實(shí)驗(yàn)三菌種保存及細(xì)菌形態(tài)觀察分解課件

菌種保存及細(xì)菌形態(tài)觀察2010.10~2010.1211/17/2022菌種保存及細(xì)菌形態(tài)觀察2010.10~2010.1211實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解簡(jiǎn)單染色法和革蘭氏染色法的原理，掌握具體操作方法2.了解細(xì)菌芽孢染色法的原理，掌握具體操作方法3.學(xué)習(xí)并掌握微生物涂片、染色的基本技術(shù)和無菌操作技術(shù)4.學(xué)習(xí)油鏡的使用方法5.初步認(rèn)識(shí)細(xì)菌的宏觀和個(gè)體特征2實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解簡(jiǎn)單染色法和革蘭氏染色法的原理，掌握具體操作實(shí)驗(yàn)原理微生物培養(yǎng)技術(shù)斜面接種液體培養(yǎng)基接種穿刺接種3實(shí)驗(yàn)原理微生物培養(yǎng)技術(shù)3

形態(tài)觀察主要包括群體的形態(tài)和個(gè)體的形態(tài)觀察。細(xì)菌的基本形態(tài)主要分為球菌、桿菌、螺旋菌三大類，近年還發(fā)現(xiàn)星狀和四方形細(xì)菌等。細(xì)菌形態(tài)受培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基成分、濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等發(fā)生變化。細(xì)菌菌落大多表面光滑濕潤(rùn)，有光澤，一般菌落較小，質(zhì)地顏色均勻，同培養(yǎng)基結(jié)合不緊密。細(xì)菌個(gè)體微小，較透明，必須染色方可呈現(xiàn)。根據(jù)細(xì)菌個(gè)體形態(tài)觀察的不同要求，可將染色分為3種類型：簡(jiǎn)單染色、鑒別染色、特殊染色。1.細(xì)菌4形態(tài)觀察主要包括群體的形態(tài)和個(gè)體的形態(tài)觀察。棒狀桿菌絲狀菌鏈球菌及螺旋菌5棒狀桿菌絲狀菌鏈球菌及螺旋菌5

簡(jiǎn)單染色是利用單一染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色。細(xì)菌在中性、堿性或弱酸性溶液環(huán)境中通常帶負(fù)電荷，堿性染料（解離時(shí)分子的染色部分帶正電荷）如美蘭、結(jié)晶紫等易與細(xì)菌結(jié)合使其著色。2.簡(jiǎn)單染色法原理6簡(jiǎn)單染色是利用單一染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色。細(xì)菌在中性、3.革蘭氏染色法原理

