細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講 體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件

第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)2022/11/182022/11/11培養(yǎng)物的冷凍與復(fù)蘇體外細(xì)胞培養(yǎng)條件和基本技術(shù)體外細(xì)胞培養(yǎng)體外培養(yǎng)物的生長生物學(xué)培養(yǎng)物的污染、檢測(cè)和排除

細(xì)胞系和細(xì)胞株培養(yǎng)物的冷凍與復(fù)蘇體外細(xì)胞培養(yǎng)條件和基本技術(shù)體外細(xì)胞培養(yǎng)體外體外細(xì)胞培養(yǎng)條件

與基本技術(shù)體外細(xì)胞培養(yǎng)條件

與基本技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件體外細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：

簡(jiǎn)化細(xì)胞的生長環(huán)境方便施加實(shí)驗(yàn)因素便于觀測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果便于獲得均一細(xì)胞群能夠進(jìn)行大規(guī)模生物制品的生產(chǎn)體外細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：體外細(xì)胞培養(yǎng)不足之處：

培養(yǎng)對(duì)象脫離了機(jī)體的整體支配和調(diào)控，細(xì)胞間在一定程度上失去組織聯(lián)系及相互作用。

體外培養(yǎng)條件下的生長發(fā)育情況與在體時(shí)的情況存在一定差異，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)必須考慮這種差異。體內(nèi)體外研究技術(shù)的結(jié)合。體外細(xì)胞培養(yǎng)不足之處：培養(yǎng)對(duì)象脫離了機(jī)體外細(xì)胞培養(yǎng)條件體外細(xì)胞培養(yǎng)條件2022/11/18

實(shí)驗(yàn)人員的無菌準(zhǔn)備肥皂洗手；穿好隔離衣、戴好隔離帽、口罩、穿好拖鞋；戴乳膠手套、75%酒精擦手套。2022/11/11實(shí)驗(yàn)人員的無菌準(zhǔn)備一、體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室

1.準(zhǔn)備室

2.培養(yǎng)室

3.緩沖室

4.其他實(shí)驗(yàn)室基本條件要求：清潔、無菌、干燥、不通風(fēng)，并具有適宜的光線?？諝庹{(diào)節(jié)用中央空調(diào)或分體式空調(diào)機(jī)。室頂安裝紫外燈等消毒裝置。一、體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室1.準(zhǔn)備室基本條件要求：清潔、2022/11/182022/11/112022/11/182022/11/11細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件2022/11/18二、體外培養(yǎng)的設(shè)備和器具1.超靜工作臺(tái)

生物安全柜

凈化室（一）設(shè)備2022/11/11二、體外培養(yǎng)的設(shè)備和器具1.超靜工作臺(tái)2022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/18XV2022/11/11XV2022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112.培養(yǎng)箱溫度濕度pH值2.培養(yǎng)箱溫度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件2022/11/182022/11/113.倒置顯微鏡3.倒置顯微鏡4.水凈化裝置去離子水凈化裝置4.水凈化裝置去離子水凈化裝置石英玻璃蒸餾器石英玻璃蒸餾器超純水裝置超純水裝置5.冰箱5.冰箱6.離心機(jī)6.離心機(jī)2022/11/187.冷凍保存裝置2022/11/117.冷凍保存裝置2022/11/182022/11/11細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件8.高壓蒸汽消毒裝置8.高壓蒸汽消毒裝置電熱干燥箱pH計(jì)天平電熱干燥箱（二）培養(yǎng)器具1.過濾除菌裝置Zeiss濾器抽濾式玻璃簡(jiǎn)易型濾器針頭式加壓塑料小濾器（二）培養(yǎng)器具1.過濾除菌裝置Zeiss濾器細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件2.培養(yǎng)器皿

（1）溶液瓶（2）

培養(yǎng)瓶（3）

培養(yǎng)皿（4）

多孔培養(yǎng)板（5）

離心管2.培養(yǎng)器皿（1）溶液瓶細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件3.移液器3.移液器4.篩網(wǎng)金屬篩網(wǎng)（不銹鋼網(wǎng)、銅網(wǎng)）尼龍篩網(wǎng)4.篩網(wǎng)金屬篩網(wǎng)（三）培養(yǎng)用液水和平衡鹽溶液（balancedsaltsolution,BSS)培養(yǎng)液：

天然培養(yǎng)液合成培養(yǎng)液無血清培養(yǎng)基其他用液：

消化液等（三）培養(yǎng)用液水和平衡鹽溶液（balancedsalts水：離子交換水蒸餾水平衡鹽溶液主要成分：無機(jī)鹽和葡萄糖常用BSS:PBSRingerEarleD-HanksHanks水：離子交換水平衡鹽溶液主要成分：無機(jī)鹽和葡萄糖天然培養(yǎng)基血清：小牛血清,胎牛血清（fetalbovineserum,FBS）,馬血清水解乳蛋白胚胎滲出液天然培養(yǎng)基血清：合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基的種類：MEMRPMI1640McCoy5AHAMF12

等合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基的種類：干粉型培養(yǎng)基的配制：

1.制備高質(zhì)量的去離子水(玻璃三蒸餾水)或超純水2.加溫水至15-30℃之間

3.加干粉入水中，攪拌令之溶解

4.加NaHCO35.加水至最終量

6.必要時(shí)用1NHCl或1NNaOH調(diào)節(jié)pH，因?yàn)V過時(shí)pH可能受影響

7.用0.22um或小于此微孔濾膜濾過消毒干粉型培養(yǎng)基的配制：1.制備高質(zhì)量的去離子水(玻璃三蒸餾常用的生長培養(yǎng)液基本培養(yǎng)基80-90％血清(多用小牛血清)10-20％抗生素(多用青霉素100單位／毫升和鏈霉素100微克／毫升)

常用的生長培養(yǎng)液基本培養(yǎng)基80-90其他常用液消化液：胰蛋白酶、EDTA溶液pH調(diào)整液：

NaHCO3溶液、HEPES溶液抗生素液：青鏈霉素其他常用液消化液：細(xì)胞體外培養(yǎng)的其它條件細(xì)胞體外培養(yǎng)的其它條件一、無污染的氣、液相環(huán)境1、O2

