn)曲線。

五、融點(diǎn)曲線分析現(xiàn)在位置P137Tm值的大小取決于DNA分子的長(zhǎng)度和其序列中的G/C含量五、78溫度熒光強(qiáng)度溫度熒光強(qiáng)度79溫度熒光強(qiáng)度溫度熒光強(qiáng)度80優(yōu)點(diǎn)：PCR產(chǎn)物不需要純化，可以直接分析可以進(jìn)行大批量樣本分析，成本低結(jié)果重復(fù)性可達(dá)100%缺點(diǎn)：不能確定突變的位置五、融點(diǎn)曲線分析現(xiàn)在位置P137優(yōu)點(diǎn)：五、融點(diǎn)曲線分析現(xiàn)在位置P13781PCR產(chǎn)物的序列分析主要用于

分子克隆時(shí)對(duì)于目的基因擴(kuò)增片段的序列鑒定 對(duì)致病基因檢測(cè)時(shí)分析擴(kuò)增片段中點(diǎn)突變的位置和性質(zhì)。六、PCR產(chǎn)物的序列分析現(xiàn)在位置P137PCR產(chǎn)物的序列分析主要用于六、PCR產(chǎn)物的序列分析現(xiàn)在位置82DNA自動(dòng)測(cè)序采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)DNA序列分析自動(dòng)化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸，然后進(jìn)行Sanger測(cè)序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細(xì)管電泳）分離后，通過(guò)四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長(zhǎng)熒光，檢測(cè)器采集熒光信號(hào)，并依此確定DNA堿基的排列順序。DNA自動(dòng)測(cè)序采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)DNA序列分析83DNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果舉例目錄DNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果舉例目錄84PCR產(chǎn)物序列分析的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：可以確定點(diǎn)突變的位置和性質(zhì)缺點(diǎn)：成本貴PCR產(chǎn)物序列分析的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：85PCR產(chǎn)物分析方法的比較用于突變位置突變性質(zhì)RFLP點(diǎn)突變能確定不能確定ASO點(diǎn)突變能確定能確定SSCP點(diǎn)突變不能確定不能確定DGGE點(diǎn)突變不能確定不能確定融點(diǎn)曲線點(diǎn)突變不能確定不能確定測(cè)序點(diǎn)突變能確定能確定PCR產(chǎn)物分析方法的比較用于突變位置突變性質(zhì)RFLP點(diǎn)突變能86拓展：PCR技術(shù)在分子診斷中的應(yīng)用分子診斷的定義就是用分子生物學(xué)技術(shù)通過(guò)檢測(cè)被檢測(cè)基因的存在與否、結(jié)構(gòu)變化或表達(dá)異常，確定受檢者有無(wú)基因水平的變化，并以此作為確認(rèn)疾病的依據(jù)。分子診斷不僅能在疾病早期對(duì)患者作出確切的診斷，也能判別致病基因的攜帶者，確定個(gè)體對(duì)疾病的易感性并對(duì)疾病的分期、分型、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后作出判斷。因此，分子診斷已成為檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的一個(gè)重要組成部分?，F(xiàn)在位置拓展：PCR技術(shù)在分子診斷中的應(yīng)用分子診斷的定87目前分子診斷最常見(jiàn)的應(yīng)用：(1)鑒定位于眾多正常細(xì)胞背景下的少量癌細(xì)胞；(2)鑒定具有發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體，以便及時(shí)采取有效的預(yù)防措施；(3)確定對(duì)特定治療可能敏感的患者，避免不必要的治療干預(yù)；(4)選擇復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高、能從初期治療中受益的患者；(5)鑒定對(duì)治療有產(chǎn)生嚴(yán)重毒性反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的患者。目前分子診斷最常見(jiàn)的應(yīng)用：(1)鑒定位于眾多正常細(xì)胞背景下的88兩個(gè)對(duì)照組1、陰性對(duì)照水2、陽(yáng)性對(duì)照