細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶紫染色，再經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，在一定條件下有的細(xì)菌紫色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細(xì)菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌G+），后者為革蘭氏陰性菌（G-）。為觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅等進(jìn)行復(fù)染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。73.革蘭氏染色法原理細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶紫染色，再芽孢壁比營養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜而且致密，透性低，著色和脫色較營養(yǎng)細(xì)胞難。用著色力強(qiáng)的堿性染料在微火上加熱，或延長(zhǎng)染色時(shí)間，使菌體和芽孢同時(shí)染色后，用蒸餾水沖洗，脫去菌體顏色，保留芽孢的顏色。并用另一種對(duì)比鮮明的染料使菌體著色。4.芽孢染色原理8芽孢壁比營養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜而且致密，透性低，5.油鏡觀察油浸物鏡的工作距離很短，一般在O.2mm以內(nèi)，因此使用油浸物鏡時(shí)要特別細(xì)心，避免由于“調(diào)焦”不慎而壓碎標(biāo)本片并使物鏡受損。(1)先用40倍鏡觀察標(biāo)本，找到要觀察的標(biāo)本結(jié)構(gòu)放入視野中央，然后用粗調(diào)旋鈕下降載物臺(tái)約2cm，并將高倍鏡轉(zhuǎn)出。(2)在玻片標(biāo)本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。(3)從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺(tái)緩緩地上升，使油浸物鏡浸入香柏油中，使鏡頭幾乎與標(biāo)本接觸。(4)目鏡觀察，放大視場(chǎng)光闌及虹彩光圈，使光線充分照明。用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺(tái)徐徐下降，當(dāng)出現(xiàn)物像一閃后改用細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)至最清晰為止。如油鏡已離開油面而仍未見到物像，必須再從側(cè)面觀察，重復(fù)上述操作。(5)觀察完畢，下降載物臺(tái)，將油鏡頭轉(zhuǎn)出，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，再用擦鏡紙蘸少許乙醚乙醇體積2：3的混合液，擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦拭2-3下即可(注意朝一個(gè)方向擦拭)。95.油鏡觀察油浸物鏡的工作距離很短，一般在O.2試劑與器材1、材料金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、四聯(lián)球菌、枯草芽孢桿菌（培養(yǎng)12h-18h）、酵母菌2、試劑呂氏堿性美藍(lán)染液（或草酸銨結(jié)晶紫染液）、齊氏石炭酸復(fù)紅染液、革蘭氏染色液（結(jié)晶紫液、碘液、95％乙醇、番紅液）、5％孔雀綠水溶液、0.5％番紅水溶液3、器材顯微鏡、酒精燈、載玻片、蓋玻片、雙層瓶（內(nèi)裝香柏油及二甲苯）、擦鏡紙、生理鹽水、濾紙等。10試劑與器材1、材料10實(shí)驗(yàn)內(nèi)容一.菌種保存二.簡(jiǎn)單染色法三.革蘭氏染色法四.芽孢染色法11實(shí)驗(yàn)內(nèi)容一.菌種保存11菌種保存a.斜面接種：由已長(zhǎng)好微生物的斜面中挑取少量菌種接種至另一空白斜面培養(yǎng)基上。配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基每班配制500ml，每組分裝2支試管，擺斜面。1.接種前用記號(hào)筆在距試管口2－3cm位置上，注明菌名、接種日期等。2.將試管放于手掌中，并用手指夾住，使兩支試管呈“V”字形。3.用火焰將接種環(huán)燒紅，然后將接種環(huán)來回通過火焰數(shù)次。4.用小指、無名指和手掌拔下試管塞，并持于手中。5.將試管口在火焰上微燒一周。6.將燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先將環(huán)接觸一下沒有長(zhǎng)菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燙死菌體，然后用環(huán)在菌苔上輕輕地接觸，刮下少許培養(yǎng)物，并將接種環(huán)慢慢的從試管中抽出，并迅速地伸入另一試管中，在斜面上劃線（波浪或直線），使菌體沾附在培養(yǎng)基上。7.將接種環(huán)抽出，灼燒管口。8.塞上棉塞。9.將接種環(huán)經(jīng)火焰灼燒滅菌。12菌種保存a.斜面接種：由已長(zhǎng)好微生物的斜面中挑取少量菌種接種b.液體培養(yǎng)基接種配制馬丁氏培養(yǎng)基，每班配制1000ml，每組分裝至50ml錐形瓶中（約25ml）1支，包扎，滅菌。需準(zhǔn)備以下物品：移液管1支接種操作：吸取酵母菌液0.5ml加入至培養(yǎng)基中，緩慢搖勻，包扎，搖床培養(yǎng)，下次試驗(yàn)使用。13b.液體培養(yǎng)基接種13細(xì)菌形態(tài)觀察14細(xì)菌形態(tài)觀察14一、簡(jiǎn)單染色實(shí)驗(yàn)步驟1、涂片—金黃色葡萄球菌2、干燥：室溫自然干燥3、固定：通過火焰2－3次，細(xì)胞質(zhì)凝固4、染色：滴加染液5、沖洗：水洗至無色6、干燥：自然，吹干，吸干7、鏡檢.