5%CO2+95%空氣O2:21%一、無污染的氣、液相環(huán)境1、O22、CO2-pHNaHCO3+H2ONa++OH-+H2CO3Na++OH-+H2O+CO2Hepes2、CO2-pHNaHCO3+H2O3、液相環(huán)境-滲透壓3、液相環(huán)境-滲透壓二、溫度二、溫度三、生長基質(zhì)1、多聚賴氨酸

0.05mg/ml2、纖維連接蛋白

1mg/ml3、膠原

1~3mg/ml4、層粘連蛋白

5~10g/ml三、生長基質(zhì)1、多聚賴氨酸2022/11/182022/11/11清洗和消毒清洗和消毒2022/11/182022/11/11玻璃器皿的清洗浸泡刷洗酸浸沖洗玻璃器皿的清洗浸泡浸酸液強(qiáng)液：63克重鉻酸鉀

1000毫升濃硫酸

200毫升蒸餾水次強(qiáng)液：120克重鉻酸鉀

200毫升濃硫酸

1000毫升蒸餾水弱液：100克重鉻酸鉀

100毫升濃硫酸

1000毫升蒸餾水浸酸液強(qiáng)液：63克重鉻酸鉀膠塞清洗膠塞入水中浸泡2％Na0H煮沸10-20分鐘自來水沖洗1％稀鹽酸浸泡30分鐘自來水沖洗和蒸餾水漂洗2-3次晾干備用膠塞清洗膠塞入水中浸泡塑料器皿的清洗塑料器皿的清洗消毒：紫外線干熱消毒濕熱消毒濾過消毒射線消毒消毒劑的使用包裝：局部包裝全包裝消毒：紫外線包裝：局部包裝體外細(xì)胞培養(yǎng)體外細(xì)胞培養(yǎng)體外細(xì)胞培養(yǎng)類型：原代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)

體外細(xì)胞培養(yǎng)類型：動(dòng)物器官或大組織塊洗去血污剔除多余成分１mm3的植塊組織剪碎植塊培養(yǎng)蛋白酶消化機(jī)械吹打銅網(wǎng)過濾離心細(xì)胞懸液調(diào)整細(xì)胞數(shù)分離細(xì)胞培養(yǎng)一.基本流程：原代培養(yǎng)動(dòng)物器官或大組織塊一.基本流程：原代培養(yǎng)二、實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)（一）常用實(shí)驗(yàn)材料的取材：

胚胎、組織、人體手術(shù)或活檢材料二、實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)（一）常用實(shí)驗(yàn)材料的取材：（二）分散細(xì)胞的方法１.機(jī)械解離細(xì)胞法

吸管吹打法過篩法單細(xì)胞分離器

（二）分散細(xì)胞的方法１.機(jī)械解離細(xì)胞法2022/11/182022/11/11細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件２.蛋白酶學(xué)處理法胰蛋白酶膠原酶２.蛋白酶學(xué)處理法2022/11/182022/11/112022/11/182022/11/11３.螯合劑解離細(xì)胞法

EDTA檸檬酸鈉３.螯合劑解離細(xì)胞法2022/11/182022/11/11（三）接種和培養(yǎng)過程１.植塊培養(yǎng)

接種與培養(yǎng)：

優(yōu)點(diǎn)：比較簡(jiǎn)單，保留了在體時(shí)細(xì)胞間的相互作用，因而在體外培養(yǎng)時(shí)，植塊內(nèi)細(xì)胞容易存活和生長。（三）接種和培養(yǎng)過程１.植塊培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件２.分散細(xì)胞培養(yǎng)操作過程:優(yōu)點(diǎn)：解除了植塊內(nèi)部細(xì)胞間的組織關(guān)系，從而可以反映出單個(gè)細(xì)胞的生物學(xué)特征。可實(shí)現(xiàn)對(duì)單一細(xì)胞類型進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)研究。２.分散細(xì)胞培養(yǎng)操作過程:2022/11/182022/11/11（四）討論和注意事項(xiàng)相對(duì)于植塊內(nèi)的細(xì)胞，分離散細(xì)胞在體外更難以存活和生長。對(duì)于大多數(shù)貼壁依賴型細(xì)胞來說，如何盡快讓接種的細(xì)胞貼壁，是決定培養(yǎng)物生長快慢的關(guān)鍵步驟?？蛇x用生長基質(zhì)表面；降低浮力。細(xì)胞密度：105個(gè)/ml左右，對(duì)大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞是比較適中的。（四）討論和注意事項(xiàng)相對(duì)于植塊內(nèi)的細(xì)胞，分離散細(xì)胞在體外更難三、原代細(xì)胞培養(yǎng)的注意事項(xiàng)1、培養(yǎng)液培養(yǎng)基的選擇添加劑培養(yǎng)液的酸堿度換液2、培養(yǎng)的空間通常培養(yǎng)液與液面上空間的體積比以1:10為宜。三、原代細(xì)胞培養(yǎng)的注意事項(xiàng)1、培養(yǎng)液一、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)1、植塊培養(yǎng)2、分離細(xì)胞培養(yǎng)物3、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物繼代培養(yǎng)一、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)1、植塊培養(yǎng)繼代培養(yǎng)二、傳代的過程1、主要材料：（1）蛋白酶消化液（2）培養(yǎng)器皿（3）培養(yǎng)液及平衡鹽溶液2、方法：

