實驗十模式植物擬南芥TDNA插入突變體的鑒定課件

模式植物擬南芥T-DNA插入突變體的鑒定西南大學(xué)模式植物擬南芥T-DNA插入突變體的鑒定西南大學(xué)目錄擬南芥的栽培擬南芥T-DNA插入突變體的PCR鑒定實驗設(shè)計思路和原理目錄擬南芥的栽培擬南芥T-DNA插入突變體實驗設(shè)計思路和原理2實驗設(shè)計的思路和原理經(jīng)典遺傳學(xué)是從生物的性狀、表型到遺傳物質(zhì)來研究生命的發(fā)生與發(fā)展規(guī)律。一般是隨機(jī)突變基因，從表型變化入手去研究和確定基因的遺傳規(guī)律、結(jié)構(gòu)特征、在染色體上的位置，并克隆基因的序列。反向遺傳學(xué)則是在獲得生物體基因組全部序列的基礎(chǔ)上，通過對靶基因進(jìn)行特定的加工和修飾，如定點(diǎn)突變、插入、缺失、置換等，再研究這些修飾對生物體的表型、性狀可能有何種影響，從而了解基因和其編碼蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的功能。實驗設(shè)計的思路和原理經(jīng)典遺傳學(xué)是從生物的性狀、表型到遺傳3

擬南芥（Arabidopsisthaliana）又稱為阿拉伯芥，是一種十字花科植物，廣泛用于遺傳、發(fā)育和分子生物學(xué)的研究，已成為一種典型的模式植物。該植物具有以下特點(diǎn)：植株形態(tài)個體小，高度只有30cm左右，1個茶杯可種植好幾棵；生長周期快，每代時間短，從播種到收獲種子一般只需8周左右；種子多，每株可產(chǎn)生數(shù)千粒種子；形態(tài)特征簡單，生命力強(qiáng)，用普通培養(yǎng)基就可作人工培養(yǎng)；基因組小，只有5對染色體。擬南芥是嚴(yán)格的閉花自花受粉植物，基因高度純合。易獲通過理化處理

獲得各種功能的突變體。模式植物擬南芥擬南芥（Arabidopsisthaliana）又稱4生長周期形態(tài)結(jié)構(gòu)模式植物擬南芥生長周期形態(tài)結(jié)構(gòu)模式植物擬南芥5突變體的獲得插入突變（insertionalmutagenesis），即將外源DNA隨機(jī)插入到擬南芥基因組中而獲得其突變體。植物中最常見的插入突變方法是T-DNA插入突變。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：Ti質(zhì)粒是土壤農(nóng)桿菌的天然質(zhì)粒，質(zhì)粒上有一段特殊的DNA區(qū)段，當(dāng)農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時，該DNA區(qū)段能自發(fā)轉(zhuǎn)移，插入植物染色體DNA中，Ti質(zhì)粒上的這一段能轉(zhuǎn)移的DNA被叫做T-DNA。T-DNA插入到植物染色體上的位置是隨機(jī)的。如果T-DNA插入某個功能基因的內(nèi)部，特別是插入到外顯子區(qū)，將造成基因功能的喪失。利用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，是獲得植物突變體的一種重要方法。突變體的獲得插入突變（insertionalmutagen6模式植物擬南芥