15一、簡(jiǎn)單染色實(shí)驗(yàn)步驟1、涂片—金黃色葡萄球菌15二、革蘭氏染色法1.制片：取菌種培養(yǎng)液（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌）常規(guī)涂片，干燥，固定（涂片不宜過厚；火焰固定不宜過熱）2.初染：滴加結(jié)晶紫，染色1－2min，水洗3.媒染：用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1min，水洗4.乙醇脫色：濾紙吸去殘水，傾斜玻片用95％乙醇洗滌脫色至無色，立即水洗（20s－30s）5.復(fù)染：番紅液復(fù)染約2min，水洗6.鏡檢：革蘭氏陽性菌（藍(lán)紫色），革蘭氏陰性菌（紅色）16二、革蘭氏染色法1.制片：取菌種培養(yǎng)液（大腸桿菌、金黃色葡萄染色顯示革蘭氏陽性陰性細(xì)菌17染色顯示革蘭氏陽性陰性細(xì)菌17三、芽孢染色1.制片：挑取菌（枯草桿菌）做常規(guī)涂片、干燥、固定2.染色：加數(shù)滴孔雀綠染液于涂片上，用木夾夾住載玻片一端，在微火上加熱至染料冒蒸汽開始計(jì)時(shí)，維持5min（加熱過程中要及時(shí)補(bǔ)染液，切勿干涸）3.流水沖洗：待玻片冷卻后，洗至無色4.番紅復(fù)染：2min5.水洗：緩流水洗后，吸干6.鏡檢：芽孢綠色，芽孢囊及營養(yǎng)體為紅色。18三、芽孢染色1.制片：挑取菌（枯草桿菌）做常規(guī)涂片、干燥、固實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪圖表示你觀察到的芽孢桿菌的芽孢形狀、大小、著生位置上有什么不同？19實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪圖表示你觀察到的芽孢桿菌的芽孢形狀、大小、著生位置革蘭氏陰性菌革蘭氏陽性菌20革蘭氏陰性菌革蘭氏陽性菌20綠色的為芽孢圖中綠色的為芽孢21綠色的為芽孢圖中綠色的為芽孢21注意事項(xiàng)1.涂片時(shí)水滴不要過大，菌體最好涂成一個(gè)薄膜，而且均勻。2.干燥是室溫自然干燥。3.固定是通過火焰2－3次，不可以加熱過久。4.染色時(shí)滴加染液覆蓋上菌體薄膜即可。5.沖洗是水洗至無色，要注意水流是有一個(gè)角度，從載片的一端自然流到另一端，但是水流要通過染色過的菌體薄膜。水流不宜過大，防止將菌體沖走。6.鏡檢時(shí)，油鏡與普通的物鏡要嚴(yán)格的按照操作規(guī)程執(zhí)行。7.在染色過程中，不可使染液干涸。8.脫色時(shí)間十分重要，過長(zhǎng)，則脫色過度，會(huì)使陽性菌被染成陰性菌；脫色不夠，則會(huì)使陰性菌被染成陽性菌。9.老齡菌因體內(nèi)核酸減少，會(huì)便陽性菌被染成陰性菌，故不能選用。22注意事項(xiàng)1.涂片時(shí)水滴不要過大，菌體最好涂成一個(gè)薄膜，而且均思考題1.你認(rèn)為制備細(xì)菌標(biāo)本時(shí)尤其應(yīng)該注意哪些環(huán)節(jié)？2.為什么要求制片要完全干燥后才能用油鏡觀察？3.說明油鏡觀察標(biāo)本的原理及過程。4.如果你的涂片未經(jīng)過熱固定，將會(huì)出現(xiàn)什么問題？如果加熱溫度過高、時(shí)間太長(zhǎng)，又會(huì)出現(xiàn)什么結(jié)果？5.涂片后為什么要進(jìn)行固定?固定時(shí)應(yīng)注意什么?6.什么是革蘭氏染色法?染色過程應(yīng)注意什么?7.試分析革蘭氏染色法在細(xì)菌分類中的意義。8.為什么在孔雀綠染色液加熱染色中，要待玻片冷卻后才能用水沖洗？9.分析革蘭氏染色中造成假陽性和假陰性的原因有哪些？23思考題1.你認(rèn)為制備細(xì)菌標(biāo)本時(shí)尤其應(yīng)該注意哪些環(huán)節(jié)？23菌種保存及細(xì)菌形態(tài)觀察2010.10~2010.1211/17/2022菌種保存及細(xì)菌形態(tài)觀察2010.10~2010.1211實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解簡(jiǎn)單染色法和革蘭氏染色法的原理，掌握具體操作方法2.了解細(xì)菌芽孢染色法的原理，掌握具體操作方法3.學(xué)習(xí)并掌握微生物涂片、染色的基本技術(shù)和無菌操作技術(shù)4.學(xué)習(xí)油鏡的使用方法5.初步認(rèn)識(shí)細(xì)菌的宏觀和個(gè)體特征25實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解簡(jiǎn)單染色法和革蘭氏染色法的原理，掌握具體操作實(shí)驗(yàn)原理微生物培養(yǎng)技術(shù)斜面接種液體培養(yǎng)基接種穿刺接種26實(shí)驗(yàn)原理微生物培養(yǎng)技術(shù)3

