第五章 紫外 可見吸光光度法課件

第五章紫外-可見吸光光度法§5-1吸光光度法的基本原理§5-2光的吸收定律—郎伯-比耳定律§5-3紫外-可見吸光光度計§5-4實驗條件的選擇§5-5吸光光度法應(yīng)用示例1第五章紫外-可見吸光光度法§5-1吸光光度法的基本原理§化學(xué)分析：常量組分(>1%),Er:0.1%-0.2%

依據(jù)化學(xué)反應(yīng),使用玻璃儀器

化學(xué)分析與儀器分析方法比較儀器分析：微量組分(<1%),Er:1%-5%

依據(jù)物理或物理化學(xué)性質(zhì),需要特殊的儀器例:含F(xiàn)e約0.05%的樣品,稱0.2g,則m(Fe)≈0.1mg重量法

m(Fe2O3)≈0.14mg,稱不準(zhǔn)容量法

V(K2Cr2O7)≈0.02mL,測不準(zhǔn)光度法結(jié)果0.048%～0.052%,滿足要求準(zhǔn)確度高靈敏度高2化學(xué)分析：常量組分(>1%),Er:0.1%-0.2%儀器分析方法分類2.電化學(xué)分析法:依據(jù)物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)及其變化3.色譜法:氣相色譜,液相色譜,毛細(xì)管電泳法4.質(zhì)譜法、熱分析法、放射化學(xué)法等非光譜法（折射法，濁度法，旋光法）（不以光的波長為特征訊號）光譜法分子光譜法UV/Vis,IR,NMR原子光譜法AAS,AES,AFS（以光的吸收、發(fā)射等作用而建立的分析方法，通過檢測光譜的波長和強(qiáng)度來進(jìn)行定性和定量的方法）光學(xué)分析法1.光學(xué)分析法:基于電磁輻射與物質(zhì)的相互作用.3儀器分析方法分類2.電化學(xué)分析法:依據(jù)物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)及吸光光度法

基于被測物質(zhì)的分子

對光

具有選擇吸收的特性而建立的分析方法?！?-1吸光光度法的基本原理

特點(diǎn)

靈敏度高：測定下限可達(dá)10-5-10-6mol·L-1；準(zhǔn)確度能夠滿足微量組分的測定要求：相對誤差2%-5％操作簡便、快速、選擇性好、儀器設(shè)備簡單應(yīng)用廣泛4吸光光度法基于被測物質(zhì)的分子對光具有選擇吸收的特性而一、光的基本性質(zhì)波動性光的傳播速度:c－真空中光速3.0×108m/s－波長，單位：m,cm,mm,m,nm,?

1m=10-6m,1nm=10-9m,1?=10-10m

－頻率，單位：Hz次/秒5一、光的基本性質(zhì)波動性光的傳播速度:c－真空中光速

h－普朗克(Planck)常數(shù)6.626×10-34J·s E－光量子具有的能量單位：J(焦耳)，eV(電子伏特)1eV=1.602×10－19J微粒性光量子，具有能量：6 h－普朗克(Planck)常數(shù)6.626×10-34J結(jié)論:一定波長的光具有一定的能量，波長越長(頻率越低)，光量子的能量越低.單色光：具有相同能量(相同波長)的光.混合光：具有不同能量(不同波長)的光復(fù)合在一起.例如白光.波粒二象性7結(jié)論:一定波長的光具有一定的能量，波長越長(頻率越射線x射線紫外光紅外光微波無線電波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可見光光學(xué)光譜區(qū)8射線x射線紫外光紅外光微波無線電波10-2nm二、物質(zhì)對光的選擇性吸收物質(zhì)的顏色與光的關(guān)系完全吸收完全透過吸收黃色光光譜示意表觀現(xiàn)象示意復(fù)合光9二、物質(zhì)對光的選擇性吸收物質(zhì)的顏色與光的關(guān)系完全吸收完全透過/nm顏色互補(bǔ)光400-450紫黃綠450-480藍(lán)黃480-490綠藍(lán)橙490-500藍(lán)綠紅500-560綠紅紫560-580黃綠紫580-610黃藍(lán)610-650橙綠藍(lán)650-760紅不同顏色的可見光波長及其互補(bǔ)光藍(lán)綠10/nm顏色互補(bǔ)光400-450紫黃綠450-480藍(lán)黃48價電子相對于原子核的運(yùn)動--電子能級;能級差：1-20ev；吸收波長：1.25-0.06m；紫外-可見光譜或電子光譜。2.原子核在其平衡位置附近的相對振動--振動能級;能級差：0.05-1ev；吸收波長：25-1.25m；紅外光譜或分子振-轉(zhuǎn)光譜。3.分子本身繞其重心的轉(zhuǎn)動--轉(zhuǎn)動能級.能級差：0.005-0.05ev；吸收波長：250-25m；遠(yuǎn)紅外光譜或分子轉(zhuǎn)動光譜。物質(zhì)分子內(nèi)部3種運(yùn)動形式及其對應(yīng)能級11價電子相對于原子核的運(yùn)動--電子能級;物質(zhì)分子內(nèi)部3種運(yùn)動三、定性分析與定量分析的基礎(chǔ)定性分析基礎(chǔ)定量分析基礎(chǔ)物質(zhì)對光的選擇吸收ABA在一定的實驗條件下，物質(zhì)對光的吸收與物質(zhì)的濃度成正比。AC增大12三、定性分析與定量分析的基礎(chǔ)定性分析基礎(chǔ)定量分析基礎(chǔ)物質(zhì)對光§5-2光的吸收定律—郎伯-比耳定律郎伯-比耳定律；吸光度與透光度的關(guān)系；偏離郎伯-比耳定律的原因；13§5-2光的吸收定律—郎伯-比耳定律郎伯-比耳定律；1一、郎伯-比耳定律透光度(透射比)Transmittance透光度定義：T取值為0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%入射光I0透射光I14一、郎伯-比耳定律透光度(透射比)Transmittan朗伯定律:(1760)Ab當(dāng)入射光的、吸光物質(zhì)的c一定時，溶液的吸光度A與液層厚度b成正比.比耳定律(1852)Ac 當(dāng)入射光的、液層厚度b

一定時，溶液的吸光度A與吸光物質(zhì)的c成正比.15朗伯定律:(1760)Ab比耳定律(1852)意義：當(dāng)一束平行單色光通過均勻、透明的、非散射的吸光物質(zhì)時，其吸光度與溶液液層的厚度和濃度的乘積成正比。A=lg(I0/I)=abc前提條件：單色光：應(yīng)選用max處測定；吸光質(zhì)點(diǎn)形式不變；

離解、絡(luò)合、締合會破壞線性關(guān)系,應(yīng)控制條件(酸度、濃度、介質(zhì)等)；稀溶液：濃度太大，分子間作用力增強(qiáng)。16意義：當(dāng)一束平行單色光通過均勻、透明的、非散射的吸光物質(zhì)時，吸光度與透光度T：透光度A：吸光度1.00.50ACA100500T%TT=0.0%A=∞T=100.0%A=0.0A=0.434T=36.8%17吸光度與透光度T：透光度A：吸光度1.0ACA100T吸光系數(shù)b:吸光液層的厚度,cmc:吸光物質(zhì)的濃度,g/L,mol/La：比例常數(shù)入射光波長物質(zhì)的性質(zhì)溫度取值與濃度的單位相關(guān)c:mol/La

κ摩爾吸光系數(shù),cm-1·mol–1·Lc:g/La吸光系數(shù),L·g–1·cm-1MolarAbsorptivity18吸光系數(shù)b:吸光液層的厚度,cmc:吸光物質(zhì)的濃度,溶液濃度的測定A＝κbc工作曲線法(標(biāo)準(zhǔn)曲線)朗伯-比耳定律的分析應(yīng)用01.02.03.04.0cA。。。。*0.800.600.400.200.00Axcx吸光度的加和性與吸光度的測量A=A1+A2+…+An19溶液濃度的測定A＝κbc工作曲線法朗伯-比耳定律的分析應(yīng)用二、偏離郎伯-比耳定律的原因AC主要原因非單色光吸光質(zhì)點(diǎn)的相互作用20二、偏離郎伯-比耳定律的原因AC主要原因非單色光吸光質(zhì)點(diǎn)的相§5-3紫外-可見吸光光度計分光光度計的構(gòu)成；分光光度法的靈敏度和準(zhǔn)確度21§5-3紫外-可見吸光光度計分光光度計的構(gòu)成；2122222323紫外-可見分光光度法,UV-VIS0.434光源單色器吸收池檢測器顯示24紫外-可見分光光度法,UV-VIS0.434光源單色器吸收吸光分析法的儀器簡介紫外-可見分光光度計組件光源單色器樣品池檢測器顯示裝置氫燈,氘燈,180-375nm;鹵鎢燈,320-2500nm.基本要求:光源強(qiáng),能量分布均勻,穩(wěn)定作用:將復(fù)合光色散成單色光棱鏡光柵玻璃,350-3200nm,石英,185-4000nm光學(xué)玻璃,石英作用:將光信號轉(zhuǎn)換為電信號,并放大光電池，光電管,光電倍增管,光導(dǎo)攝像管(多道分析器)微安表、檢流計、屏幕、數(shù)字顯示記錄儀25吸光分析法的儀器簡介紫外-可見分光光度計組件光源單色器樣品池氙燈氫燈鎢燈26氙燈氫燈鎢燈26棱鏡：依據(jù)不同波長光通過棱鏡時折射率不同入射狹縫準(zhǔn)直透鏡棱鏡聚焦透鏡出射狹縫白光紅紫λ1λ280060050040027棱鏡：依據(jù)不同波長光通過棱鏡時折射率不同入射狹縫準(zhǔn)直透鏡棱鏡光柵：在鍍鋁的玻璃表面刻有數(shù)量很大的等寬度等間距條痕(600、1200、2400條/mm)。

利用光通過光柵時發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光。波長范圍寬,色散均勻,分辨性能好,使用方便.光柵衍射示意圖M1M2出射狹縫光屏透鏡平面透射光柵28光柵：在鍍鋁的玻璃表面刻有數(shù)量很大的等寬度等間距條痕(600單光束分光光度計可變波長單光束紫外-可見分光光度計示意圖29單光束分光光度計可變波長單光束紫外-可見分光光度計示意圖29吸光光度法的靈敏度與準(zhǔn)確度靈敏度吸光光度法是一種適合于微量組分測定的儀器分析法，檢測限大多可達(dá)10-3~10-4g/L或~g/mL數(shù)量級。準(zhǔn)確度能滿足微量組分測定的要求。一般相對誤差2~5%。30吸光光度法的靈敏度與準(zhǔn)確度靈敏度吸光光度法是一種適合于微量組對摩爾系數(shù)的理解一32+桔紅色508鄰二氮菲κ=1.1104測定工作曲線的斜率即為摩爾吸收系數(shù)摩爾吸收系數(shù)是對吸光物質(zhì)而言，是由吸光物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征，吸光面積等因素決定。靈敏度的表示方法摩爾吸光系數(shù)κ當(dāng)b=1時，AC0κ31對摩爾系數(shù)的理解一32+桔紅色508鄰二氮菲κ=1.1對摩爾系數(shù)的理解二對同一種待測物質(zhì)，不同的方法具有不同的κ，表明具有不同的靈敏度。例：分光光度法測銅銅試劑法測Cuκ426=1.28104Lmol-1cm-1雙硫腙法測Cuκ495=1.58105Lmol-1cm-1一般情況κ

<104

κ

:

104~105

κ

>105低靈敏度中等靈敏度高靈敏度32對摩爾系數(shù)的理解二對同一種待測物質(zhì)，不同的方法具有不同的κ影響準(zhǔn)確度的因素儀器測量誤差吸光定律根據(jù)誤差傳遞公式，有又得濃度測量的相對偏差令得T=0.368=36.8%A=0.434時，儀器測量誤差最小33影響準(zhǔn)確度的因素儀器測量誤差吸光定律根據(jù)誤差傳遞公式，有又1086420204060800.70.40.20.1AT/%Er(36.8)0.434濃度測量的相對誤差與T(或A)的關(guān)系實際工作中，應(yīng)控制T在10～70％,

A在0.15～1.0之間(調(diào)c,b,)341086420204060800.70.40.20.1AT/§5-4實驗條件的選擇測量條件；分析條件；35§5-4實驗條件的選擇測量條件；35測量條件的選擇測量波長的選擇無干擾，選擇測量max有干擾AA待測溶液吸光度的選擇控制A=0.2~0.8T=65%~15%方法選擇C選擇b1非單色光影響小2靈敏度高36測量條件的選擇測量波長的選擇無干擾，選擇測量max有干擾A用參比溶液調(diào)T=100%（A=0），再測樣品溶液的吸光度，即消除了吸收池對光的吸收、反射，溶劑、試劑對光的吸收等。參比溶液I0I參比樣品入射光I0透射光I37用參比溶液調(diào)T=100%（A=0），再測樣品溶參比溶液的選擇原則：扣除非待測組分的吸收以顯色反應(yīng)為例進(jìn)行討論M+R=M-Rmax試液顯色劑溶劑吸光物質(zhì)參比液組成無吸收無吸收光學(xué)透明溶劑基質(zhì)吸收無吸收吸收不加顯色劑的試液無吸收吸收吸收顯色劑基質(zhì)吸收吸收吸收吸收顯色劑+試液+待測組分的掩蔽劑若欲測M-R的吸收A(樣)=A(待測吸光物質(zhì))+A(干擾)+A(池)A(參比)=A(干擾)+A(池)38參比溶液的選擇原則：扣除非待測組分的吸收以顯色反應(yīng)為例進(jìn)行討吸光光度法分析條件的選擇顯色反應(yīng)有機(jī)物質(zhì)官能團(tuán)強(qiáng)吸收直接測定UV-VIS官能團(tuán)弱吸收衍生化反應(yīng)UV-VIS顯色反應(yīng)無機(jī)物質(zhì)通常通過顯色反應(yīng)生成吸光系數(shù)大的有色物質(zhì)進(jìn)行測定，以提高靈敏度。32+桔紅色508鄰二氮菲39吸光光度法分析條件的選擇顯色反應(yīng)有機(jī)物質(zhì)官能團(tuán)強(qiáng)吸收直接測定顯色劑與顯色反應(yīng)：：：：助色團(tuán)－NH，－OH，－X（孤對電子）neO生色團(tuán)：－N＝N－，－N＝O，OC=S,－N（共軛雙鍵）πe40顯色劑與顯色反應(yīng)：：：：助色團(tuán)－NH，－OH，－X（孤顯色反應(yīng)的選擇靈敏度高，一般ε>104;選擇性好;顯色劑在測定波長處無明顯吸收,

對照性好,max>60nm;反應(yīng)生成的有色化合物組成恒定，穩(wěn)定;顯色條件易于控制，重現(xiàn)性好.41顯色反應(yīng)的選擇靈敏度高，一般ε>104;41酸度的選擇酸度的影響副反應(yīng)M+nR=MRnOH-H+存在型體的變化RH=R-+H+

12生成不同配比的絡(luò)合物例，磺基水楊酸–Fe3+pH=2-3FeR紫紅色pH=4-7FeR2橙色pH=8-10FeR3黃色42酸度的選擇酸度的影響副反應(yīng)M+nR=MRn酸度的選擇理論計算M+nR=MRnOH-H+例：鄰二氮菲-亞鐵反應(yīng)完全度與pH的關(guān)系

cR≈[R]=10-4mol·L-143酸度的選擇理論計算M+nR=MRnOH-H以作圖，可得適宜pH范圍實際工作，作A~pH曲線，尋找適宜pH范圍。ApHpH3-844以作圖，可得適宜pH范圍實際工作，作A~pH曲線，尋顯色劑的用量M+nR=MRn定量反應(yīng)理論計算45顯色劑的用量M+nR=MRn定量反應(yīng)理論計c(R)c(R)c(R)實際工作，作A-CR曲線，尋找適宜CR范圍。46c(R)c(R)c(R)實際工作，作A-CR曲線，尋找適溫度的選擇實際工作，作A-T曲線，尋找適宜反應(yīng)溫度。ATATATATAT反應(yīng)時間的選擇實際工作，作A-t曲線，尋找適宜反應(yīng)時間。47溫度的選擇實際工作，作A-T曲線，尋找適宜反應(yīng)溫度。AT測定中的干擾以及消除方法Co2+,Fe3+Co2+FeF63-Co(SCN)2(藍(lán))⑴NaFSCN-Co2+Fe2+,Sn4+(2)Sn2+Co(SCN)2SCN-測Co2+:(掩蔽法)化學(xué)法

48測定中的干擾以及消除方法Co2+,Fe3+Co2+Co(S§5-5吸光光度法應(yīng)用示例單組分的測定；多組分的測定；紫外光度法在生物學(xué)中的應(yīng)用；49§5-5吸光光度法應(yīng)用示例單組分的測定；49純物質(zhì)或共存物質(zhì)不干擾單組分的測定1.金屬離子:Ni-丁二酮肟,Co-鈷試劑2.磷的測定:DNA中含P～9.2%,RNA中含P～9.5%,H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO4·12MoO3+12NH4NO3+12H2O磷鉬黃(κ小)磷鉬(V)藍(lán)(κ大)Sn2+50純物質(zhì)或共存物質(zhì)不干擾單組分的測定1.金屬離子:Ni-丁

κxl1,κyl1,κxl2,κyl2由x,y標(biāo)液在1,2處分別測得.在1處測組分x,在2處測組分y.b)在1處測組分x;在2處測總吸收,扣除x吸收,可求y.c)x,y組分不能直接測定多組分的測定51κxl1,κyl1,κxl2,κyl2由x,y吸光光度法在生物學(xué)中的應(yīng)用蛋白質(zhì)含量測定（氨基酸測定）核酸測定酶及微生物代謝研究52吸光光度法在生物學(xué)中的應(yīng)用蛋白質(zhì)含量測定（氨基酸測定）52第五章紫外-可見吸光光度法§5-1吸光光度法的基本原理§5-2光的吸收定律—郎伯-比耳定律§5-3紫外-可見吸光光度計§5-4實驗條件的選擇§5-5吸光光度法應(yīng)用示例53第五章紫外-可見吸光光度法§5-1吸光光度法的基本原理§化學(xué)分析：常量組分(>1%),Er:0.1%-0.2%

依據(jù)化學(xué)反應(yīng),使用玻璃儀器

化學(xué)分析與儀器分析方法比較儀器分析：微量組分(<1%),Er:1%-5%

依據(jù)物理或物理化學(xué)性質(zhì),需要特殊的儀器例:含F(xiàn)e約0.05%的樣品,稱0.2g,則m(Fe)≈0.1mg重量法

m(Fe2O3)≈0.14mg,稱不準(zhǔn)容量法

V(K2Cr2O7)≈0.02mL,測不準(zhǔn)光度法結(jié)果0.048%～0.052%,滿足要求準(zhǔn)確度高靈敏度高54化學(xué)分析：常量組分(>1%),Er:0.1%-0.2%儀器分析方法分類2.電化學(xué)分析法:依據(jù)物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)及其變化3.色譜法:氣相色譜,液相色譜,毛細(xì)管電泳法4.質(zhì)譜法、熱分析法、放射化學(xué)法等非光譜法（折射法，濁度法，旋光法）（不以光的波長為特征訊號）光譜法分子光譜法UV/Vis,IR,NMR原子光譜法AAS,AES,AFS（以光的吸收、發(fā)射等作用而建立的分析方法，通過檢測光譜的波長和強(qiáng)度來進(jìn)行定性和定量的方法）光學(xué)分析法1.光學(xué)分析法:基于電磁輻射與物質(zhì)的相互作用.55儀器分析方法分類2.電化學(xué)分析法:依據(jù)物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)及吸光光度法

基于被測物質(zhì)的分子

對光

具有選擇吸收的特性而建立的分析方法?！?-1吸光光度法的基本原理

特點(diǎn)

靈敏度高：測定下限可達(dá)10-5-10-6mol·L-1；準(zhǔn)確度能夠滿足微量組分的測定要求：相對誤差2%-5％操作簡便、快速、選擇性好、儀器設(shè)備簡單應(yīng)用廣泛56吸光光度法基于被測物質(zhì)的分子對光具有選擇吸收的特性而一、光的基本性質(zhì)波動性光的傳播速度:c－真空中光速3.0×108m/s－波長，單位：m,cm,mm,m,nm,?

1m=10-6m,1nm=10-9m,1?=10-10m

－頻率，單位：Hz次/秒57一、光的基本性質(zhì)波動性光的傳播速度:c－真空中光速

h－普朗克(Planck)常數(shù)6.626×10-34J·s E－光量子具有的能量單位：J(焦耳)，eV(電子伏特)1eV=1.602×10－19J微粒性光量子，具有能量：58 h－普朗克(Planck)常數(shù)6.626×10-34J結(jié)論:一定波長的光具有一定的能量，波長越長(頻率越低)，光量子的能量越低.單色光：具有相同能量(相同波長)的光.混合光：具有不同能量(不同波長)的光復(fù)合在一起.例如白光.波粒二象性59結(jié)論:一定波長的光具有一定的能量，波長越長(頻率越射線x射線紫外光紅外光微波無線電波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可見光光學(xué)光譜區(qū)60射線x射線紫外光紅外光微波無線電波10-2nm二、物質(zhì)對光的選擇性吸收物質(zhì)的顏色與光的關(guān)系完全吸收完全透過吸收黃色光光譜示意表觀現(xiàn)象示意復(fù)合光61二、物質(zhì)對光的選擇性吸收物質(zhì)的顏色與光的關(guān)系完全吸收完全透過/nm顏色互補(bǔ)光400-450紫黃綠450-480藍(lán)黃480-490綠藍(lán)橙490-500藍(lán)綠紅500-560綠紅紫560-580黃綠紫580-610黃藍(lán)610-650橙綠藍(lán)650-760紅不同顏色的可見光波長及其互補(bǔ)光藍(lán)綠62/nm顏色互補(bǔ)光400-450紫黃綠450-480藍(lán)黃48價電子相對于原子核的運(yùn)動--電子能級;能級差：1-20ev；吸收波長：1.25-0.06m；紫外-可見光譜或電子光譜。2.原子核在其平衡位置附近的相對振動--振動能級;能級差：0.05-1ev；吸收波長：25-1.25m；紅外光譜或分子振-轉(zhuǎn)光譜。3.分子本身繞其重心的轉(zhuǎn)動--轉(zhuǎn)動能級.能級差：0.005-0.05ev；吸收波長：250-25m；遠(yuǎn)紅外光譜或分子轉(zhuǎn)動光譜。物質(zhì)分子內(nèi)部3種運(yùn)動形式及其對應(yīng)能級63價電子相對于原子核的運(yùn)動--電子能級;物質(zhì)分子內(nèi)部3種運(yùn)動三、定性分析與定量分析的基礎(chǔ)定性分析基礎(chǔ)定量分析基礎(chǔ)物質(zhì)對光的選擇吸收ABA在一定的實驗條件下，物質(zhì)對光的吸收與物質(zhì)的濃度成正比。AC增大64三、定性分析與定量分析的基礎(chǔ)定性分析基礎(chǔ)定量分析基礎(chǔ)物質(zhì)對光§5-2光的吸收定律—郎伯-比耳定律郎伯-比耳定律；吸光度與透光度的關(guān)系；偏離郎伯-比耳定律的原因；65§5-2光的吸收定律—郎伯-比耳定律郎伯-比耳定律；1一、郎伯-比耳定律透光度(透射比)Transmittance透光度定義：T取值為0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%入射光I0透射光I66一、郎伯-比耳定律透光度(透射比)Transmittan朗伯定律:(1760)Ab當(dāng)入射光的、吸光物質(zhì)的c一定時，溶液的吸光度A與液層厚度b成正比.比耳定律(1852)Ac 當(dāng)入射光的、液層厚度b

一定時，溶液的吸光度A與吸光物質(zhì)的c成正比.67朗伯定律:(1760)Ab比耳定律(1852)意義：當(dāng)一束平行單色光通過均勻、透明的、非散射的吸光物質(zhì)時，其吸光度與溶液液層的厚度和濃度的乘積成正比。A=lg(I0/I)=abc前提條件：單色光：應(yīng)選用max處測定；吸光質(zhì)點(diǎn)形式不變；

離解、絡(luò)合、締合會破壞線性關(guān)系,應(yīng)控制條件(酸度、濃度、介質(zhì)等)；稀溶液：濃度太大，分子間作用力增強(qiáng)。68意義：當(dāng)一束平行單色光通過均勻、透明的、非散射的吸光物質(zhì)時，吸光度與透光度T：透光度A：吸光度1.00.50ACA100500T%TT=0.0%A=∞T=100.0%A=0.0A=0.434T=36.8%69吸光度與透光度T：透光度A：吸光度1.0ACA100T吸光系數(shù)b:吸光液層的厚度,cmc:吸光物質(zhì)的濃度,g/L,mol/La：比例常數(shù)入射光波長物質(zhì)的性質(zhì)溫度取值與濃度的單位相關(guān)c:mol/La

κ摩爾吸光系數(shù),cm-1·mol–1·Lc:g/La吸光系數(shù),L·g–1·cm-1MolarAbsorptivity70吸光系數(shù)b:吸光液層的厚度,cmc:吸光物質(zhì)的濃度,溶液濃度的測定A＝κbc工作曲線法(標(biāo)準(zhǔn)曲線)朗伯-比耳定律的分析應(yīng)用01.02.03.04.0cA。。。。*0.800.600.400.200.00Axcx吸光度的加和性與吸光度的測量A=A1+A2+…+An71溶液濃度的測定A＝κbc工作曲線法朗伯-比耳定律的分析應(yīng)用二、偏離郎伯-比耳定律的原因AC主要原因非單色光吸光質(zhì)點(diǎn)的相互作用72二、偏離郎伯-比耳定律的原因AC主要原因非單色光吸光質(zhì)點(diǎn)的相§5-3紫外-可見吸光光度計分光光度計的構(gòu)成；分光光度法的靈敏度和準(zhǔn)確度73§5-3紫外-可見吸光光度計分光光度計的構(gòu)成；2174227523紫外-可見分光光度法,UV-VIS0.434光源單色器吸收池檢測器顯示76紫外-可見分光光度法,UV-VIS0.434光源單色器吸收吸光分析法的儀器簡介紫外-可見分光光度計組件光源單色器樣品池檢測器顯示裝置氫燈,氘燈,180-375nm;鹵鎢燈,320-2500nm.基本要求:光源強(qiáng),能量分布均勻,穩(wěn)定作用:將復(fù)合光色散成單色光棱鏡光柵玻璃,350-3200nm,石英,185-4000nm光學(xué)玻璃,石英作用:將光信號轉(zhuǎn)換為電信號,并放大光電池，光電管,光電倍增管,光導(dǎo)攝像管(多道分析器)微安表、檢流計、屏幕、數(shù)字顯示記錄儀77吸光分析法的儀器簡介紫外-可見分光光度計組件光源單色器樣品池氙燈氫燈鎢燈78氙燈氫燈鎢燈26棱鏡：依據(jù)不同波長光通過棱鏡時折射率不同入射狹縫準(zhǔn)直透鏡棱鏡聚焦透鏡出射狹縫白光紅紫λ1λ280060050040079棱鏡：依據(jù)不同波長光通過棱鏡時折射率不同入射狹縫準(zhǔn)直透鏡棱鏡光柵：在鍍鋁的玻璃表面刻有數(shù)量很大的等寬度等間距條痕(600、1200、2400條/mm)。

利用光通過光柵時發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光。波長范圍寬,色散均勻,分辨性能好,使用方便.光柵衍射示意圖M1M2出射狹縫光屏透鏡平面透射光柵80光柵：在鍍鋁的玻璃表面刻有數(shù)量很大的等寬度等間距條痕(600單光束分光光度計可變波長單光束紫外-可見分光光度計示意圖81單光束分光光度計可變波長單光束紫外-可見分光光度計示意圖29吸光光度法的靈敏度與準(zhǔn)確度靈敏度吸光光度法是一種適合于微量組分測定的儀器分析法，檢測限大多可達(dá)10-3~10-4g/L或~g/mL數(shù)量級。準(zhǔn)確度能滿足微量組分測定的要求。一般相對誤差2~5%。82吸光光度法的靈敏度與準(zhǔn)確度靈敏度吸光光度法是一種適合于微量組對摩爾系數(shù)的理解一32+桔紅色508鄰二氮菲κ=1.1104測定工作曲線的斜率即為摩爾吸收系數(shù)摩爾吸收系數(shù)是對吸光物質(zhì)而言，是由吸光物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征，吸光面積等因素決定。靈敏度的表示方法摩爾吸光系數(shù)κ當(dāng)b=1時，AC0κ83對摩爾系數(shù)的理解一32+桔紅色508鄰二氮菲κ=1.1對摩爾系數(shù)的理解二對同一種待測物質(zhì)，不同的方法具有不同的κ，表明具有不同的靈敏度。例：分光光度法測銅銅試劑法測Cuκ426=1.28104Lmol-1cm-1雙硫腙法測Cuκ495=1.58105Lmol-1cm-1一般情況κ

<104

κ

:

104~105

κ

>105低靈敏度中等靈敏度高靈敏度84對摩爾系數(shù)的理解二對同一種待測物質(zhì)，不同的方法具有不同的κ影響準(zhǔn)確度的因素儀器測量誤差吸光定律根據(jù)誤差傳遞公式，有又得濃度測量的相對偏差令得T=0.368=36.8%A=0.434時，儀器測量誤差最小85影響準(zhǔn)確度的因素儀器測量誤差吸光定律根據(jù)誤差傳遞公式，有又1086420204060800.70.40.20.1AT/%Er(36.8)0.434濃度測量的相對誤差與T(或A)的關(guān)系實際工作中，應(yīng)控制T在10～70％,

A在0.15～1.0之間(調(diào)c,b,)861086420204060800.70.40.20.1AT/§5-4實驗條件的選擇測量條件；分析條件；87§5-4實驗條件的選擇測量條件；35測量條件的選擇測量波長的選擇無干擾，選擇測量max有干擾AA待測溶液吸光度的選擇控制A=0.2~0.8T=65%~15%方法選擇C選擇b1非單色光影響小2靈敏度高88測量條件的選擇測量波長的選擇無干擾，選擇測量max有干擾A用參比溶液調(diào)T=100%（A=0），再測樣品溶液的吸光度，即消除了吸收池對光的吸收、反射，溶劑、試劑對光的吸收等。參比溶液I0I參比樣品入射光I0透射光I89用參比溶液調(diào)T=100%（A=0），再測樣品溶參比溶液的選擇原則：扣除非待測組分的吸收以顯色反應(yīng)為例進(jìn)行討論M+R=M-Rmax試液顯色劑溶劑吸光物質(zhì)參比液組成無吸收無吸收光學(xué)透明溶劑基質(zhì)吸收無吸收吸收不加顯色劑的試液無吸收吸收吸收顯色劑基質(zhì)吸收吸收吸收吸收顯色劑+試液+待測組分的掩蔽劑若欲測M-R的吸收A(樣)=A(待測吸光物質(zhì))+A(干擾)+A(池)A(參比)=A(干擾)+A(池)90參比溶液的選擇原則：扣除非待測組分的吸收以顯色反應(yīng)為例進(jìn)行討吸光光度法分析條件的選擇顯色反應(yīng)有機(jī)物質(zhì)官能團(tuán)強(qiáng)吸收直接測定UV-VIS官能團(tuán)弱吸收衍生化反應(yīng)UV-VIS顯色反應(yīng)無機(jī)物質(zhì)通常通過顯色反應(yīng)生成吸光系數(shù)大的有色物質(zhì)進(jìn)行測定，以提高靈敏度。32+桔紅色508鄰二氮菲91吸光光度法分析條件的選擇顯色反應(yīng)有機(jī)物質(zhì)官能團(tuán)強(qiáng)吸收直接測定顯色劑與顯色反應(yīng)：：：：助色團(tuán)－NH，－OH，－X（孤對電子）neO生色團(tuán)：－N＝N－，－N＝O，OC=S,－N（共軛雙鍵）πe92顯色劑與顯色反應(yīng)：：：：助色團(tuán)－NH，－OH，－X（孤顯色反應(yīng)的選擇靈敏度高，一般ε>104;選擇性好;顯色劑在測定波長處無明顯吸收,