兩個(gè)對(duì)照組1、陰性對(duì)照89診斷策略1、直接診斷策略直接診斷就是用分子生物技術(shù)檢測(cè)基因的缺失、重組或是點(diǎn)突變等遺傳缺陷。進(jìn)行直接診斷的前提必須了解被檢基因的正常結(jié)構(gòu)和序列。2、間接診斷策略間接診斷實(shí)際上就是對(duì)家系進(jìn)行連鎖分析，以確定被檢個(gè)體的同源染色體中哪一條與致病基因連鎖，從而判斷被檢個(gè)體患病的可能性。診斷策略1、直接診斷策略90間接診斷策略的遺傳標(biāo)記（1）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（2）可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)（variabletandemrepeat,VNTR）和短串聯(lián)重復(fù)（shorttandemrepeat,STR）（3）單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）：間接診斷策略的遺傳標(biāo)記（1）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性91（1）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性

（PCR-RFLP)兒童型脊髓性肌萎縮癥

(spinalmuscularatrophy，SMA)是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)常染色體隱性遺傳病，SMN基因?yàn)槠渲饕虏』颍s98．6％的患者有SMN基因第7、第8外顯子或單純第7外顯子的純合缺失或突變。（1）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性

（PCR-RFL92檢驗(yàn)流程外周靜脈血提取DNA設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切電泳檢測(cè)檢驗(yàn)流程外周靜脈血提取DNA設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增產(chǎn)物93

PCR—RFLP技術(shù)簡(jiǎn)單易行，只要對(duì)常發(fā)生基因缺失的第7、第8外顯子設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、酶切即可。它是通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳后判斷有無(wú)特異性酶切條帶來(lái)做出診斷，因而有特異性較高，重復(fù)性好，快速，經(jīng)濟(jì)，需模板量少等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)I、Ⅱ型SMA患者而言，其第7、第8外顯子的缺失診斷率分別達(dá)100％和91．7％，因而可以避免因創(chuàng)傷性檢查——肌活檢所帶來(lái)的痛苦，對(duì)其家系的遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷都具有重要意義。PCR—RFLP技術(shù)簡(jiǎn)單易行，只要對(duì)常發(fā)生基因缺失的942）可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)和短串聯(lián)重復(fù)（STR）親子鑒定2）可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)和短串聯(lián)重復(fù)（STR）親子鑒定95核酸擴(kuò)增技術(shù)課件96作業(yè)1.運(yùn)用分子檢驗(yàn)技術(shù)如何確診被檢者是否患病，其檢驗(yàn)流程如何？圖示之2.PCR引物的設(shè)計(jì)原則是什么？如何設(shè)計(jì)引物？作業(yè)1.運(yùn)用分子檢驗(yàn)技術(shù)如何確診被檢者是否患病，其檢驗(yàn)流程如97核酸擴(kuò)增技術(shù)課件核酸擴(kuò)增技術(shù)課件98大綱要求：掌握PCR的原理和反應(yīng)過(guò)程掌握PCR反應(yīng)體系掌握PCR產(chǎn)物的檢測(cè)熟悉實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理和方法了解以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)Special大綱要求：掌握PCR的原理和反應(yīng)過(guò)程Special99二、教學(xué)內(nèi)容第一節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)第二節(jié)以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)第三節(jié)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)第X節(jié)實(shí)時(shí)熒光定量PCR現(xiàn)在位置P169二、教學(xué)內(nèi)容第一節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)現(xiàn)在位置P169100基礎(chǔ)知識(shí)遺傳中心法則現(xiàn)在位置P169基礎(chǔ)知識(shí)遺傳中心法則現(xiàn)在位置P169101+基礎(chǔ)知識(shí)+基礎(chǔ)知識(shí)102基礎(chǔ)知識(shí)基礎(chǔ)知識(shí)103DNA加熱變性DNA冷卻復(fù)性一、核酸分子雜交的基本原理基礎(chǔ)知識(shí)DNA加熱變性DNA冷卻復(fù)性一、核酸分子雜交的基本原理基礎(chǔ)知104DNA變性(denaturation)定義：在某些理化因素作用下，DNA分子內(nèi)堿基對(duì)之間的氫鍵斷裂，使規(guī)則有序的雙螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)椴灰?guī)則無(wú)序的單鏈線團(tuán)樣結(jié)構(gòu)的過(guò)程?；A(chǔ)知識(shí)DNA變性(denaturation)基礎(chǔ)知識(shí)105基礎(chǔ)知識(shí)基礎(chǔ)知識(shí)106融解溫度（Tm）定義：

在DNA熱變性時(shí)，其A260的升高達(dá)最大值一半時(shí)的溫度?；A(chǔ)知識(shí)meltingtemperature，融解溫度（Tm）定義：

在DNA熱變性時(shí)，其A260107DNA復(fù)性定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過(guò)程，稱復(fù)性或雜交。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過(guò)程稱為退火(annealing)?；A(chǔ)知識(shí)DNA復(fù)性定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿108基礎(chǔ)知識(shí)基礎(chǔ)知識(shí)109基礎(chǔ)知識(shí)dNTPdATPdCTPdGTPdTTPdNTP基礎(chǔ)知識(shí)dNTPdNTP110 PCR概念：在體外特異地復(fù)制一段已知序列的DNA片段的過(guò)程。第一節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)現(xiàn)在位置P169 PCR概念：在體外特異地復(fù)制一段已知序列的DNA片段的過(guò)程111一、PCR的原理和反應(yīng)過(guò)程PCR反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行DNA復(fù)制的過(guò)程，使DNA得以擴(kuò)增，每一次復(fù)制包括3個(gè)步驟：變性（denaturation）退火（annealing）延伸（extension）現(xiàn)在位置P125一、PCR的原理和反應(yīng)過(guò)程PCR反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行DNA復(fù)制的過(guò)程112變性（denaturation）

將待復(fù)制的雙鏈DNA經(jīng)加熱至94℃～95℃）左右一定時(shí)間后，DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，使之成為單鏈分子，作為反應(yīng)的模板（template)，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；

現(xiàn)在位置P170變性（denaturation）將待復(fù)制的雙鏈DN113退火（annealing）溫度降低至寡核苷酸（oligonucleotide）引物的融點(diǎn)溫度以下（40～70℃），使引物能與模板互補(bǔ)結(jié)合，形成雜交鏈；現(xiàn)在位置P125退火（annealing）溫度降低至寡核苷酸（oligo114延伸（extension）將溫度升至72℃左右，使反應(yīng)體系中的DNA聚合酶按照模板鏈的序列以互補(bǔ)的方式依次把dNTP加至引物的3’端，使雜交雙鏈不斷延伸，以至形成新的DNA雙鏈。

現(xiàn)在位置P125延伸（extension）將溫度升至72℃左右，使反115PCR的基本反應(yīng)過(guò)程變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C現(xiàn)在位置P170（40-70?C）PCR的基本反應(yīng)過(guò)程變性延伸退火現(xiàn)在位置P170（40-7116PCR的擴(kuò)增效率現(xiàn)在位置P170循環(huán)次數(shù)：0123…n產(chǎn)物數(shù)量：2222…20123n每一次循環(huán)后，一分子模板被擴(kuò)增為兩個(gè)分子每個(gè)循環(huán)所產(chǎn)生的DNA片段，即為下一個(gè)循環(huán)的模板PCR產(chǎn)物量以指數(shù)形式增長(zhǎng)PCR的擴(kuò)增效率現(xiàn)在位置P170循環(huán)次數(shù)：012117模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶dNTPsMg2+

二、PCR體系基本組成成分現(xiàn)在位置P170模板DNA二、PCR體系基本組成成分現(xiàn)在位置P170118模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶dNTPs緩沖液二、PCR體系基本組成成分現(xiàn)在位置P170模板DNA二、PCR體系基本組成成分現(xiàn)在位置P170119模板(template)

模板就是將要被復(fù)制的核酸片段，包括基因組DNA、RNA、質(zhì)粒DNA和線粒體DNA等。在用RNA作為模板時(shí)，須先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA作為PCR反應(yīng)的模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)?，F(xiàn)在位置P125模板(template)模板就是將要被復(fù)制的核酸片段120耐熱DNA聚合酶

TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）是從一種生活在熱泉（80～90℃）中的水棲噬熱菌（Thermusaquaticus）中提取的，有很高的耐熱穩(wěn)定性。TaqDNA聚合酶的作用是催化DNA合成，即在模板指導(dǎo)下，以dNTP為原料，在引物的3’-OH端,加上dNTP,在二者間生成3’，5’-磷酸二酯鍵，使DNA鏈沿5’→3’方向延伸?，F(xiàn)在位置P170耐熱DNA聚合酶TaqDNA聚合酶（TaqDNAp121dNTPs即dATP、dCTP、dGTP和dTTP四種脫氧核苷三磷酸的混合物。反應(yīng)體系中4種核苷酸的濃度必須一致四種核苷酸間濃度的不平衡會(huì)增加反應(yīng)時(shí)DNA聚合酶錯(cuò)配的機(jī)率。濃度過(guò)高會(huì)加快反應(yīng)速度，但導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增降低在dNTP濃度會(huì)提高反應(yīng)的特異性一般為20~200umol/L現(xiàn)在位置P170dNTPs即dATP、dCTP、dGTP和dTTP四種脫氧核122鎂離子濃度鎂離子濃度在擴(kuò)增反應(yīng)中是一個(gè)至關(guān)重要的因素，因?yàn)殒V離子對(duì)于反應(yīng)系統(tǒng)本身、穩(wěn)定核苷酸和提高TaqDNA聚合酶的活性有直接的影響。Mg2+濃度過(guò)低使酶活力降低Mg2+濃度過(guò)高又會(huì)使酶催化非特異性擴(kuò)增。一般為1.5mmol/L現(xiàn)在位置P172鎂離子濃度鎂離子濃度在擴(kuò)增反應(yīng)中是一個(gè)至關(guān)重要的因素，因?yàn)?23

引物(Primer)引物是化學(xué)合成的已知序列的寡核苷酸(oligonucleotide)分子。引物決定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和長(zhǎng)度。

現(xiàn)在位置P170引物(Primer)引物是化學(xué)合成的已知序列的寡核苷酸(124引物設(shè)計(jì)時(shí)必須遵循的原則（6條）用于PCR反應(yīng)的引物需要二條，分別設(shè)在被擴(kuò)增目標(biāo)片段的二端，并分別與模板正負(fù)鏈序列互補(bǔ)。引物的長(zhǎng)度一般以18～25個(gè)核苷酸為宜引物過(guò)長(zhǎng)容易產(chǎn)生寡核苷酸的鏈內(nèi)互補(bǔ)，形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，引物過(guò)短則會(huì)降低擴(kuò)增的特異性；現(xiàn)在位置P171引物設(shè)計(jì)時(shí)必須遵循的原則（6條）用于PCR反應(yīng)的引物需要二條125引物設(shè)計(jì)時(shí)必須遵循的原則二條引物之間（尤其在3’端）的序列不可有互補(bǔ)，以免形成引物二聚體；引物的堿基組成應(yīng)平衡，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堿基堆積。C＋G的比例一般為45~55%?，F(xiàn)在位置P171引物設(shè)計(jì)時(shí)必須遵循的原則二條引物之間（尤其在3’端）的序列不126PCR擴(kuò)增中的退火溫度是根據(jù)引物的Tm值而決定的，二條引物的Tm值不能差別太大。根據(jù)需要，合成引物時(shí)在其5’端可以加修飾成分 如加入酶切位點(diǎn)，用生物素、熒光素、地高辛等標(biāo)記，引入突變位點(diǎn)，引入啟動(dòng)子序列，引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列等?，F(xiàn)在位置P171引物設(shè)計(jì)時(shí)必須遵循的原則PCR擴(kuò)增中的退火溫度是根據(jù)引物的Tm值而決定的，二條引物的127三、反應(yīng)條件1、溫度①變性溫度：一般把變性溫度定在95～97℃之間，以使模板DNA和產(chǎn)物雙鏈完全打開(kāi)。②退火溫度：退火溫度決定PCR反應(yīng)的特異性，退火溫度的設(shè)定取決于引物的Tm，通常PCR的退火溫度應(yīng)低于引物Tm5℃左右。③延伸溫度：一般為72℃，在這個(gè)溫度下TaqDNA聚合酶具有較高的酶促活性，有利于DNA的復(fù)制?，F(xiàn)在位置P172三、反應(yīng)條件1、溫度現(xiàn)在位置P1721282、時(shí)間