形態(tài)觀察主要包括群體的形態(tài)和個(gè)體的形態(tài)觀察。細(xì)菌的基本形態(tài)主要分為球菌、桿菌、螺旋菌三大類，近年還發(fā)現(xiàn)星狀和四方形細(xì)菌等。細(xì)菌形態(tài)受培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基成分、濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等發(fā)生變化。細(xì)菌菌落大多表面光滑濕潤(rùn)，有光澤，一般菌落較小，質(zhì)地顏色均勻，同培養(yǎng)基結(jié)合不緊密。細(xì)菌個(gè)體微小，較透明，必須染色方可呈現(xiàn)。根據(jù)細(xì)菌個(gè)體形態(tài)觀察的不同要求，可將染色分為3種類型：簡(jiǎn)單染色、鑒別染色、特殊染色。1.細(xì)菌27形態(tài)觀察主要包括群體的形態(tài)和個(gè)體的形態(tài)觀察。棒狀桿菌絲狀菌鏈球菌及螺旋菌28棒狀桿菌絲狀菌鏈球菌及螺旋菌5

簡(jiǎn)單染色是利用單一染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色。細(xì)菌在中性、堿性或弱酸性溶液環(huán)境中通常帶負(fù)電荷，堿性染料（解離時(shí)分子的染色部分帶正電荷）如美蘭、結(jié)晶紫等易與細(xì)菌結(jié)合使其著色。2.簡(jiǎn)單染色法原理29簡(jiǎn)單染色是利用單一染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色。細(xì)菌在中性、3.革蘭氏染色法原理