二、傳代的過程1、主要材料：（1）貼壁生長細(xì)胞培養(yǎng)物的傳代吸去舊培養(yǎng)液

PBS或D-Hanks洗酶消化解離細(xì)胞終止消化吹打培養(yǎng)器皿底部收集細(xì)胞、洗滌、調(diào)整細(xì)胞數(shù)接種（1）貼壁生長細(xì)胞培養(yǎng)物的傳代2022/11/182022/11/11（2）懸浮培養(yǎng)物的傳代培養(yǎng)物移入離心管離心、去上清培養(yǎng)液重懸接種培養(yǎng)皿補(bǔ)加培養(yǎng)液（2）懸浮培養(yǎng)物的傳代培養(yǎng)物移入離心管三、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)1、傳代的時(shí)機(jī)與再培養(yǎng)的細(xì)胞密度2、傳代數(shù)與培養(yǎng)物的生長三、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)1、傳代的時(shí)機(jī)與再培養(yǎng)的細(xì)胞密度體外培養(yǎng)物的生長生物學(xué)體外培養(yǎng)物的生長生物學(xué)原代培養(yǎng)期：細(xì)胞性狀與體內(nèi)原組織相似性大，異質(zhì)性。傳代培養(yǎng)期：細(xì)胞增殖旺盛（潛伏期、指數(shù)生長期、停滯期），逐漸趨向同質(zhì)化，正常細(xì)胞約可傳30-50代，應(yīng)及早凍存。衰退期：細(xì)胞增殖減慢，直至死亡。一、培養(yǎng)細(xì)胞的生長與增殖原代培養(yǎng)期：一、培養(yǎng)細(xì)胞的生長與增殖2022/11/182022/11/112022/11/18對(duì)數(shù)生長期2022/11/11對(duì)數(shù)生長期2022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/11二、體外細(xì)胞培養(yǎng)物的生長類型貼壁細(xì)胞懸浮細(xì)胞二、體外細(xì)胞培養(yǎng)物的生長類型貼壁細(xì)胞多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長，屬貼壁依賴性細(xì)胞。體內(nèi)：粘附全方位，外形具有復(fù)雜的立體特征。

體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個(gè)附著平面，外形一般與體內(nèi)時(shí)明顯不同。黏附型細(xì)胞多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長，屬貼壁依賴性細(xì)胞。黏附型細(xì)胞成纖維細(xì)胞型

梭形、長條形或不規(guī)則多角形，胞體一般鋪展很開，成群細(xì)胞呈現(xiàn)放射狀、旋渦狀等走行形式。起源于中胚層的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)一般表現(xiàn)為此型，如成纖維細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、骨與軟骨細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞等。成纖維細(xì)胞型上皮細(xì)胞型扁平、多角形，細(xì)胞間相互銜接或呈鑲嵌狀緊密排列，呈“鋪路石樣”，形成單層膜。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)可能呈現(xiàn)此型，如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等。上皮細(xì)胞型游走細(xì)胞型細(xì)胞相互分散，一般不形成集落；在器皿壁上生長位置不固定，經(jīng)常處于較活躍的變形和游走狀態(tài)，因此外形不規(guī)則且不斷變化。主要是具有吞噬作用的單核巨噬細(xì)胞細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞，如顆粒性白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及某些腫瘤細(xì)胞。游走細(xì)胞型多形細(xì)胞型形態(tài)不規(guī)則，一般分為胞體和胞突兩部分。胞突為細(xì)長形，似絲狀偽足。胞體雖略呈多角形。主要是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞多形細(xì)胞型2022/11/182022/11/11懸浮型細(xì)胞細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)不粘附于支持物上，而是呈懸浮生長狀態(tài)，如某些癌細(xì)胞和血液白細(xì)胞。

細(xì)胞懸浮生長時(shí)胞體為圓形。適于大量繁殖。

懸浮型細(xì)胞細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)不粘附于支持物上，而是呈懸浮生長狀態(tài)，三、培養(yǎng)細(xì)胞的生長狀況觀察（一）常規(guī)觀察

培養(yǎng)液：顏色、透明度等細(xì)胞生長概況及形態(tài)變化：細(xì)胞輪廓、折光性、胞內(nèi)顆粒等微生物污染狀況：三、培養(yǎng)細(xì)胞的生長狀況觀察（一）常規(guī)觀察培養(yǎng)液：顏色、透明度（二）細(xì)胞生長狀況觀察1.細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀細(xì)胞計(jì)數(shù)板制備細(xì)胞懸液，稀釋成合適的濃度；加至細(xì)胞計(jì)數(shù)板中央凹槽處，顯微鏡下計(jì)算四角大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)；按照公式計(jì)算懸液中細(xì)胞密度。（二）細(xì)胞生長狀況觀察2022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/11計(jì)左不計(jì)右，計(jì)上不計(jì)下。每一大方格長、寬各1mm，深度0.1mm，體積0.1mm3

，即1×10－4ml。細(xì)胞密度＝4大格中細(xì)胞總數(shù)4×104

（個(gè)/ml）計(jì)左不計(jì)右，計(jì)上不計(jì)下。每一大方格長、寬各1mm，深度0.12022/11/182022/11/112.細(xì)胞生長曲線細(xì)胞生長曲線是衡量細(xì)胞增殖快慢的重要指標(biāo)。細(xì)胞計(jì)數(shù)法MTT（CCK-8）法2.細(xì)胞生長曲線潛伏期：細(xì)胞有生長話動(dòng)而無細(xì)胞分裂。潛伏期一般為6～24小時(shí)。對(duì)數(shù)生長期：細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間成倍增長，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。停止期（平臺(tái)期）：細(xì)胞長滿瓶壁后，雖有活力但基本不再分裂。潛伏期：3.細(xì)胞分裂指數(shù)（mitoticindex,MI）培養(yǎng)物中分裂相數(shù)量占全部細(xì)胞數(shù)量的百分比，統(tǒng)計(jì)時(shí)，每瓶至少需計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞。一般細(xì)胞的MI約為0.1－0.5%。原代培養(yǎng)物的MI比繼代培養(yǎng)物低。連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞高，可達(dá)3%－5%。3.細(xì)胞分裂指數(shù)（mitoticindex,MI）4.細(xì)胞周期流式細(xì)胞儀測(cè)定同位素標(biāo)記測(cè)定3H-TdR摻入法細(xì)胞群體倍增時(shí)間：培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量翻倍的平均時(shí)間。

群體倍增時(shí)間通常長于單個(gè)細(xì)胞周期。4.細(xì)胞周期細(xì)胞群體倍增時(shí)間：培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量翻倍的平均時(shí)四、細(xì)胞活力的檢測(cè)方法1、臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)臺(tái)盼藍(lán)（Trypanblue）染色使死細(xì)胞呈藍(lán)色，活細(xì)胞不著色。計(jì)數(shù)法得到活細(xì)胞比例。此法簡(jiǎn)單快速。注意及時(shí)檢測(cè)，時(shí)間過長部分活細(xì)胞亦被染色。四、細(xì)胞活力的檢測(cè)方法1、臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)2、克?。洌┬纬稍囼?yàn)測(cè)定單個(gè)細(xì)胞增殖能力，克隆形成率高者獨(dú)立生存能力強(qiáng)。平板克隆形成試驗(yàn)

軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)：多用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞。利用腫瘤細(xì)胞的非錨著生長依賴性，將其懸浮培養(yǎng)于軟瓊脂內(nèi)?？筛鶕?jù)其克隆形成率判斷細(xì)胞的惡性程度，亦可用此法進(jìn)行亞克隆分離。2、克隆（集落）形成試驗(yàn)3.

3H-TdR摻入法3H標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷（TdR），在DNA復(fù)制時(shí)摻入至新合成的DNA鏈中，從而使子細(xì)胞被3H標(biāo)記，測(cè)定3H的放射性脈沖數(shù)即可比較細(xì)胞增殖活性。3.3H-TdR摻入法4.細(xì)胞活力測(cè)定的MTT比色法MTT（二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽）是線粒體琥珀酸脫氫酶的作用底物，在活細(xì)胞中MTT能被其線粒體脫氫酶還原為formazan顆粒，溶于異丙醇或DMSO之后，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比，因此根據(jù)呈現(xiàn)的OD值可反應(yīng)細(xì)胞的代謝水平。死細(xì)胞無此酶活性。MTT法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒牲試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。亦常用于測(cè)定生長曲線。4.細(xì)胞活力測(cè)定的MTT比色法細(xì)胞系和細(xì)胞株細(xì)胞系和細(xì)胞株細(xì)胞系(cellline)

從原代培養(yǎng)物經(jīng)傳代后得來的一群不均一的細(xì)胞。由原先組成原代培養(yǎng)物的所有細(xì)胞類型組成，但一般以某種細(xì)胞為主。一、基本概念細(xì)胞系(cellline)一、基本概念細(xì)胞株(cellstrain)

通過選擇或克隆化培養(yǎng)，從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊遺傳、生化性質(zhì)或特異標(biāo)記的細(xì)胞群。如一定標(biāo)記染色體、對(duì)某種病毒的敏感性或抗性、特殊的抗原性等，這些特性在以后的培養(yǎng)中必須持續(xù)存在。有限細(xì)胞株（finitecellstrain）連續(xù)細(xì)胞株（continuouscellstrain）細(xì)胞株(cellstrain)二、建立細(xì)胞系（株）的檔案1、培養(yǎng)細(xì)胞的來源交代細(xì)胞供體所屬物種、年齡、性別、器官或組織來源。對(duì)腫瘤組織，應(yīng)說明臨床病理診斷結(jié)果、組織來源、病例號(hào)等。

說明培養(yǎng)基、血清等的使用條件。二、建立細(xì)胞系（株）的檔案1、培養(yǎng)細(xì)胞的來源2、細(xì)胞生物學(xué)特性

說明細(xì)胞的一般形態(tài)、特征性結(jié)構(gòu)、生長曲線與分裂指數(shù)、倍增時(shí)間、集落形成率、染色體特性等。對(duì)腺細(xì)胞應(yīng)查明有無蛋白質(zhì)或激素等分泌產(chǎn)物；對(duì)腫瘤細(xì)胞應(yīng)作瓊脂培養(yǎng)、異體動(dòng)物成瘤性、組織浸潤能力等檢測(cè)。2、細(xì)胞生物學(xué)特性培養(yǎng)物的冷凍與復(fù)蘇培養(yǎng)物的冷凍與復(fù)蘇一、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理冷凍保存：將體外培養(yǎng)物懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于-70℃的超低溫條件），并在此溫度下對(duì)其長期保存的過程。復(fù)蘇：以一定的復(fù)溫速率將凍存的培養(yǎng)物恢復(fù)到常溫的過程。一、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理冷凍保存：將體外培養(yǎng)物懸浮在加甘油、DMSO滲透到細(xì)胞內(nèi)，避免細(xì)胞過分脫水皺縮，減少水分子形成冰晶，保護(hù)酶和蛋白質(zhì)等。添加濃度通常為10%。（一）冷凍保護(hù)劑甘油、DMSO（一）冷凍保護(hù)劑速度過慢：脫水嚴(yán)重，體積嚴(yán)重收縮，溶質(zhì)損傷速度過快：胞內(nèi)冰晶損傷嚴(yán)重