PCR循環(huán)中每個(gè)步驟所需的時(shí)間取決于所擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。以長(zhǎng)度為200～1000bp的擴(kuò)增片段為例，循環(huán)中變性、退火和延伸三個(gè)步驟的持續(xù)時(shí)間一般均為30秒～1分鐘。在模板（尤其是基因組DNA）進(jìn)行第1次變性時(shí)應(yīng)給予足夠長(zhǎng)的時(shí)間（5～7分鐘，根據(jù)變性溫度高低而異）以使模板徹底變性，然后再進(jìn)入循環(huán)。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)降低擴(kuò)增的特異性。現(xiàn)在位置P1732、時(shí)間PCR循環(huán)中每個(gè)步驟所需的時(shí)間取決于所擴(kuò)增片段的長(zhǎng)1293、循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)一般為20～45次。PCR擴(kuò)增效率呈S型曲線，有平臺(tái)效應(yīng)平臺(tái)效應(yīng)的原因：初始模板量引物二聚體和反應(yīng)產(chǎn)物抑制擴(kuò)增反應(yīng)體系的組份被消耗引物與模板DNA間競(jìng)爭(zhēng)

現(xiàn)在位置1733、循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)一般為20～45次?，F(xiàn)在位置173130四、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制硬件方面實(shí)驗(yàn)室規(guī)范化設(shè)置軟件方面樣本采集核酸提取擴(kuò)增產(chǎn)物分析測(cè)定結(jié)果的報(bào)送現(xiàn)在位置P173四、PCR技術(shù)的質(zhì)量控制硬件方面現(xiàn)在位置P173131（一）實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室必須包括四個(gè)工作區(qū)域：①試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)；②標(biāo)本制備區(qū)；③擴(kuò)增反應(yīng)區(qū)；④產(chǎn)物分析區(qū)。這四個(gè)區(qū)域必須互相獨(dú)立，并嚴(yán)格按照上述順序設(shè)置。每一區(qū)域都必須配置專用儀器，所用物品、試劑和耗材不得從某一個(gè)區(qū)域移至另一個(gè)區(qū)域使用?，F(xiàn)在位置P174（一）實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室必須包括四個(gè)132（二）PCR技術(shù)的質(zhì)量保證PCR技術(shù)用于臨床檢驗(yàn)的質(zhì)量保證主要涉及基因擴(kuò)增檢驗(yàn)全過(guò)程的質(zhì)量保證、室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量評(píng)價(jià)?，F(xiàn)在位置P129（二）PCR技術(shù)的質(zhì)量保證PCR技術(shù)用于臨床檢驗(yàn)的質(zhì)133（二）PCR技術(shù)的質(zhì)量保證樣本采集核酸提取擴(kuò)增產(chǎn)物分析測(cè)定結(jié)果的報(bào)送現(xiàn)在位置P129（二）PCR技術(shù)的質(zhì)量保證現(xiàn)在位置P129134（一）目的基因的克?。ǘ┗虻捏w外突變（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列測(cè)定（五）基因突變分析四、PCR的主要用途現(xiàn)在位置P（一）目的基因的克隆四、PCR的主要用途現(xiàn)在位置P135第二節(jié)以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)第二節(jié)以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)136（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（二）巢式（三）定量PCR技術(shù)（＊＊＊＊＊）（四）多重PCR技術(shù)（五）PCR誘導(dǎo)定點(diǎn)突變（六）原位PCR技術(shù)（七）差異顯示PCR技術(shù)（X）免疫PCR技術(shù)現(xiàn)在位置P174以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)現(xiàn)在位置P174以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)137（一）、逆轉(zhuǎn)錄PCR逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscriptionPCR,RT-PCR）是以細(xì)胞內(nèi)總RNA或mRNA為材料進(jìn)行體外擴(kuò)增的技術(shù)。由于耐熱的DNA聚合酶不能以RNA或mRNA作為模板，因此首先必須將總RNA或mRNA作逆轉(zhuǎn)錄，以生成與之互補(bǔ)的cDNA，然后再以cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到所需的目的基因片段。RT-PCR主要用于克隆cDNA、合成cDNA探針、檢測(cè)RNA病毒和分析基因表達(dá)等。現(xiàn)在位置174（一）、逆轉(zhuǎn)錄PCR逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetrans138（二）、巢式PCR巢式PCR（nestedPCR）是對(duì)靶基因進(jìn)行二次擴(kuò)增。二次擴(kuò)增所用的引物不能相同，第二次擴(kuò)增所用的引物必須位于第一次擴(kuò)增所用引物的內(nèi)側(cè)先用第一對(duì)引物擴(kuò)增出一個(gè)較大的片段，再用第二對(duì)引物進(jìn)行第二次擴(kuò)增第二次擴(kuò)增的模板是第一次擴(kuò)增的產(chǎn)物現(xiàn)在位置174（二）、巢式PCR巢式PCR（nestedPCR）是對(duì)靶基139（二）、巢式PCR現(xiàn)在位置174引物1引物2nest要擴(kuò)增的目標(biāo)基因（二）、巢式PCR現(xiàn)在位置174引物1引物2nest要擴(kuò)增140（三）、定量PCR相對(duì)定量PCR定量PCR（實(shí)時(shí)熒光PCR）現(xiàn)在位置175（三）、定量PCR相對(duì)定量PCR現(xiàn)在位置175141（四）多重PCR技術(shù)多重PCR（multiplexPCR）即在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，以同時(shí)擴(kuò)增一份DNA樣品中多個(gè)不同序列的靶片段?，F(xiàn)在位置P179（四）多重PCR技術(shù)多重PCR（multiplex142（四）多重PCR技術(shù)多重PCR必須滿足的兩個(gè)條件：PCR反應(yīng)條件適合所有被擴(kuò)增的DNA片段同一反應(yīng)內(nèi)各擴(kuò)增片段的大小應(yīng)不同，以便檢測(cè)時(shí)能通過(guò)電泳將各片段充分分離現(xiàn)在位置P179（四）多重PCR技術(shù)多重PCR必須滿足的兩個(gè)條件：現(xiàn)在位置143（四）多重PCR技術(shù)現(xiàn)在位置P179（四）多重PCR技術(shù)現(xiàn)在位置P179144（四）多重PCR技術(shù)現(xiàn)在位置P179（四）多重PCR技術(shù)現(xiàn)在位置P179145（五）PCR誘導(dǎo)定點(diǎn)突變DNA重組技術(shù)使我們能夠首先用各種方法對(duì)克隆的DNA片段進(jìn)行突變，在對(duì)產(chǎn)生的突變作DNA序列分析以后，再對(duì)突變體的特殊功能作進(jìn)一步研究?，F(xiàn)在位置P180（五）PCR誘導(dǎo)定點(diǎn)突變DNA重組技術(shù)使我們能夠首先146（六）原位PCR技術(shù)（insituPCR）組織固定處理細(xì)胞內(nèi)的DNA或RNA，并以其作為靶序列進(jìn)行PCR反應(yīng)的過(guò)程稱為原位PCR。原位PCR與普通PCR的主要區(qū)別在于模板的制備。經(jīng)脫蠟處理的組織切片或滴加在載玻片上的細(xì)胞懸液都可作為擴(kuò)增樣品，所有步驟均在載玻片上進(jìn)行?，F(xiàn)在位置P134（六）原位PCR技術(shù)（insituPCR）組織固147（六）原位PCR技術(shù)（insituPCR）進(jìn)行PCR時(shí)，加入地高辛標(biāo)記的的dUTP，使擴(kuò)增產(chǎn)物帶有地高辛。PCR結(jié)束，加入酶標(biāo)抗地高辛抗體，再加入底物顯色。

現(xiàn)在位置P134（六）原位PCR技術(shù)（insituPCR）進(jìn)行P148（六）原位雜交PCR

原位雜交PCR與原位PCR的唯一區(qū)別：擴(kuò)增結(jié)束后，用寡核苷酸探針與擴(kuò)增產(chǎn)物作原位雜交?，F(xiàn)在位置P134（六）原位雜交PCR原位雜交PCR與原位PCR的唯一區(qū)別：149（七）差異顯示PCR

（defferentialdisplayPCR,DD-PCR）現(xiàn)在位置P182一種以逆轉(zhuǎn)錄PCR為基礎(chǔ)的研究基因表達(dá)差異的技術(shù)。DD-PCR主要用于腫瘤和多種疾病的分子遺傳學(xué)研究，是目前篩選基因表達(dá)差異最有效的方法。（七）差異顯示PCR

（defferentialdispl150核酸擴(kuò)增技術(shù)課件151（X）免疫PCR（immuno-PCR,IPCR）結(jié)合PCR技術(shù)和抗原抗體反應(yīng)用于檢測(cè)抗原（蛋白質(zhì)）固相載體上包被有抗體1抗體2上標(biāo)記有DNA，作為PCR的模板現(xiàn)在位置P134（X）免疫PCR（immuno-PCR,IPCR）結(jié)合PCR152（X）免疫PCR（Immuno-PCR,IPCR）第一步：載體－抗體1->抗原<-抗體2－DNA（C－DNA）第二步：C－DNA->PCR現(xiàn)在位置P134（X）免疫PCR（Immuno-PCR,IPCR）第一步：現(xiàn)153核酸擴(kuò)增技術(shù)課件154（X）免疫PCR（immuno-PCR,IPCR）IPCR的靈敏度是ELISA的100-10000倍現(xiàn)在位置P134（X）免疫PCR（immuno-PCR,IPCR）IPCR的155第三節(jié)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)DetectionofthePCRproduct第三節(jié)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)156第三節(jié)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)PCR完成以后，必須對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)有效性和正確性：通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，觀察擴(kuò)增條帶的有無(wú)、擴(kuò)增片段的大小等判斷PCR反應(yīng)的有效性和正確性。PCR產(chǎn)物定量：（專門章節(jié)講）序列是否正確：測(cè)序現(xiàn)在位置P185第三節(jié)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)PCR完成以后，必須對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行157一、PCR—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性是根據(jù)突變序列是否位于限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)內(nèi)而設(shè)計(jì)的對(duì)PCR產(chǎn)物作限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析的技術(shù)。若點(diǎn)突變處于某一限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)內(nèi)，可在突變點(diǎn)二側(cè)設(shè)計(jì)引物，使PCR產(chǎn)物含有該突變序列。一種檢測(cè)點(diǎn)突變的技術(shù)，應(yīng)用十分廣泛?，F(xiàn)在位置P185一、PCR—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性是根據(jù)突變序列是否位于限制性158基因組中某個(gè)基因在同種生物的不同個(gè)體中，同時(shí)和經(jīng)常存在的兩種或兩種以上的變異型，以至于用某種限制性核酸內(nèi)切酶消化基因組的某段序列時(shí)，會(huì)呈現(xiàn)不同長(zhǎng)度的消化片段，形成生物群體的多態(tài)性，這種多態(tài)性稱為限制性核酸內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)基因組中某個(gè)基因在同種生物的不同個(gè)體中，同時(shí)和經(jīng)常存在的兩種159EcoRI5’-GAATTC-3’5’-NNNNNNNGAATTCNNNNNN-3’5’-NNNNNNNGAATTCNNNNNN-3’P1P2EcoRI5’-GAATTC-3’5’-NNNNNNNGA1605’-NNNNNNNGAATTCNNNNNN-3’5’-NNNNGAATTCNNN-3’5’-NNNNNNNGTATTCNNNNNN-3’EcoRI5’-NNNNNNNGTATTCNNNNNN-3’EcoRI+_+_5’-NNNNNNNGAATTCNNNNNN-3’5’-NN161RFLP的優(yōu)缺點(diǎn)RFLP用于檢測(cè)點(diǎn)突變可以確定點(diǎn)突變的位置RFLP的優(yōu)缺點(diǎn)RFLP用于檢測(cè)點(diǎn)突變162二、等位基因特異性寡核苷酸Allelespecificoligonucleotide,ASO是用寡核苷酸探針和PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交以檢測(cè)點(diǎn)突變的方法。被檢基因片段經(jīng)PCR擴(kuò)增并經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到膜上，分別與經(jīng)標(biāo)記的含有正常序列和突變序列的寡核苷酸探針雜交。PCR產(chǎn)物僅與完全互補(bǔ)的探針雜交現(xiàn)在位置P185二、等位基因特異性寡核苷酸Allelespecifico163野生型基因DNA突變型基因DNA野生型基因DNA探針突變型基因DNA探針野生型基因DNA突變型基因DNA野生型基因DNA探針突變型基164野生型基因DNA探針突變型基因DNA探針結(jié)論：不存在點(diǎn)突變野生型基因DNA探針突變型基因DNA探針結(jié)論：不存在點(diǎn)突變165野生型基因DNA探針突變型基因DNA探針結(jié)論：存在點(diǎn)突變野生型基因DNA探針突變型基因DNA探針結(jié)論：存在點(diǎn)突變166DNA片段在瓊脂糖凝膠上電泳分離膜上固定DNA片段在緩沖液中將標(biāo)記的探針加到膜上DNA片段從瓊脂糖凝膠上轉(zhuǎn)印到膜上雜交信號(hào)的檢測(cè)DNA片段在瓊脂糖凝膠上電泳分離膜上固定DNA片段在緩沖液中167ASO的優(yōu)缺點(diǎn)用于檢測(cè)點(diǎn)突變由于探針的序列是已知的，可以確定點(diǎn)突變的位置缺點(diǎn)是成本相對(duì)較高，檢測(cè)一個(gè)點(diǎn)突變即需要一對(duì)引物和一對(duì)寡核苷酸探針現(xiàn)在位置P185ASO的優(yōu)缺點(diǎn)用于檢測(cè)點(diǎn)突變現(xiàn)在位置P185168三、單鏈構(gòu)象多態(tài)性單鏈構(gòu)象多態(tài)性（Singlestrandconformationpolymorphism,SSCP）當(dāng)DNA分子以單鏈存在時(shí)，能在空間內(nèi)自發(fā)地形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，這種二級(jí)結(jié)構(gòu)的空間構(gòu)象取決于DNA分子本身的的堿基構(gòu)成，即使一個(gè)堿基的差別也會(huì)形成不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)。SSCP用于檢測(cè)點(diǎn)突變?nèi)秉c(diǎn)：不能確定突變的位置現(xiàn)在位置P186三、單鏈構(gòu)象多態(tài)性單鏈構(gòu)象多態(tài)性（Singlestrand169三、單鏈構(gòu)象多態(tài)性突變DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后產(chǎn)生與正常DNA空間構(gòu)象不同的兩條單鏈。在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中時(shí)，不同構(gòu)象的單鏈片段具有不同的電泳遷移率，從而能區(qū)別正常與突變的DNA。只適合于檢測(cè)200bp以內(nèi)的DNA靶基因片段實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵是控制各種條件以避免在操作過(guò)程中DAN單鏈分子復(fù)性為雙鏈?，F(xiàn)在位置P186三、單鏈構(gòu)象多態(tài)性突變DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后產(chǎn)生與正常D170四、變性梯度凝膠電泳現(xiàn)在位置P186DNA分子的物理特性之一是當(dāng)DNA分子被加熱至其融點(diǎn)溫度時(shí)雙鏈被打開(kāi)。融點(diǎn)溫度取決于DNA分子本身的序列，不同序列的DNA分子具有不同的融點(diǎn)溫度。四、變性梯度凝膠電泳現(xiàn)在位置P186DNA分子的物理特性171變性梯度凝膠電泳技術(shù)正是利用了DNA分子的這一特性。在設(shè)計(jì)引物時(shí)使被擴(kuò)增目的片段的二端含有不同的Tm值，一端較高，另一端相對(duì)較低。將這一PCR產(chǎn)物在由變性劑形成梯度的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，當(dāng)其泳動(dòng)至相應(yīng)位置時(shí)，片段于Tm值較低一端的雙鏈被部分解鏈，如此形成的構(gòu)象至使該片段的電泳遷移率大大降低。現(xiàn)在位置P186變性梯度凝膠電泳技術(shù)正是利用了DNA分子的這一特性?，F(xiàn)在位置172＋－變性劑濃度由低到高Tm值低Tm值高＋－變性劑濃度由低到高Tm值低Tm值高173變性梯度凝膠電泳的優(yōu)缺點(diǎn)變性梯度凝膠電泳技術(shù)用于檢測(cè)點(diǎn)突變?nèi)秉c(diǎn)：不能確定突變的位置現(xiàn)在位置P186變性梯度凝膠電泳的優(yōu)缺點(diǎn)變性梯度凝膠電泳技術(shù)用于檢測(cè)點(diǎn)突變現(xiàn)174Tm值的大小取決于DNA分子的長(zhǎng)度和其序列中的G/C含量雙鏈DNA可以結(jié)合熒光染料（SYBRGre