聚合酶鏈式反應

關于聚合酶鏈式反應第1頁，共27頁，2022年，5月20日，21點0分，星期五一、PCR的定義在引物指導下由酶催化的對特定克隆或基因組DNA序列進行的體外擴增反應。第2頁，共27頁，2022年，5月20日，21點0分，星期五PCR技術的創(chuàng)建Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設想。

1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術,使Khorana的設想得到實現(xiàn)。

1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術

1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項重大科學發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎。第3頁，共27頁，2022年，5月20日，21點0分，星期五KaryB.Mullis（1944－）第4頁，共27頁，2022年，5月20日，21點0分，星期五二、PCR技術的優(yōu)點特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴增至十萬乃至百萬倍第5頁，共27頁，2022年，5月20日，21點0分，星期五三、PCR原理Sample1.denaturatation2.Primerannealing3.PrimerextensionRegiontobecopied第6頁，共27頁，2022年，5月20日，21點0分，星期五PCR技術原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。模板DNA變性：加熱至94℃左右，雙鏈DNA解離成單鏈；模板DNA與引物的退火(復性)：55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；引物的延伸：在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP為原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的雙鏈；重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，使DNA擴增量呈指數(shù)上升。第7頁，共27頁，2022年，5月20日，21點0分，星期五

PCR的基本反應步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C第8頁，共27頁，2022年，5月20日，21點0分，星期五1234522557294時間（min）溫度（℃）PCR的基本原理適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍第9頁，共27頁，2022年，5月20日，21點0分，星期五PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃第10頁，共27頁，2022年，5月20日，21點0分，星期五PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃引物1引物2DNA引物第11頁，共27頁，2022年，5月20日，21點0分，星期五PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶第12頁，共27頁，2022年，5月20日，21點0分，星期五PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結束95℃第2輪開始第13頁，共27頁，2022年，5月20日，21點0分，星期五PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq第14頁，共27頁，2022年，5月20日，21點0分，星期五PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結束第15頁，共27頁，2022年，5月20日，21點0分，星期五PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增第16頁，共27頁，2022年，5月20日，21點0分，星期五PCRproduct第17頁，共27頁，2022年，5月20日，21點0分，星期五TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon第18頁，共27頁，2022年，5月20日，21點0分，星期五PCR儀第19頁，共27頁，2022年，5月20日，21點0分，星期五四、PCR的標準反應體系10×擴增緩沖液10μl

4種dNTP混合物各200μmol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2μg

TaqDNA聚合酶2.5ul

（Mg2+）1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ulHome第20頁，共27頁，2022年，5月20日，21點0分，星期五五、PCR反應五要素引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）第21頁，共27頁，2022年，5月20日，21點0分，星期五六、PCR的類型及應用1、PCR的類型反轉(zhuǎn)錄PCR技術：RNA的反轉(zhuǎn)錄與PCR的聯(lián)合應用原位PCR技術：在細胞內(nèi)進行，不需要提取DNA實時PCR技術：進行DNA的定量分析筑巢PCR彩色PCR多重PCR不對稱PCR共享引物PCR差異顯示PCR錨定PCR重組PCR第22頁，共27頁，2022年，5月20日，21點0分，星期五2、PCR的應用研究

-基因克隆、測序、分析突變診斷

-細菌、病毒、寄生蟲檢測、診斷人類基因組工程

-遺傳圖譜的構建、測序、表達圖譜法醫(yī)

-犯罪現(xiàn)場標本分析腫瘤檢測其他……第23頁，共27頁，2022年，5月20日，21點0分，星期五法醫(yī)學個人識別、親子鑒定1985年，英國遺傳學家Jeffreys采用DNA指紋圖譜進行個人識別和親子鑒定。有時犯罪物證量很少，不足以用來進行DNA指紋分析，PCR有效解決這些問題。對于犯罪現(xiàn)場中遺留的少量生物物證，如一根毛發(fā)、一滴血等都可用于分析，在法醫(yī)學上認證罪犯、親子鑒定以及人的性別鑒定中PCR技術被普遍采用。第24頁，共27頁，2022年，5月20日，21點0分，星期五什么是“DNA指紋技術”？世界上除同卵雙生外，幾乎沒有指紋一模一樣的兩個人，所以指紋可以用來鑒別身份。研究表明，每個人的DNA都不完全相同，因此