（二）冷凍速率（三）冷凍保存溫度液氮溫度（-196℃）是目前最佳的冷凍保存溫度。-70℃～-80℃，短期保存一個(gè)月內(nèi)冰點(diǎn)到-40℃保存效果不佳。速度過慢：脫水嚴(yán)重，體積嚴(yán)重收縮，溶質(zhì)損傷（二）冷凍速率（四）復(fù)溫速率37-40℃水浴中，于1~2min內(nèi)快速完成復(fù)溫。（四）復(fù)溫速率37-40℃水浴中，于1~2min內(nèi)快速完成（1）待凍存細(xì)胞懸液的準(zhǔn)備（2）分級(jí)冷凍（3）記錄二、凍存方法（1）待凍存細(xì)胞懸液的準(zhǔn)備二、凍存方法三、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇從液氮中取出后，立即投入到37～40℃溫水中，溶解后盡快離心棄除冷凍保護(hù)液。三、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇從液氮中取出后，立即投入到37～40℃溫水2022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/11培養(yǎng)物的污染、檢測(cè)和排除培養(yǎng)物的污染、檢測(cè)和排除1.污染的內(nèi)容：微生物：真菌、細(xì)菌和病毒化學(xué)物：影響細(xì)胞生存非細(xì)胞所需的細(xì)胞成分細(xì)胞：其他非同一種細(xì)胞一、培養(yǎng)物的污染與檢測(cè)1.污染的內(nèi)容：微生物：一、培養(yǎng)物的污染與檢測(cè)2.污染對(duì)細(xì)胞的影響：輕者：細(xì)胞生長緩慢、分裂相減少、細(xì)胞變得粗糙、輪廓增強(qiáng)重者：細(xì)胞增殖停止、分裂相消失、胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物、細(xì)胞變圓、脫落2.污染對(duì)細(xì)胞的影響：輕者：3.污染的途徑：空氣清洗消毒操作血清組織塊3.污染的途徑：空氣4.細(xì)菌污染與檢測(cè)：懷疑有污染時(shí)，用無抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)檢測(cè)。如果有的話，幾小時(shí)內(nèi)培養(yǎng)液外觀就渾濁，呈現(xiàn)黃綠色，在倒置相差顯微鏡下有點(diǎn)狀的細(xì)菌顆粒，培養(yǎng)背景變的模糊。4.細(xì)菌污染與檢測(cè)：懷疑有污染時(shí)，用無抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)檢5.真菌污染與檢測(cè)：酵母菌污染：類似細(xì)菌污染，倒置相差顯微鏡下可以看到圓形或卵圓形的酵母菌；有酒或酸的發(fā)酵樣異味；液體呈現(xiàn)黃綠色。霉菌污染：絲狀或樹枝狀生長的菌絲，成白色絲狀團(tuán)塊，5.真菌污染與檢測(cè)：酵母菌污染：6.支原體污染與檢測(cè)：支原體污染的培養(yǎng)細(xì)胞，在顯微鏡下無特殊的外觀表現(xiàn)，培養(yǎng)液也不渾濁。因而在污染早期相當(dāng)難以發(fā)現(xiàn)。如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖緩慢、破碎的細(xì)胞甚多、培養(yǎng)細(xì)胞需要頻繁改善營養(yǎng)環(huán)境才能支持長期傳代培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)懷疑培養(yǎng)物可能受到支原體污染。檢測(cè)技術(shù)：DNA熒光染色法、PCR、免疫學(xué)方法以及支原體培養(yǎng)法。6.支原體污染與檢測(cè)：支原體污染的培養(yǎng)細(xì)胞，在顯微鏡下無特7.病毒污染的檢測(cè)感染了病毒的宿主細(xì)胞形態(tài)上不一定有顯著的特異性改變，因此較難判斷。判斷方法：電子顯微鏡觀察，免疫學(xué)方法，和PCR方法7.病毒污染的檢測(cè)感染了病毒的宿主細(xì)胞形態(tài)上不一定有顯著二、污染的預(yù)防1、培養(yǎng)操作前的準(zhǔn)備：a.定期清洗或更換超凈工作臺(tái)的空氣濾網(wǎng)檢查其空氣凈化標(biāo)準(zhǔn)b.培養(yǎng)液和培養(yǎng)器皿的無菌檢查c.操作野的消毒d.操作者的清潔與消毒二、污染的預(yù)防1、培養(yǎng)操作前的準(zhǔn)備：a.定期清洗或更換超凈工a.培養(yǎng)瓶瓶口與風(fēng)向一b.培養(yǎng)瓶的開啟、吸管帽的安裝等c.操作時(shí)，動(dòng)作輕軟、不許交談d.操作完畢后的清理與消毒2.培養(yǎng)操作時(shí)的注意事項(xiàng)：a.培養(yǎng)瓶瓶口與風(fēng)向一2.培養(yǎng)操作時(shí)的注意事項(xiàng)：a.及時(shí)凍存有價(jià)值的培養(yǎng)物b.血清的滅活c.定期更換培養(yǎng)體系中的抗生素d.定期清潔CO2培養(yǎng)箱e.新引進(jìn)的細(xì)胞株應(yīng)嚴(yán)加觀察3、其他注意事項(xiàng)：a.及時(shí)凍存有價(jià)值的培養(yǎng)物3、其他注意事項(xiàng)：2022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/11三、污染的排除1.抗生素：2.巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的方法3.小鼠腹腔過繼培養(yǎng)方法三、污染的排除1.抗生素：2022/11/182022/11/112022/11/182022/11/11思考題細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件？細(xì)胞凍存和解凍的原則是什么？名詞解釋：細(xì)胞系和細(xì)胞株。如何進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)？細(xì)胞計(jì)數(shù)的公式是什么？請(qǐng)?jiān)敿?xì)說明。思考題TheEndTheEnd第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)2022/11/182022/11/11培養(yǎng)物的冷凍與復(fù)蘇體外細(xì)胞培養(yǎng)條件和基本技術(shù)體外細(xì)胞培養(yǎng)體外培養(yǎng)物的生長生物學(xué)培養(yǎng)物的污染、檢測(cè)和排除

細(xì)胞系和細(xì)胞株培養(yǎng)物的冷凍與復(fù)蘇體外細(xì)胞培養(yǎng)條件和基本技術(shù)體外細(xì)胞培養(yǎng)體外體外細(xì)胞培養(yǎng)條件

與基本技術(shù)體外細(xì)胞培養(yǎng)條件

與基本技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件體外細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：

簡(jiǎn)化細(xì)胞的生長環(huán)境方便施加實(shí)驗(yàn)因素便于觀測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果便于獲得均一細(xì)胞群能夠進(jìn)行大規(guī)模生物制品的生產(chǎn)體外細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：體外細(xì)胞培養(yǎng)不足之處：

培養(yǎng)對(duì)象脫離了機(jī)體的整體支配和調(diào)控，細(xì)胞間在一定程度上失去組織聯(lián)系及相互作用。

體外培養(yǎng)條件下的生長發(fā)育情況與在體時(shí)的情況存在一定差異，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)必須考慮這種差異。體內(nèi)體外研究技術(shù)的結(jié)合。體外細(xì)胞培養(yǎng)不足之處：培養(yǎng)對(duì)象脫離了機(jī)體外細(xì)胞培養(yǎng)條件體外細(xì)胞培養(yǎng)條件2022/11/18

實(shí)驗(yàn)人員的無菌準(zhǔn)備肥皂洗手；穿好隔離衣、戴好隔離帽、口罩、穿好拖鞋；戴乳膠手套、75%酒精擦手套。2022/11/11實(shí)驗(yàn)人員的無菌準(zhǔn)備一、體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室

1.準(zhǔn)備室

2.培養(yǎng)室

3.緩沖室

4.其他實(shí)驗(yàn)室基本條件要求：清潔、無菌、干燥、不通風(fēng)，并具有適宜的光線。空氣調(diào)節(jié)用中央空調(diào)或分體式空調(diào)機(jī)。室頂安裝紫外燈等消毒裝置。一、體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室1.準(zhǔn)備室基本條件要求：清潔、2022/11/182022/11/112022/11/182022/11/11細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件2022/11/18二、體外培養(yǎng)的設(shè)備和器具1.超靜工作臺(tái)

生物安全柜

凈化室（一）設(shè)備2022/11/11二、體外培養(yǎng)的設(shè)備和器具1.超靜工作臺(tái)2022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/18XV2022/11/11XV2022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112.培養(yǎng)箱溫度濕度pH值2.培養(yǎng)箱溫度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件2022/11/182022/11/113.倒置顯微鏡3.倒置顯微鏡4.水凈化裝置去離子水凈化裝置4.水凈化裝置去離子水凈化裝置石英玻璃蒸餾器石英玻璃蒸餾器超純水裝置超純水裝置5.冰箱5.冰箱6.離心機(jī)6.離心機(jī)2022/11/187.冷凍保存裝置2022/11/117.冷凍保存裝置2022/11/182022/11/11細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件8.高壓蒸汽消毒裝置8.高壓蒸汽消毒裝置電熱干燥箱pH計(jì)天平電熱干燥箱（二）培養(yǎng)器具1.過濾除菌裝置Zeiss濾器抽濾式玻璃簡(jiǎn)易型濾器針頭式加壓塑料小濾器（二）培養(yǎng)器具1.過濾除菌裝置Zeiss濾器細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件2.培養(yǎng)器皿

（1）溶液瓶（2）

培養(yǎng)瓶（3）

培養(yǎng)皿（4）

多孔培養(yǎng)板（5）

離心管2.培養(yǎng)器皿（1）溶液瓶細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件3.移液器3.移液器4.篩網(wǎng)金屬篩網(wǎng)（不銹鋼網(wǎng)、銅網(wǎng)）尼龍篩網(wǎng)4.篩網(wǎng)金屬篩網(wǎng)（三）培養(yǎng)用液水和平衡鹽溶液（balancedsaltsolution,BSS)培養(yǎng)液：

天然培養(yǎng)液合成培養(yǎng)液無血清培養(yǎng)基其他用液：

消化液等（三）培養(yǎng)用液水和平衡鹽溶液（balancedsalts水：離子交換水蒸餾水平衡鹽溶液主要成分：無機(jī)鹽和葡萄糖常用BSS:PBSRingerEarleD-HanksHanks水：離子交換水平衡鹽溶液主要成分：無機(jī)鹽和葡萄糖天然培養(yǎng)基血清：小牛血清,胎牛血清（fetalbovineserum,FBS）,馬血清水解乳蛋白胚胎滲出液天然培養(yǎng)基血清：合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基的種類：MEMRPMI1640McCoy5AHAMF12

等合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基的種類：干粉型培養(yǎng)基的配制：

1.制備高質(zhì)量的去離子水(玻璃三蒸餾水)或超純水2.加溫水至15-30℃之間

3.加干粉入水中，攪拌令之溶解

4.加NaHCO35.加水至最終量

6.必要時(shí)用1NHCl或1NNaOH調(diào)節(jié)pH，因?yàn)V過時(shí)pH可能受影響

7.用0.22um或小于此微孔濾膜濾過消毒干粉型培養(yǎng)基的配制：1.制備高質(zhì)量的去離子水(玻璃三蒸餾常用的生長培養(yǎng)液基本培養(yǎng)基80-90％血清(多用小牛血清)10-20％抗生素(多用青霉素100單位／毫升和鏈霉素100微克／毫升)

常用的生長培養(yǎng)液基本培養(yǎng)基80-90其他常用液消化液：胰蛋白酶、EDTA溶液pH調(diào)整液：

NaHCO3溶液、HEPES溶液抗生素液：青鏈霉素其他常用液消化液：細(xì)胞體外培養(yǎng)的其它條件細(xì)胞體外培養(yǎng)的其它條件一、無污染的氣、液相環(huán)境1、O2

5%CO2+95%空氣O2:21%一、無污染的氣、液相環(huán)境1、O22、CO2-pHNaHCO3+H2ONa++OH-+H2CO3Na++OH-+H2O+CO2Hepes2、CO2-pHNaHCO3+H2O3、液相環(huán)境-滲透壓3、液相環(huán)境-滲透壓二、溫度二、溫度三、生長基質(zhì)1、多聚賴氨酸

0.05mg/ml2、纖維連接蛋白

1mg/ml3、膠原

1~3mg/ml4、層粘連蛋白

5~10g/ml三、生長基質(zhì)1、多聚賴氨酸2022/11/182022/11/11清洗和消毒清洗和消毒2022/11/182022/11/11玻璃器皿的清洗浸泡刷洗酸浸沖洗玻璃器皿的清洗浸泡浸酸液強(qiáng)液：63克重鉻酸鉀

1000毫升濃硫酸

200毫升蒸餾水次強(qiáng)液：120克重鉻酸鉀

200毫升濃硫酸

1000毫升蒸餾水弱液：100克重鉻酸鉀

100毫升濃硫酸

1000毫升蒸餾水浸酸液強(qiáng)液：63克重鉻酸鉀膠塞清洗膠塞入水中浸泡2％Na0H煮沸10-20分鐘自來水沖洗1％稀鹽酸浸泡30分鐘自來水沖洗和蒸餾水漂洗2-3次晾干備用膠塞清洗膠塞入水中浸泡塑料器皿的清洗塑料器皿的清洗消毒：紫外線干熱消毒濕熱消毒濾過消毒射線消毒消毒劑的使用包裝：局部包裝全包裝消毒：紫外線包裝：局部包裝體外細(xì)胞培養(yǎng)體外細(xì)胞培養(yǎng)體外細(xì)胞培養(yǎng)類型：原代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)

體外細(xì)胞培養(yǎng)類型：動(dòng)物器官或大組織塊洗去血污剔除多余成分１mm3的植塊組織剪碎植塊培養(yǎng)蛋白酶消化機(jī)械吹打銅網(wǎng)過濾離心細(xì)胞懸液調(diào)整細(xì)胞數(shù)分離細(xì)胞培養(yǎng)一.基本流程：原代培養(yǎng)動(dòng)物器官或大組織塊一.基本流程：原代培養(yǎng)二、實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)（一）常用實(shí)驗(yàn)材料的取材：

胚胎、組織、人體手術(shù)或活檢材料二、實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)（一）常用實(shí)驗(yàn)材料的取材：（二）分散細(xì)胞的方法１.機(jī)械解離細(xì)胞法

吸管吹打法過篩法單細(xì)胞分離器

（二）分散細(xì)胞的方法１.機(jī)械解離細(xì)胞法2022/11/182022/11/11細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件２.蛋白酶學(xué)處理法胰蛋白酶膠原酶２.蛋白酶學(xué)處理法2022/11/182022/11/112022/11/182022/11/11３.螯合劑解離細(xì)胞法

EDTA檸檬酸鈉３.螯合劑解離細(xì)胞法2022/11/182022/11/11（三）接種和培養(yǎng)過程１.植塊培養(yǎng)

接種與培養(yǎng)：

優(yōu)點(diǎn)：比較簡(jiǎn)單，保留了在體時(shí)細(xì)胞間的相互作用，因而在體外培養(yǎng)時(shí)，植塊內(nèi)細(xì)胞容易存活和生長。（三）接種和培養(yǎng)過程１.植塊培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：第一講體外細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)課件２.分散細(xì)胞培養(yǎng)操作過程:優(yōu)點(diǎn)：解除了植塊內(nèi)部細(xì)胞間的組織關(guān)系，從而可以反映出單個(gè)細(xì)胞的生物學(xué)特征?？蓪?shí)現(xiàn)對(duì)單一細(xì)胞類型進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)研究。２.分散細(xì)胞培養(yǎng)操作過程:2022/11/182022/11/11（四）討論和注意事項(xiàng)相對(duì)于植塊內(nèi)的細(xì)胞，分離散細(xì)胞在體外更難以存活和生長。對(duì)于大多數(shù)貼壁依賴型細(xì)胞來說，如何盡快讓接種的細(xì)胞貼壁，是決定培養(yǎng)物生長快慢的關(guān)鍵步驟?？蛇x用生長基質(zhì)表面；降低浮力。細(xì)胞密度：105個(gè)/ml左右，對(duì)大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞是比較適中的。（四）討論和注意事項(xiàng)相對(duì)于植塊內(nèi)的細(xì)胞，分離散細(xì)胞在體外更難三、原代細(xì)胞培養(yǎng)的注意事項(xiàng)1、培養(yǎng)液培養(yǎng)基的選擇添加劑培養(yǎng)液的酸堿度換液2、培養(yǎng)的空間通常培養(yǎng)液與液面上空間的體積比以1:10為宜。三、原代細(xì)胞培養(yǎng)的注意事項(xiàng)1、培養(yǎng)液一、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)1、植塊培養(yǎng)2、分離細(xì)胞培養(yǎng)物3、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物繼代培養(yǎng)一、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo)1、植塊培養(yǎng)繼代培養(yǎng)二、傳代的過程1、主要材料：（1）蛋白酶消化液（2）培養(yǎng)器皿（3）培養(yǎng)液及平衡鹽溶液2、方法：

二、傳代的過程1、主要材料：（1）貼壁生長細(xì)胞培養(yǎng)物的傳代吸去舊培養(yǎng)液

PBS或D-Hanks洗酶消化解離細(xì)胞終止消化吹打培養(yǎng)器皿底部收集細(xì)胞、洗滌、調(diào)整細(xì)胞數(shù)接種（1）貼壁生長細(xì)胞培養(yǎng)物的傳代2022/11/182022/11/11（2）懸浮培養(yǎng)物的傳代培養(yǎng)物移入離心管離心、去上清培養(yǎng)液重懸接種培養(yǎng)皿補(bǔ)加培養(yǎng)液（2）懸浮培養(yǎng)物的傳代培養(yǎng)物移入離心管三、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)1、傳代的時(shí)機(jī)與再培養(yǎng)的細(xì)胞密度2、傳代數(shù)與培養(yǎng)物的生長三、傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)1、傳代的時(shí)機(jī)與再培養(yǎng)的細(xì)胞密度體外培養(yǎng)物的生長生物學(xué)體外培養(yǎng)物的生長生物學(xué)原代培養(yǎng)期：細(xì)胞性狀與體內(nèi)原組織相似性大，異質(zhì)性。傳代培養(yǎng)期：細(xì)胞增殖旺盛（潛伏期、指數(shù)生長期、停滯期），逐漸趨向同質(zhì)化，正常細(xì)胞約可傳30-50代，應(yīng)及早凍存。衰退期：細(xì)胞增殖減慢，直至死亡。一、培養(yǎng)細(xì)胞的生長與增殖原代培養(yǎng)期：一、培養(yǎng)細(xì)胞的生長與增殖2022/11/182022/11/112022/11/18對(duì)數(shù)生長期2022/11/11對(duì)數(shù)生長期2022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/11二、體外細(xì)胞培養(yǎng)物的生長類型貼壁細(xì)胞懸浮細(xì)胞二、體外細(xì)胞培養(yǎng)物的生長類型貼壁細(xì)胞多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長，屬貼壁依賴性細(xì)胞。體內(nèi)：粘附全方位，外形具有復(fù)雜的立體特征。

體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個(gè)附著平面，外形一般與體內(nèi)時(shí)明顯不同。黏附型細(xì)胞多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長，屬貼壁依賴性細(xì)胞。黏附型細(xì)胞成纖維細(xì)胞型

梭形、長條形或不規(guī)則多角形，胞體一般鋪展很開，成群細(xì)胞呈現(xiàn)放射狀、旋渦狀等走行形式。起源于中胚層的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)一般表現(xiàn)為此型，如成纖維細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、骨與軟骨細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞等。成纖維細(xì)胞型上皮細(xì)胞型扁平、多角形，細(xì)胞間相互銜接或呈鑲嵌狀緊密排列，呈“鋪路石樣”，形成單層膜。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)可能呈現(xiàn)此型，如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等。上皮細(xì)胞型游走細(xì)胞型細(xì)胞相互分散，一般不形成集落；在器皿壁上生長位置不固定，經(jīng)常處于較活躍的變形和游走狀態(tài)，因此外形不規(guī)則且不斷變化。主要是具有吞噬作用的單核巨噬細(xì)胞細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞，如顆粒性白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及某些腫瘤細(xì)胞。游走細(xì)胞型多形細(xì)胞型形態(tài)不規(guī)則，一般分為胞體和胞突兩部分。胞突為細(xì)長形，似絲狀偽足。胞體雖略呈多角形。主要是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞多形細(xì)胞型2022/11/182022/11/11懸浮型細(xì)胞細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)不粘附于支持物上，而是呈懸浮生長狀態(tài)，如某些癌細(xì)胞和血液白細(xì)胞。

細(xì)胞懸浮生長時(shí)胞體為圓形。適于大量繁殖。

懸浮型細(xì)胞細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)不粘附于支持物上，而是呈懸浮生長狀態(tài)，三、培養(yǎng)細(xì)胞的生長狀況觀察（一）常規(guī)觀察

培養(yǎng)液：顏色、透明度等細(xì)胞生長概況及形態(tài)變化：細(xì)胞輪廓、折光性、胞內(nèi)顆粒等微生物污染狀況：三、培養(yǎng)細(xì)胞的生長狀況觀察（一）常規(guī)觀察培養(yǎng)液：顏色、透明度（二）細(xì)胞生長狀況觀察1.細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀細(xì)胞計(jì)數(shù)板制備細(xì)胞懸液，稀釋成合適的濃度；加至細(xì)胞計(jì)數(shù)板中央凹槽處，顯微鏡下計(jì)算四角大方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)；按照公式計(jì)算懸液中細(xì)胞密度。（二）細(xì)胞生長狀況觀察2022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/112022/11/182022/11/11計(jì)左不計(jì)右，計(jì)上不計(jì)下。每一大方格長、寬各1mm，深度0.1mm，體積0.1mm3

，即1×10－4ml。細(xì)胞密度＝4大格中細(xì)胞總數(shù)4×104

（個(gè)/ml）計(jì)左不計(jì)右，計(jì)上不計(jì)下。每一大方格長、寬各1mm，深度0.12022/11/182022/11/112.細(xì)胞生長曲線細(xì)胞生長曲線是衡量細(xì)胞增殖快慢的重要指標(biāo)。細(xì)胞計(jì)數(shù)法MTT（CCK-8）法2.細(xì)胞生長曲線潛伏期：細(xì)胞有生長話動(dòng)而無細(xì)胞分裂。潛伏期一般為6～24小時(shí)。對(duì)數(shù)生長期：細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間成倍增長，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。停止期（平臺(tái)期）：細(xì)胞長滿瓶壁后，雖有活力但基本不再分裂。潛伏期：3.細(xì)胞分裂指數(shù)（mitoticindex,MI）培養(yǎng)物中分裂相數(shù)量占全部細(xì)胞數(shù)量的百分比，統(tǒng)計(jì)時(shí)，每瓶至少需計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞。一般細(xì)胞的MI約為0.1－0.5%。原代培養(yǎng)物的MI比繼代培養(yǎng)物低。連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞高，可達(dá)3%－5%。3.細(xì)胞分裂指數(shù)（mitoticindex,MI）4.細(xì)胞周期流式細(xì)胞儀測(cè)定同位素標(biāo)記測(cè)定3H-TdR摻入法細(xì)胞群體倍增時(shí)間：培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量翻倍的平均時(shí)間。

群體倍增時(shí)間通常長于單個(gè)細(xì)胞周期。4.細(xì)胞周期細(xì)胞群體倍增時(shí)間：培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量翻倍的平均時(shí)四、細(xì)胞活力的檢測(cè)方法1、臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)臺(tái)盼藍(lán)（Trypanblue）染色使死細(xì)胞呈藍(lán)色，活細(xì)胞不著色。計(jì)數(shù)法得到活細(xì)胞比例。此法簡(jiǎn)單快速。注意及時(shí)檢測(cè)，時(shí)間過長部分活細(xì)胞亦被染色。四、細(xì)胞活力的檢測(cè)方法1、臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)2、克?。洌┬纬稍囼?yàn)測(cè)定單個(gè)細(xì)胞增殖能力，克隆形成率高者獨(dú)立生存能力強(qiáng)。平板克隆形成試驗(yàn)

軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)：多用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞。利用腫瘤細(xì)胞的非錨著生長依賴性，將其懸浮培養(yǎng)于軟瓊脂內(nèi)?？筛鶕?jù)其克隆形成率判斷細(xì)胞的惡性程度，亦可用此法進(jìn)行亞克隆分離。2、克隆（集落）形成試驗(yàn)3.

3H-TdR摻入法3H標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷（TdR），在DNA復(fù)制時(shí)摻入至新合成的DNA鏈中，從而使子細(xì)胞被3H標(biāo)記，測(cè)定3H的放射性脈沖數(shù)即可比較細(xì)胞增殖活性。3.3H-TdR摻入法4.細(xì)胞活力測(cè)定的MTT比色法MTT（二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽）是線粒體琥珀酸脫氫酶的作用底物，在活細(xì)胞中MTT能被其線粒體脫氫酶還原為formazan顆粒，溶于異丙醇或DMSO之后，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比，因此根據(jù)呈現(xiàn)的OD值可反應(yīng)細(xì)胞的代謝水平。死細(xì)胞無此酶活性。MTT法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒牲試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。亦常用于測(cè)定生長曲線。4.細(xì)胞活力測(cè)定的MTT比色法細(xì)胞系和細(xì)胞株細(xì)胞系和細(xì)胞株細(xì)胞系(cellline)

從原代培養(yǎng)物經(jīng)傳代后得來的一群不均一的細(xì)胞。由原先組成原代培養(yǎng)物的所有細(xì)胞類型組成，但一般以某種細(xì)胞為主。一、基本概念細(xì)胞系(cellline)一、基本概念細(xì)胞株(cellstrain)

通過選擇或克隆化培養(yǎng)，從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊遺傳、生化性質(zhì)或特異標(biāo)記的細(xì)胞群。如一定標(biāo)記染色體、對(duì)某種病毒的敏感性或抗性、特殊的抗原性等，這些特性在以后的培養(yǎng)中必須持續(xù)存在。有限細(xì)胞株（finitecellstrain）連續(xù)細(xì)胞株（continuouscellstrain）細(xì)胞株(cellstrain)二、建立細(xì)胞系（株）的檔案1、培養(yǎng)細(xì)胞的來源交代細(xì)胞供體所屬物種、年齡、性別、器官或組織來源。對(duì)腫瘤組織，應(yīng)說明臨床病理診斷結(jié)果、組織來源、病例號(hào)等。

說明培養(yǎng)基、血清等的使用條件。二、建立細(xì)胞系（株）的檔案1、培養(yǎng)細(xì)胞的來源2、細(xì)胞生物學(xué)特性

說明細(xì)胞的一般形態(tài)、特征性結(jié)構(gòu)、生長曲線與分裂指數(shù)、倍增時(shí)間、集落形成率、染色體特性等。對(duì)腺細(xì)胞應(yīng)查明有無