2000年，擬南芥全部基因組測序已經(jīng)完成，是人類首次完成了一種高等植物的基因組全序列測定。每個單倍染色體組（n=5）的總長只有7000萬個堿基對（只有小麥染色體組長的1/80），預(yù)測共有29,454個基因。這樣科學(xué)家就可以準(zhǔn)確定位插入DNA的位置?，F(xiàn)在，特異性敲除基因的擬南芥種子庫已經(jīng)創(chuàng)建，向全世界的科研人員開放。研究一個特定基因的研究人員可以迅速、便利地在種子文庫中搜索該基因被關(guān)閉的擬南芥品系，然后向擬南芥生物資源中心訂購。模式植物擬南芥2000年，擬南芥全部基因組測序已7T-DNA方向PCR鑒定T-DNA插入突變體的原理T-DNA的長度在10kb左右，一般PCR反應(yīng)不能跨T-DNA擴(kuò)出條帶。WT：兩個等位基因上都能被LP+RP擴(kuò)出，而BP+RP不能擴(kuò)出條帶。HM(純合子)：兩個等位基因上都有T-DNA插入，能被BP+RP擴(kuò)出，而不能LP+RP擴(kuò)出條帶。HZ(雜合子)：兩個等位基因中的一個有T-DNA插入，能被BP+RP和LP+RP擴(kuò)出條帶。T-DNA方向PCR鑒定T-DNA插入突變體的原理T-DNA8實驗?zāi)康?．熟練掌握植物基因組DNA快速提取的方法；2．掌握利用PCR方法鑒定擬南芥T-DNA插入突變體的方法。實驗?zāi)康?．熟練掌握植物基因組DNA快速提取的方法；9野生型（Col）、ibm1突變體（SALK_023533）擬南芥植株IBM1(AT3G07610)是擬南芥中組蛋白修飾酶的編碼基因，能影響植物的諸多的發(fā)育和生殖過程。實驗材料ibm1突變體：開花延遲葉片卷曲果莢短小花粉粒敗育野生型（Col）、ibm1突變體（SALK_023533）擬10ibm1是一個隱性突變：只有純和的突變體植株才有與野生型的性狀差異；雜合的植株表型與野生型一致。如何確定F2代中基因型的分離比是1：2：1？傳統(tǒng)遺傳方法：F2代做測交或者自交；現(xiàn)代分子遺傳方法：PCR鑒定。ibm1是一個隱性突變：只有純和的突變體植株才有與野生型的性11試劑：1.CATB法提取DNA：液氮、2×CTAB抽提緩沖溶液、氯仿：異戊醇=24：1、無水乙醇、70%乙醇、TE2.PCR：ddH2O、Buffer、MgCl2、dNTP、引物（LP、RP、BP）、DNA模版、TaqDNA聚合酶3.電泳：瓊脂糖、Maker、Buffer、EB、TAE儀器：離心機(jī)，水浴鍋，移液器，PCR儀，電泳槽，紫外成像儀實驗器具和試劑試劑：實驗器具和試劑12實驗步驟-擬南芥的栽培一.在播種前將種子進(jìn)行消毒，然后置于4℃冰箱中，使種子在濕潤條件下春化2至3天。二.將春化好的種子播種于有麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基（MS培養(yǎng)基）的培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。三.待幼苗長出后，再選擇茁壯的幼苗移栽到土壤中，置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。實驗步驟-擬南芥的栽培一.在播種前將種子進(jìn)行消毒，然后置于413實驗十模式植物擬南芥TDNA插入突變體的鑒定課件14實驗步驟-擬南芥T-DNA插入突變體PCR鑒定法一.提取植物DNA；二.PCR反應(yīng)；三.瓊脂糖凝膠電泳；實驗步驟-擬南芥T-DNA插入突變體PCR鑒定法一.提取植物15一.提取植物DNA的步驟(略)一.提取植物DNA的步驟(略)16二.PCR鑒定試劑單管I（μl）混合I單管II（μl）混合IIddH2O161601616010×Tapbuffer(Mg2+free)2.5252.525模板DNA（30-50ng/ul）2-2-引物L(fēng)P（10um）110NO引物RP（10um）110110引物BP（10um）NO110dNTP(各2.5mM)220220Tap酶（5U/ul）0.550.55反應(yīng)體系總體積25251.制作反應(yīng)體系（先混合在分裝最后單獨(dú)加模板）二.PCR鑒定試劑單管I（μl）混合I單管II（μl）混合I172.反應(yīng)程序過程溫度/℃時間預(yù)變性945min變性9430s

退火5630s延伸7280s延伸后處理7210min35循環(huán)注意：1.每管分裝多少ul2.標(biāo)記清楚3.反應(yīng)前混合、離心4.蓋溫，防蒸發(fā)2.反應(yīng)程序過程溫度/℃時間預(yù)變性945min變性94318從F1代雜合植株自交產(chǎn)生的后代分離群體，提取了群體中每個單株的基因組DNA，現(xiàn)在需通過PCR方法鑒定每一單株的基因型。LP:JDM17-1NR2RP:JDM17-1F2BP:LBb1.3理論的條帶長度：LP+RP:~1200bpRP+BP:~900bpPCR安排：每小組按10倍準(zhǔn)備混合體系；每個同學(xué)需做一顆植株的鑒定（兩管PCR）。從F1代雜合植株自交產(chǎn)生的后代分離群體，提取了群體中每個單株19三.瓊脂糖凝膠電泳1.用TAE電泳緩沖液配置1％瓊脂糖凝膠；溶膠后加入Goldview染料；2.25uLPCR產(chǎn)物，加5uL上樣緩沖液(6x)混勻；點(diǎn)樣8-10ul于1%瓊脂糖膠上電泳,穩(wěn)壓150Ｖ（5Ｖ/cm）；3.電泳結(jié)束，在紫外成像儀下觀察、拍照，然后分析條帶。4.確定每一株擬南芥的基因型，統(tǒng)計全班的結(jié)果計算群體中的分離比例。三.瓊脂糖凝膠電泳1.用TAE電泳緩沖液配置1％瓊脂糖凝膠；20實驗報告1.電泳圖+分析，確定每個單株的基因型；2.全班基因型統(tǒng)計，計算比例，卡方檢驗。基因型野生型純合子雜合子株數(shù)比例基因型植株編號+/++/ibm1ibm1/ibm1實驗報告1.電泳圖+分析，確定每個單株的基因型；基因型野生型21ThankYou!ThankYou!模式植物擬南芥T-DNA插入突變體的鑒定西南大學(xué)模式植物擬南芥T-DNA插入突變體的鑒定西南大學(xué)目錄擬南芥的栽培擬南芥T-DNA插入突變體的PCR鑒定實驗設(shè)計思路和原理目錄擬南芥的栽培擬南芥T-DNA插入突變體實驗設(shè)計思路和原理24實驗設(shè)計的思路和原理經(jīng)典遺傳學(xué)是從生物的性狀、表型到遺傳物質(zhì)來研究生命的發(fā)生與發(fā)展規(guī)律。一般是隨機(jī)突變基因，從表型變化入手去研究和確定基因的遺傳規(guī)律、結(jié)構(gòu)特征、在染色體上的位置，并克隆基因的序列。反向遺傳學(xué)則是在獲得生物體基因組全部序列的基礎(chǔ)上，通過對靶基因進(jìn)行特定的加工和修飾，如定點(diǎn)突變、插入、缺失、置換等，再研究這些修飾對生物體的表型、性狀可能有何種影響，從而了解基因和其編碼蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的功能。實驗設(shè)計的思路和原理經(jīng)典遺傳學(xué)是從生物的性狀、表型到遺傳25

擬南芥（Arabidopsisthaliana）又稱為阿拉伯芥，是一種十字花科植物，廣泛用于遺傳、發(fā)育和分子生物學(xué)的研究，已成為一種典型的模式植物。該植物具有以下特點(diǎn)：植株形態(tài)個體小，高度只有30cm左右，1個茶杯可種植好幾棵；生長周期快，每代時間短，從播種到收獲種子一般只需8周左右；種子多，每株可產(chǎn)生數(shù)千粒種子；形態(tài)特征簡單，生命力強(qiáng)，用普通培養(yǎng)基就可作人工培養(yǎng)；基因組小，只有5對染色體。擬南芥是嚴(yán)格的閉花自花受粉植物，基因高度純合。易獲通過理化處理

獲得各種功能的突變體。模式植物擬南芥擬南芥（Arabidopsisthaliana）又稱26生長周期形態(tài)結(jié)構(gòu)模式植物擬南芥生長周期形態(tài)結(jié)構(gòu)模式植物擬南芥27突變體的獲得插入突變（insertionalmutagenesis），即將外源DNA隨機(jī)插入到擬南芥基因組中而獲得其突變體。植物中最常見的插入突變方法是T-DNA插入突變。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：Ti質(zhì)粒是土壤農(nóng)桿菌的天然質(zhì)粒，質(zhì)粒上有一段特殊的DNA區(qū)段，當(dāng)農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時，該DNA區(qū)段能自發(fā)轉(zhuǎn)移，插入植物染色體DNA中，Ti質(zhì)粒上的這一段能轉(zhuǎn)移的DNA被叫做T-DNA。T-DNA插入到植物染色體上的位置是隨機(jī)的。如果T-DNA插入某個功能基因的內(nèi)部，特別是插入到外顯子區(qū)，將造成基因功能的喪失。利用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，是獲得植物突變體的一種重要方法。突變體的獲得插入突變（insertionalmutagen28模式植物擬南芥

2000年，擬南芥全部基因組測序已經(jīng)完成，是人類首次完成了一種高等植物的基因組全序列測定。每個單倍染色體組（n=5）的總長只有7000萬個堿基對（只有小麥染色體組長的1/80），預(yù)測共有29,454個基因。這樣科學(xué)家就可以準(zhǔn)確定位插入DNA的位置。現(xiàn)在，特異性敲除基因的擬南芥種子庫已經(jīng)創(chuàng)建，向全世界的科研人員開放。研究一個特定基因的研究人員可以迅速、便利地在種子文庫中搜索該基因被關(guān)閉的擬南芥品系，然后向擬南芥生物資源中心訂購。模式植物擬南芥2000年，擬南芥全部基因組測序已29T-DNA方向PCR鑒定T-DNA插入突變體的原理T-DNA的長度在10kb左右，一般PCR反應(yīng)不能跨T-DNA擴(kuò)出條帶。WT：兩個等位基因上都能被LP+RP擴(kuò)出，而BP+RP不能擴(kuò)出條帶。HM(純合子)：兩個等位基因上都有T-DNA插入，能被BP+RP擴(kuò)出，而不能LP+RP擴(kuò)出條帶。HZ(雜合子)：兩個等位基因中的一個有T-DNA插入，能被BP+RP和LP+RP擴(kuò)出條帶。T-DNA方向PCR鑒定T-DNA插入突變體的原理T-DNA30實驗?zāi)康?．熟練掌握植物基因組DNA快速提取的方法；2．掌握利用PCR方法鑒定擬南芥T-DNA插入突變體的方法。實驗?zāi)康?．熟練掌握植物基因組DNA快速提取的方法；31野生型（Col）、ibm1突變體（SALK_023533）擬南芥植株IBM1(AT3G07610)是擬南芥中組蛋白修飾酶的編碼基因，能影響植物的諸多的發(fā)育和生殖過程。實驗材料ibm1突變體：開花延遲葉片卷曲果莢短小花粉粒敗育野生型（Col）、ibm1突變體（SALK_023533）擬32ibm1是一個隱性突變：只有純和的突變體植株才有與野生型的性狀差異；雜合的植株表型與野生型一致。如何確定F2代中基因型的分離比是1：2：1？傳統(tǒng)遺傳方法：F2代做測交或者自交；現(xiàn)代分子遺傳方法：PCR鑒定。ibm1是一個隱性突變：只有純和的突變體植株才有與野生型的性33試劑：1.CATB法提取DNA：液氮、2×CTAB抽提緩沖溶液、氯仿：異戊醇=24：1、無水乙醇、70%乙醇、TE2.PCR：ddH2O、Buffer、MgCl2、dNTP、引物（LP、RP、BP）、DNA模版、TaqDNA聚合酶3.電泳：瓊脂糖、Maker、Buffer、EB、TAE儀器：離心機(jī)，水浴鍋，移液器，PCR儀，電泳槽，紫外成像儀實驗器具和試劑試劑：實驗器具和試劑34實驗步驟-擬南芥的栽培一.在播種前將種子進(jìn)行消毒，然后置于4℃冰箱中，使種子在濕潤條件下春化2至3天。二.將春化好的種子播種于有麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基（MS培養(yǎng)基）的培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。三.待幼苗長出后，再選擇茁壯的幼苗移栽到土壤中，置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。實驗步驟-擬南芥的栽培一.在播種前將種子進(jìn)行消毒，然后置于435實驗十模式植物擬南芥TDNA插入突變體的鑒定課件36實驗步驟-擬南芥T-DNA插入突變體PCR鑒定法一.提取植物DNA；二.PCR反應(yīng)；三.瓊脂糖凝膠電泳；實驗步驟-擬南芥T-DNA插入突變體PCR鑒定法一.提取植物37一.提取植物DNA的步驟(略)一.提取植物DNA的步驟(略)38二.PCR鑒定試劑單管I（μl）混合I單管II（μl）混合IIddH2O161601616010×Tapbuffer(Mg2+free)2.5252.525模板DNA（30-50ng/ul）2-2-引物L(fēng)P（10um）110NO引物RP（10um）110110引物BP（10um）NO110dNTP(各2.5mM)220220Tap酶（5U/ul）0.550.55反應(yīng)體系總體積25251.制作反應(yīng)體系（先混合在分裝最后單獨(dú)加模板）二.PCR鑒定試劑單管I（μl）混合I單管II（μl）混合I392.反應(yīng)程序過程溫度/℃時間預(yù)變性945min變性9430s

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