細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶紫染色，再經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，在一定條件下有的細(xì)菌紫色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細(xì)菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌G+），后者為革蘭氏陰性菌（G-）。為觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅等進(jìn)行復(fù)染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。303.革蘭氏染色法原理細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶紫染色，再芽孢壁比營養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜而且致密，透性低，著色和脫色較營養(yǎng)細(xì)胞難。用著色力強(qiáng)的堿性染料在微火上加熱，或延長(zhǎng)染色時(shí)間，使菌體和芽孢同時(shí)染色后，用蒸餾水沖洗，脫去菌體顏色，保留芽孢的顏色。并用另一種對(duì)比鮮明的染料使菌體著色。4.芽孢染色原理31芽孢壁比營養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜而且致密，透性低，5.油鏡觀察油浸物鏡的工作距離很短，一般在O.2mm以內(nèi)，因此使用油浸物鏡時(shí)要特別細(xì)心，避免由于“調(diào)焦”不慎而壓碎標(biāo)本片并使物鏡受損。(1)先用40倍鏡觀察標(biāo)本，找到要觀察的標(biāo)本結(jié)構(gòu)放入視野中央，然后用粗調(diào)旋鈕下降載物臺(tái)約2cm，并將高倍鏡轉(zhuǎn)出。(2)在玻片標(biāo)本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。(3)從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺(tái)緩緩地上升，使油浸物鏡浸入香柏油中，使鏡頭幾乎與標(biāo)本接觸。(4)目鏡觀察，放大視場(chǎng)光闌及虹彩光圈，使光線充分照明。用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺(tái)徐徐下降，當(dāng)出現(xiàn)物像一閃后改用細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)至最清晰為止。如油鏡已離開油面而仍未見到物像，必須再從側(cè)面觀察，重復(fù)上述操作。(5)觀察完畢，下降載物臺(tái)，將油鏡頭轉(zhuǎn)出，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，再用擦鏡紙蘸少許乙醚乙醇體積2：3的混合液，擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦拭2-3下即可(注意朝一個(gè)方向擦拭)。325.油鏡觀察油浸物鏡的工作距離很短，一般在O.2試劑與器材1、材料金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、四聯(lián)球菌、枯草芽孢桿菌（培養(yǎng)12h-18h）、酵母菌2、試劑呂氏堿性美藍(lán)染液（或草酸銨結(jié)晶紫染液）、齊氏石炭酸復(fù)紅染液、革蘭氏染色液（結(jié)晶紫液、碘液、95％乙醇、番紅液）、5％孔雀綠水溶液、0.5％番紅水溶液3、器材顯微鏡、酒精燈、載玻片、蓋玻片、雙層瓶（內(nèi)裝香柏油及二甲苯）、擦鏡紙、生理鹽水、濾紙等。33試劑與器材1、材料10實(shí)驗(yàn)內(nèi)容一.菌種保存二.簡(jiǎn)單染色法三.革蘭氏染色法四.芽孢染色法34實(shí)驗(yàn)內(nèi)容一.菌種保存11菌種保存a.斜面接種：由已長(zhǎng)好微生物的斜面中挑取少量菌種接種至另一空白斜面培養(yǎng)基上。配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基每班配制500ml，每組分裝2支試管，擺斜面。1.接種前用記號(hào)筆在距試管口2－3cm位置上，注明菌名、接種日期等。2.將試管放于手掌中，并用手指夾住，使兩支試管呈“V”字形。3.用火焰將接種環(huán)燒紅，然后將接種環(huán)來回通過火焰數(shù)次。4.用小指、無名指和手掌拔下試管塞，并持于手中。5.將試管口在火焰上微燒一周。6.將燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先將環(huán)接觸一下沒有長(zhǎng)菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燙死菌體，然后用環(huán)在菌苔上輕輕地接觸，刮下少許培養(yǎng)物，并將接種環(huán)慢慢的從試管中抽出，并迅速地伸入另一試管中，在斜面上劃線（波浪或直線），使菌體沾附在培養(yǎng)基上。7.將接種環(huán)抽出，灼燒管口。8.塞上棉塞。9.將接種環(huán)經(jīng)火焰灼燒滅菌。35菌種保存a.斜面接種：由已長(zhǎng)好微生物的斜面中挑取少量菌種接種b.液體培養(yǎng)基接種配制馬丁氏培養(yǎng)基，每班配制1000ml，每組分裝至50ml錐形瓶中（約25ml）1支，包扎，滅菌。需準(zhǔn)備以下物品：移液管1支接種操作：吸取酵母菌液0.5ml加入至培養(yǎng)基中，緩慢搖勻，包扎，搖床培養(yǎng)，下次試驗(yàn)使用。36b.液體培養(yǎng)基接種13細(xì)菌形態(tài)觀察37細(xì)菌形態(tài)觀察14一、簡(jiǎn)單染色實(shí)驗(yàn)步驟1、涂片—金黃色葡萄球菌2、干燥：室溫自然干燥3、固定：通過火焰2－3次，細(xì)胞質(zhì)凝固4、染色：滴加染液5、沖洗：水洗至無色6、干燥：自然，吹干，吸干7、鏡檢.

38一、簡(jiǎn)單染色實(shí)驗(yàn)步驟1、涂片—金黃色葡萄球菌15二、革蘭氏染色法1.制片：取菌種培養(yǎng)液（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌）常規(guī)涂片，干燥，固定（涂片不宜過厚；火焰固定不宜過熱）2.初染：滴加結(jié)晶紫，染色1－2min，水洗3.媒染：用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1min，水洗4.乙醇脫色：濾紙吸去殘水，傾斜玻片用95％乙醇洗滌脫色至無色，立即水洗（20s－30s）5.復(fù)染：番紅液復(fù)染約2min，水洗6.鏡檢：革蘭氏陽性菌（藍(lán)紫色），革蘭氏陰性菌（紅色）39二、革蘭氏染色法1.制片：取菌種培養(yǎng)液（大腸桿菌、金黃色葡萄染色顯示革蘭氏陽性陰性細(xì)菌40染色顯示革蘭氏陽性陰性細(xì)菌17三、芽孢染色1.制片：挑取菌（枯草桿菌）做常規(guī)涂片、干燥、固定2.染色：加數(shù)滴孔雀綠染液于涂片上，用木夾夾住載玻片一端，在微火上加熱至染料冒蒸汽開始計(jì)時(shí)，維持5min（加熱過程中要及時(shí)補(bǔ)染液，切勿干涸）3.流水沖洗：待玻片冷卻后，洗至無色4.番紅復(fù)染：2min5.水洗：緩流水洗后，吸干6.鏡檢：芽孢綠色，芽孢囊及營養(yǎng)體為紅色。41三、芽孢染色1.制片：挑取菌（枯草桿菌）做常規(guī)涂片、干燥、固實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪圖表