云計(jì)算概念和應(yīng)用

云計(jì)算概念與應(yīng)用報(bào)告人:XXX報(bào)告日期:2011/09/29云計(jì)算的概念

什麼是云計(jì)算云計(jì)算的使用方式云計(jì)算架構(gòu)云計(jì)算關(guān)鍵技術(shù)云計(jì)算主要服務(wù)形式云計(jì)算優(yōu)缺點(diǎn)云計(jì)算的應(yīng)用

云計(jì)算市場(chǎng)應(yīng)用舉例目錄云計(jì)算的概念

百度百科：

狹義云計(jì)算是指IT基礎(chǔ)設(shè)施的交付和使用模式，指通過(guò)網(wǎng)絡(luò)以按需、易擴(kuò)展的方式獲得所需的資源；廣義云計(jì)算是指服務(wù)的交付和使用模式，指通過(guò)網(wǎng)絡(luò)以按需、易擴(kuò)展的方式獲得所需的服務(wù)。這種服務(wù)可以是IT和軟件、互聯(lián)網(wǎng)相關(guān)的，也可以是任意其他的服務(wù)，它具有超大規(guī)模、虛擬化、可靠安全等獨(dú)特功效。

KevinHartig： 云是一個(gè)龐大的資源池，你按需購(gòu)買；云是虛擬化的；云可以象自來(lái)水，電，煤氣那樣計(jì)費(fèi)。 JanPritzker：云計(jì)算是用戶友好的網(wǎng)格計(jì)算。什麼是云計(jì)算云計(jì)算的使用方式將計(jì)算和存儲(chǔ)等資源以服務(wù)的方式提供，用戶按需使用，按用量付費(fèi)。4云計(jì)算的概念

云計(jì)算關(guān)鍵特征按需擴(kuò)展和使用快速獲得服務(wù)通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)提供自助式服務(wù)按使用量付費(fèi)5云計(jì)算的概念

云計(jì)算的關(guān)鍵特徵這套架構(gòu)主要可分為四層，其中有三層是橫向的，分別是顯示層、中間件層和基礎(chǔ)設(shè)施層，通過(guò)這三層技術(shù)能夠提供非常豐富的云計(jì)算能力和友好的用戶界面，還有一層是縱向的，稱為管理層，是為了更好地管理和維護(hù)橫向的三層而存在的。接下來(lái)將一個(gè)個(gè)地給大家介紹每個(gè)層次的作用和屬于這個(gè)層次的主要技術(shù)。云計(jì)算的概念

云計(jì)算架構(gòu)7虛擬化領(lǐng)域服務(wù)器虛擬化網(wǎng)絡(luò)虛擬化應(yīng)用虛擬化客戶端虛擬化降低系統(tǒng)復(fù)雜度，提高資源利用率，動(dòng)態(tài)劃分服務(wù)資源，動(dòng)態(tài)部署資源池，統(tǒng)一管理，數(shù)據(jù)更加安全存儲(chǔ)虛擬化網(wǎng)絡(luò)容量的優(yōu)化，網(wǎng)絡(luò)各節(jié)點(diǎn)優(yōu)化交付模式的改變，應(yīng)用能力的按需提供降低終端成本，滿足客戶動(dòng)態(tài)需求虛擬化是將底層物理設(shè)備與上層操作系統(tǒng)、軟件分離的一種去耦合技術(shù)，它通過(guò)軟件或固件管理程序〔Hypervisor〕構(gòu)建虛擬層并對(duì)其進(jìn)行管理，把物理資源映射成邏輯的虛擬資源，對(duì)邏輯資源的使用與物理資源相差很少或者沒(méi)有區(qū)別。虛擬化的目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)IT資源利用效率和靈活性的最大化。云計(jì)算的概念

云計(jì)算關(guān)鍵技術(shù)--虛擬化概念：分布式存儲(chǔ)系統(tǒng)是分布式計(jì)算環(huán)境的基礎(chǔ)架構(gòu)之一，它把分散在網(wǎng)絡(luò)中的存儲(chǔ)資源以統(tǒng)一的視點(diǎn)呈現(xiàn)給用戶，簡(jiǎn)化了用戶訪問(wèn)的復(fù)雜性，加強(qiáng)了分布系統(tǒng)的可管理性，也為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)分布式應(yīng)用準(zhǔn)備了條件?；谠茢?shù)據(jù)中心的分布式存儲(chǔ)系統(tǒng)構(gòu)建在大規(guī)模服務(wù)器群上，面臨以下幾個(gè)挑戰(zhàn)：1〕服務(wù)器等組件的失效將是正?，F(xiàn)象，需解決系統(tǒng)的容錯(cuò)問(wèn)題；2〕提供海量數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)和快速讀??；3〕多用戶同時(shí)訪問(wèn)文件系統(tǒng)，需解決并發(fā)控制和訪問(wèn)效率問(wèn)題；4〕服務(wù)器增減頻繁，需解決動(dòng)態(tài)擴(kuò)展問(wèn)題；5〕需提供類似傳統(tǒng)文件系統(tǒng)的接口以兼容上層應(yīng)用開(kāi)發(fā)，支持創(chuàng)建、刪除、打開(kāi)、關(guān)閉、讀寫(xiě)文件等常用操作。8云計(jì)算的概念

云計(jì)算關(guān)鍵技術(shù)--分佈式存儲(chǔ)GFS的設(shè)計(jì)理念服務(wù)器DOWN機(jī)作為常態(tài)文件用塊存儲(chǔ)每個(gè)塊固定為64MB通過(guò)冗余解決可靠性問(wèn)題每個(gè)塊同時(shí)拷貝在3個(gè)塊服務(wù)器上主服務(wù)器負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)訪問(wèn)和保存元數(shù)據(jù)簡(jiǎn)單化的集中管理定制化的API無(wú)數(shù)據(jù)緩存較大文件塊和流式讀取使得緩存效果不佳9云計(jì)算的概念

云計(jì)算關(guān)鍵技術(shù)--分佈式存儲(chǔ)GFS體系結(jié)構(gòu)10云計(jì)算的概念

云計(jì)算關(guān)鍵技術(shù)--分佈式存儲(chǔ)Catinput|grepxxx|sort|uniq–c|cat>output架構(gòu)11云計(jì)算的概念

云計(jì)算關(guān)鍵技術(shù)--並行編程實(shí)現(xiàn)原理12云計(jì)算的概念

云計(jì)算關(guān)鍵技術(shù)--並行編程13分布式數(shù)據(jù)庫(kù)是對(duì)海量數(shù)據(jù)進(jìn)行存儲(chǔ)和管理。分布式數(shù)據(jù)庫(kù)是一組結(jié)構(gòu)化的數(shù)據(jù)集，邏輯上屬于同一系統(tǒng)，而物理上分散在用計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)連接的多個(gè)場(chǎng)地上，并統(tǒng)一由一個(gè)分布式數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng)管理。與集中式或分散數(shù)據(jù)庫(kù)相比，分布式數(shù)據(jù)庫(kù)具有可靠性高、模塊擴(kuò)展容易、響應(yīng)延遲小、負(fù)載均衡、容錯(cuò)能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。云計(jì)算的概念

云計(jì)算關(guān)鍵技術(shù)--數(shù)據(jù)管理BigTable的設(shè)計(jì)理念面向網(wǎng)頁(yè)數(shù)據(jù)的發(fā)布、搜索和瀏覽等特定處理的需要，簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，并提高性能不支持關(guān)聯(lián)不支持SQL查詢簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)的一致性管理網(wǎng)頁(yè)數(shù)據(jù)的管理對(duì)一致性要求不高簡(jiǎn)化事務(wù)管理網(wǎng)頁(yè)數(shù)據(jù)的處理〔搜索、發(fā)布〕對(duì)事務(wù)管理要求不高面向海量數(shù)據(jù)管理要求設(shè)計(jì)分割和合并管理機(jī)制〔基于元數(shù)據(jù)〕設(shè)計(jì)自動(dòng)伸縮功能〔根據(jù)數(shù)據(jù)量調(diào)整資源用量〕14云計(jì)算的概念

云計(jì)算關(guān)鍵技術(shù)--數(shù)據(jù)管理Bigtable基本架構(gòu)15云計(jì)算的概念

云計(jì)算關(guān)鍵技術(shù)--數(shù)據(jù)管理

在分布式系統(tǒng)中，對(duì)共享資源的并行操作可能會(huì)引起丟失修改、讀臟數(shù)據(jù)、不可重復(fù)讀等數(shù)據(jù)不一致問(wèn)題，這時(shí)需要引入同步機(jī)制，控制進(jìn)程的并發(fā)操作。16云計(jì)算的概念

云計(jì)算關(guān)鍵技術(shù)--分佈式鎖服務(wù)PC硬件資源〔PowerPC、x86、ARM〕操作系統(tǒng)Linux、Windows、UNIX 開(kāi)發(fā)環(huán)境C、C++、Java、Python、Perl等軟件應(yīng)用運(yùn)行庫(kù)〔.Net、JRE〕Cloud共享資源SaaS：通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)向最終用戶提供軟件應(yīng)用服務(wù)。主要特征：多租戶、數(shù)據(jù)分離、水平擴(kuò)展、可個(gè)性配置、可伸縮。代表：SalesforceCRM、微軟的Online服務(wù)、IBMLotusLive。PaaS：通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)向開(kāi)發(fā)者提供運(yùn)行平臺(tái)托管服務(wù)，提供開(kāi)發(fā)SDK，開(kāi)發(fā)者開(kāi)發(fā)應(yīng)用后可直接運(yùn)行在PaaS上。主要特征：運(yùn)行平臺(tái)托管、提供增強(qiáng)的平臺(tái)能力。代表：Google的AppEngine、微軟的AzurePlatform、Salesforce的IaaS：應(yīng)用虛擬化、自動(dòng)化部署等技術(shù)，通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)向用戶提供基礎(chǔ)IT設(shè)施的技術(shù)方案與服務(wù)模式。主要特征是資源動(dòng)態(tài)彈性供應(yīng)、資源整合與共享、資源利用率高、節(jié)能降耗、管理成本下降。主要代表：Amazon的ec2、S317云計(jì)算的概念

云計(jì)算的交付模型(1)軟件即服務(wù)(SaaS)

SaaS服務(wù)提供商將應(yīng)用軟件統(tǒng)一部署在自己的服務(wù)器上，用戶根據(jù)需求通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)向廠商訂購(gòu)應(yīng)用軟件服務(wù)，服務(wù)提供商根據(jù)客戶所定軟件的數(shù)量、時(shí)間的長(zhǎng)短等因素收費(fèi)，并且通過(guò)瀏覽器向客戶提供軟件的模式。這種服務(wù)模式的優(yōu)勢(shì)是，由服務(wù)提供商維護(hù)和管理軟件、提供軟件運(yùn)行的硬件設(shè)施，用戶只需擁有能夠接入互聯(lián)網(wǎng)的終端，即可隨時(shí)隨地使用軟件。這種模式下，客戶不再像傳統(tǒng)模式那樣花費(fèi)大量資金在硬件、軟件、維護(hù)人員，只需要支出一定的租賃服務(wù)費(fèi)用，通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)就可以享受到相應(yīng)的硬件、軟件和維護(hù)服務(wù)，這是網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用最具效益的營(yíng)運(yùn)模式。對(duì)于小型企業(yè)來(lái)說(shuō)，SaaS是采用先進(jìn)技術(shù)的最好途徑。以企業(yè)管理軟件來(lái)說(shuō)，SaaS模式的云計(jì)算ERP可以讓客戶根據(jù)并發(fā)用戶數(shù)量、所用功能多少、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)容量、使用時(shí)間長(zhǎng)短等因素不同組合按需支付服務(wù)費(fèi)用，既不用支付軟件許可費(fèi)用，也不需要支付采購(gòu)服務(wù)器等硬件設(shè)備費(fèi)用，也不需要支付購(gòu)買操作系統(tǒng)、數(shù)據(jù)庫(kù)等平臺(tái)軟件費(fèi)用，也不用承擔(dān)軟件項(xiàng)目定制、開(kāi)發(fā)、實(shí)施費(fèi)用，也不需要承擔(dān)IT維護(hù)部門開(kāi)支費(fèi)用，實(shí)際上云計(jì)算ERP正是繼承了開(kāi)源ERP免許可費(fèi)用只收服務(wù)費(fèi)用的最重要特征，是突出了服務(wù)的ERP產(chǎn)品。目前，是提供這類服務(wù)最有名的公司，GoogleDoc,GoogleApps和ZohoOffice也屬于這類服務(wù)。云計(jì)算的概念

云計(jì)算的使用方式(2)平臺(tái)即服務(wù)(PaaS)把開(kāi)發(fā)環(huán)境作為一種服務(wù)來(lái)提供。這是一種分布式平臺(tái)服務(wù)，廠商提供開(kāi)發(fā)環(huán)境、服務(wù)器平臺(tái)、硬件資源等服務(wù)給客戶，用戶在其平臺(tái)基礎(chǔ)上定制開(kāi)發(fā)自己的應(yīng)用程序并通過(guò)其服務(wù)器和互聯(lián)網(wǎng)傳遞給其他客戶。PaaS能夠給企業(yè)或個(gè)人提供研發(fā)的中間件平臺(tái)，提供應(yīng)用程序開(kāi)發(fā)、數(shù)據(jù)庫(kù)、應(yīng)用服務(wù)器、試驗(yàn)、托管及應(yīng)用服務(wù)。

GoogleAppEngine,Salesforce的平臺(tái)，八百客的800APP是PaaS的代表產(chǎn)品。以GoogleAppEngine為例，它是一個(gè)由python應(yīng)用服務(wù)器群、BigTable數(shù)據(jù)庫(kù)及GFS組成的平臺(tái)，為開(kāi)發(fā)者提供一體化主機(jī)服務(wù)器及可自動(dòng)升級(jí)的在線應(yīng)用服務(wù)。用戶編寫(xiě)應(yīng)用程序并在Google的基礎(chǔ)架構(gòu)上運(yùn)行就可以為互聯(lián)網(wǎng)用戶提供服務(wù)，Google提供應(yīng)用運(yùn)行及維護(hù)所需要的平臺(tái)資源。云計(jì)算的使用方式云計(jì)算的概念

一.云計(jì)算的概念

(3)基礎(chǔ)設(shè)施服務(wù)(IaaS)IaaS即把廠商的由多臺(tái)服務(wù)器組成的“云端〞基礎(chǔ)設(shè)施，作為計(jì)量服務(wù)提供給客戶。它將內(nèi)存、I/O設(shè)備、存儲(chǔ)和計(jì)算能力整合成一個(gè)虛擬的資源池為整個(gè)業(yè)界提供所需要的存儲(chǔ)資源和虛擬化服務(wù)器等服務(wù)。這是一種托管型硬件方式，用戶付費(fèi)使用廠商的硬件設(shè)施。例如AmazonWeb服務(wù)〔AWS〕，IBM的BlueCloud等均是將基礎(chǔ)設(shè)施作為服務(wù)出租。IaaS的優(yōu)點(diǎn)是用戶只需低成本硬件，按需租用相應(yīng)計(jì)算能力和存儲(chǔ)能力，大大降低了用戶在硬件上的開(kāi)銷。目前，以Google云應(yīng)用最具代表性，例如GoogleDocs、GoogleApps、Googlesites，云計(jì)算應(yīng)用平臺(tái)GoogleAppEngine。云計(jì)算的概念

云計(jì)算的使用方式六、云計(jì)算技術(shù)發(fā)展面臨的主要問(wèn)題盡管云計(jì)算模式具有許多優(yōu)點(diǎn)，但是也存在的一些問(wèn)題，如數(shù)據(jù)隱私問(wèn)題、安全問(wèn)題、軟件許可證問(wèn)題、網(wǎng)絡(luò)傳輸問(wèn)題等。

·數(shù)據(jù)隱私問(wèn)題：如何保證存放在云服務(wù)提供商的數(shù)據(jù)隱私，不被非法利用，不僅需要技術(shù)的改進(jìn)，也需要法律的進(jìn)一步完善。

·數(shù)據(jù)安全性：有些數(shù)據(jù)是企業(yè)的商業(yè)機(jī)密，數(shù)據(jù)的安全性關(guān)系到企業(yè)的生存和發(fā)展。云計(jì)算數(shù)據(jù)的安全性問(wèn)題解決不了會(huì)影響云計(jì)算在企業(yè)中的應(yīng)用。

·用戶使用習(xí)慣：如何改變用戶的使用習(xí)慣，使用戶適應(yīng)網(wǎng)絡(luò)化的軟硬件應(yīng)用是長(zhǎng)期而艱巨的挑戰(zhàn)。

·網(wǎng)絡(luò)傳輸問(wèn)題：云計(jì)算服務(wù)依賴網(wǎng)絡(luò)，目前網(wǎng)速低且不穩(wěn)定，使云應(yīng)用的性能不高。云計(jì)算的普及依賴網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的發(fā)展。云計(jì)算的概念

云計(jì)算優(yōu)缺點(diǎn)1.IBM“藍(lán)云〞計(jì)算平臺(tái)“藍(lán)云〞解決方案是由IBM云計(jì)算中心開(kāi)發(fā)的企業(yè)級(jí)云計(jì)算解決方案。該解決方案可以對(duì)企業(yè)現(xiàn)有的基礎(chǔ)架構(gòu)進(jìn)行整合，通過(guò)虛擬化技術(shù)和自動(dòng)化技術(shù)，構(gòu)建企業(yè)自己擁有的云計(jì)算中心，實(shí)現(xiàn)企業(yè)硬件資源和軟件資源的統(tǒng)一管理、統(tǒng)一分配、統(tǒng)一部署、統(tǒng)一監(jiān)控和統(tǒng)一備份，打破應(yīng)用對(duì)資源的獨(dú)占，從而幫助企業(yè)實(shí)現(xiàn)云計(jì)算理念。IBM的“藍(lán)云〞計(jì)算平臺(tái)是一套軟、硬件平臺(tái)，將Internet上使用的技術(shù)擴(kuò)展到企業(yè)平臺(tái)上，使得數(shù)據(jù)中心使用類似于互聯(lián)網(wǎng)的計(jì)算環(huán)境。“藍(lán)云〞大量使用了IBM先進(jìn)的大規(guī)模計(jì)算技術(shù)，結(jié)合了IBM自身的軟、硬件系統(tǒng)以及服務(wù)技術(shù)，支持開(kāi)放標(biāo)準(zhǔn)與開(kāi)放源代碼軟件。IMB“藍(lán)云〞平臺(tái)云計(jì)算應(yīng)用實(shí)例

“藍(lán)云〞基于IBMAlmaden研究中心的云基礎(chǔ)架構(gòu)，采用了Xen和PowerVM虛擬化軟件，Linux操作系統(tǒng)映像以及Hadoop軟件(GoogleFileSystem以及MapReduce的開(kāi)源實(shí)現(xiàn))。IBM已經(jīng)正式推出了基于x86芯片服務(wù)器系統(tǒng)的“藍(lán)云〞產(chǎn)品。以下圖為IBM“藍(lán)云〞的架構(gòu)：云計(jì)算應(yīng)用實(shí)例

IMB“藍(lán)云〞平臺(tái)Thankyou!本文觀看結(jié)束！?。≈x謝欣賞！5-Aza-CdR對(duì)人食管癌細(xì)胞株生物學(xué)行為及TFPI-2mRNA表達(dá)的影響5-Aza-CdR對(duì)人食管癌細(xì)胞株生物學(xué)行為及TFPI-2mRNA表達(dá)的影響杜雅冰，邵應(yīng)舉，樊青霞，孫楨，王琳，趙培榮作者單位：(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南鄭州450002)【摘要】目的探討5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine,5-Aza-CdR)干預(yù)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞株Eca9706生長(zhǎng)增殖及其組織因子途徑抑制物2(tissuefactorpathwayinhibitor-2，TFPI-2)基因表達(dá)的影響。方法選取食管鱗癌細(xì)胞株Eca9706，并用不同濃度的5-Aza-CdR處理該細(xì)胞株。MTT法檢測(cè)干預(yù)前后細(xì)胞增長(zhǎng)率的變化，F(xiàn)CM法檢測(cè)干預(yù)前后細(xì)胞凋亡率的變化，RT-PCR技術(shù)檢測(cè)干預(yù)前后Eca9706細(xì)胞TFPI-2基因mRNA的表達(dá)，免疫組化檢測(cè)干預(yù)前后Eca9706細(xì)胞TFPI-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果食管鱗癌細(xì)胞株Eca9706存在TFPI-2基因超甲基化狀態(tài)，經(jīng)5-Aza-CdR處理后，超甲基化狀態(tài)解除，細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞凋亡率明顯提高(P<0.05);細(xì)胞中TFPI-2蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，同時(shí)mRNA的表達(dá)水平也較處理前明顯提高(P<0.05)。結(jié)論食管癌細(xì)胞系TFPI-2基因超甲基化可抑制其mRNA表達(dá)，當(dāng)其超甲基化解除后，細(xì)胞增殖受到抑制，同時(shí)細(xì)胞凋亡率相應(yīng)提高。

【關(guān)鍵詞】食管癌;組織因子途徑抑制物-2;5-氮雜-2-脫氧胞苷;甲基化;免疫組化;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng);凋亡

ABSTRACT：Objective

Toexploretheeffectsof5-Aza-2-deoxycytidine(5-Aza-CdR)interventiononthegrowthandproliferationofEca9706celllineandproteinexpressionoftissuefactorpathwayinhibitor-2(TFPI-2).Methods

Eca9706celllinewastreatedby5-azaCdRofdifferentconcentrations;MTT，flowcytometry，immunohistochemistryandRT-PCRwereusedtodeterminethecellgrowth，apoptosis，andtheexpressionofTFPI-2geneanditsprotein.Results

Eca9706celllinehadhypermethylationofTFPI-2.Afterdemethylationby5-Aza-CdRtreatment，theproliferationofEca9706wasinhibited，theapoptosisratewasalsoincreasedsignificantlyintheconcentration-dependentmanner.RT-PCRdetectedthatmRNAexpressionofTFPI-2geneinEca9706celllinerecoveredsignificantly(P<0.05).Conclusion

5-Aza-CdRcanslowthegrowthofEca9706cell，increasetheapoptosisrate，reactivatetheTFPI-2genetranscriptionandproteinexpressionbydemethylation.KEYWORDS：esophagealcarcinoma;tissuefactorpathwayinhibitor-2;5-Aza-CdR;methylation;immunohistochemistry;RT-PCR;apoptosis組織因子途徑移植物2(tissuefactorpathwayinhibitor，TFPI-2)是絲氨酸蛋白酶抑制物，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移方面起著重要作用。目前，關(guān)于TFPI-2在食管癌中的基因表達(dá)情況的分析研究尚少。本研究旨在探討TFPI-2基因的失活機(jī)制，并尋找食管癌治療的新靶點(diǎn)。1材料與方法材料RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自北京索萊寶生物科技;標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技;Trizol試劑購(gòu)自MBI公司;RT-PCR試劑盒購(gòu)自MBI公司;5-Aza-CdR購(gòu)自Sigma公司;人食管癌細(xì)胞株Eca9706由鄭州大學(xué)腫瘤生物學(xué)研究室惠贈(zèng)。細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理人食管癌細(xì)胞Eca9706以含10mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃、50mL/LCO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3d消化傳代1次。MTT法檢測(cè)干預(yù)前后細(xì)胞增長(zhǎng)率的變化取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整密度至5×104/mL接種于96孔板，按5-Aza-CdR濃度分為6組：0、、、、、102.4μmol/L，每組復(fù)設(shè)5個(gè)孔。待細(xì)胞貼壁后，分別于24、48、72h后加入MTT液，4h后棄去上清液，每孔加DMSO150μL，在490nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值(absorbance，A)。細(xì)胞增殖抑制率(cellularproliferationinhibitionrate，CPIR)按公式計(jì)算：CPIR=(1-實(shí)驗(yàn)組A均值/對(duì)照組A均值)×100%。流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)干預(yù)前后細(xì)胞凋亡率的變化取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按5×105/mL的密度接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后加藥，分組如下：對(duì)照組(0μmol/L),1.6μmol/L5-Aza-CdR組，25.6μmol/L5-Aza-CdR組，102.4μmol/L5-Aza-CdR組。每組均于5-Aza-CdR作用48h后消化收集細(xì)胞，700mL/L冰乙醇固定，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡測(cè)定。

RT-PCR技術(shù)檢測(cè)TFPI-2基因mRNA的表達(dá)分組同F(xiàn)CM，每組細(xì)胞均5-Aza-CdR作用48h。TFPI-2的上、下游引物分別為5′-GTCGATTCTGCTGTTTTCC-3′和5′-ATGGAATTTTCTTTGGTGCG-3′，合成產(chǎn)物為440bp;β-actin作為內(nèi)參照，上下游引物分別為5′-AGGCATTGTGATGGACTCCG-3′和5′-AGTGATGACCTGGCCGTCAG-3′，合成產(chǎn)物為301bp。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)分析后，按Sigma公司RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit說(shuō)明書(shū)操作。先逆轉(zhuǎn)錄制備單鏈cDNA，再以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用上、下游產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min，然后94℃變性30s,51℃退火30s,72℃延伸30s，循環(huán)30次，最后72℃延伸5min,4℃保溫。擴(kuò)增片段經(jīng)20g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。免疫組化方法檢測(cè)TFPI-2蛋白的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按5×104/mL的密度接種于經(jīng)預(yù)處理的蓋玻片上，待細(xì)胞貼壁后加藥(分組同RT-PCR)。培養(yǎng)48h后加入40g/L多聚甲醛溶液固定30min,30mL/LH2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫下10min,100mL/L動(dòng)物血清封閉，室溫下10min，滴加1∶100的稀釋的TFPI-2抗體4℃過(guò)夜，二抗室溫下1h，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37℃孵育30min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明封片。另取爬片滴加PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定：TFPI-2蛋白陽(yáng)性信號(hào)均呈棕黃色顆粒樣物質(zhì)，位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。光鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野(每個(gè)視野觀察細(xì)胞數(shù)不少于100個(gè))，按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行結(jié)果判定。陽(yáng)性率=(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/1000)×100%。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，采用單因素方差分析加LSD兩兩比較法進(jìn)行分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2結(jié)果干預(yù)前后細(xì)胞增長(zhǎng)率的變化經(jīng)MTT檢測(cè)，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞抑制率明顯高于未加藥組，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增加而增加(表1)。表1不同濃度的5-aza-CdR對(duì)Eca9706細(xì)胞增殖的影響干預(yù)前后細(xì)胞凋亡率的變化流式細(xì)胞儀分析可見(jiàn)，經(jīng)不同濃度5-Aza-CdR誘導(dǎo)48h后，Eca9706細(xì)胞各處理組凋亡率分別為(13.76±0.47)%、(26.97±0.39)%、(41.03±0.19)%，與5-Aza-CdR誘導(dǎo)濃度成正比。與對(duì)照組[(1.39±0.27)%]比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且各濃度組間比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，圖1)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。干預(yù)前后Eca9706細(xì)胞mRNA的表達(dá)情況擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，Eca9706細(xì)胞中TFPI-2mRNA表達(dá)在各用藥組和未用藥組之間有明顯差異，TFPI-2mRNA在未用藥組細(xì)胞中未見(jiàn)表達(dá)。經(jīng)、、102.4μmol/L5-Aza-CdR處理后可見(jiàn)TFPI-2mRNA表達(dá)，說(shuō)明在一定范圍內(nèi)隨5-Aza-CdR藥物濃度的增加TFPI-2mRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)(圖2)。圖1各組流式細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖A：對(duì)照組;B：1.6μmol/L5-Aza-CdR組;C：25.6μmol/L5-Aza-CdR組;D：102.4μmol/L5-Aza-CdR組。圖25-Aza-CdR處理前后Eca9706細(xì)胞TFPI-2mRNA的表達(dá)M：DNAmarker;β-actin：301bp;TFPI-2：440bp;1：對(duì)照組;2：組;3：25.6μmol/L組;4：1.6μmol/L組;5：H2O對(duì)照組。干預(yù)前后TFPI-2蛋白的表達(dá)情況免疫組化結(jié)果顯示，經(jīng)5-Aza-CdR作用Eca9706細(xì)胞48h，TFPI-2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率增加，對(duì)照組、1.6μmol/L組、25.6μmol/L組、102.4μmol/L組TFPI-2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為(2.10±1.42)%、(9.31±2.70)%、(14.72±3.50)%、(68.20±3.20)%，不同濃度組之間以及用藥組與對(duì)照組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，圖3)。圖3各組TFPI-2蛋白的表達(dá)情況3討論人TFPI-2(hTFPI-2)基因定位于7q22區(qū)域，全長(zhǎng)由8164個(gè)堿基組成，其cDNA全長(zhǎng)為1222kb。其mRNA的啟動(dòng)子具有典型的管家基因特征，沒(méi)有典型的TATA盒或CAAT盒，在推定的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域GC含量超過(guò)80%[1]。TFPI-2可在體內(nèi)多種組織廣泛表達(dá)，在這些組織內(nèi)一旦出現(xiàn)腫瘤，TFPI-2的表達(dá)水平也會(huì)隨之顯著下降[2]。有研究證實(shí)，在絨毛膜癌、乳腺癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、纖維肉瘤和胸部惡性腫瘤組織中，與腫瘤產(chǎn)生相關(guān)的TFPI-2表達(dá)水平減少可能與其啟動(dòng)子的甲基化密切相關(guān)[1,3-5]。啟動(dòng)子區(qū)cpG島高甲基化在腫瘤形成機(jī)制中的確切作用尚不清楚，然而眾多證據(jù)說(shuō)明，腫瘤抑癌基因CpG島異常的甲基化導(dǎo)致基因失活和轉(zhuǎn)錄抑制是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一[6-8]。目前，有體外實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR通過(guò)去甲基化作用可使多種含有CpG島的高甲基化抑癌基因重新表達(dá)，從而恢復(fù)抑癌功能[9]。本實(shí)驗(yàn)RT-PCR結(jié)果顯示，TFPI-2在Eca9706細(xì)胞中無(wú)表達(dá)，經(jīng)過(guò)不同濃度的5-Aza-CdR處理Eca9706細(xì)胞后，TFPI-2亦重新出現(xiàn)表達(dá)，且在一定范圍內(nèi)隨藥物誘導(dǎo)濃度的增大表達(dá)逐漸增強(qiáng)。MIZUNO等[10]研究說(shuō)明，腫瘤細(xì)胞中DNMT的表達(dá)較正常的高4～12倍，也證實(shí)DNMT上調(diào)參與腫瘤發(fā)生。這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)可知，經(jīng)過(guò)5-Aza-CdR干預(yù)處理過(guò)的Eca9706細(xì)胞增殖明顯受抑制，且隨著藥物濃度的增加，抑制作用越明顯。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，DNA啟動(dòng)子區(qū)去甲基化能較明顯地抑制食管癌細(xì)胞增殖，并與其誘導(dǎo)劑量呈正相關(guān)，推測(cè)這種抑制作用與去甲基化后重新激活TFPI-2基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)有著直接關(guān)系;此外可能與去甲基化后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。進(jìn)而通過(guò)流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度5-Aza-CdR干預(yù)的Eca9706的細(xì)胞中，用藥組與對(duì)照組相比細(xì)胞凋亡率凋亡率有所增加，并且與5-Aza-CdR誘導(dǎo)劑量有依賴性關(guān)系。BENDER等[11]在同等條件下用5-Aza-CdR處理惡性腫瘤細(xì)胞系和正常纖維細(xì)胞系時(shí)，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞增殖均被抑制，而纖維細(xì)胞增殖不被抑制。因此，5-Aza-CdR對(duì)Eca9706細(xì)胞增殖的抑制及凋亡的增加不是藥物的毒性影響，可能是因?yàn)槭筎FPI-2重新表達(dá)的結(jié)果。目前，國(guó)外以TFPI-2為藥物研究靶點(diǎn)，就TFPI-2在腫瘤治療、腫瘤臨床診斷、促進(jìn)傷口愈合和動(dòng)脈粥樣硬化治療等領(lǐng)域中的應(yīng)用，也正在進(jìn)行廣泛深入的研究。本研究用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR處理人食管癌Eca9706細(xì)胞株，檢測(cè)TFPI-2基因表達(dá)的變化及其對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以期尋找治療腫瘤的新靶點(diǎn)。

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