SouthernBlot原理及實驗方法

SouthernBlot原理及試驗方法DNA分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)展分別，DNARNA探針進(jìn)展反響。假設(shè)待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)展結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它適宜的技術(shù)進(jìn)展檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。用途：檢測樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態(tài),如是否有點突變、擴(kuò)增重排等。一、試劑變性液：1.5mol/LNaCl，0.5mol/LNaOH。中和液：0.5mol/LTris-HCl(pH=7.0)，1.5mol/LNaCl。20×SSC：3mol/LNaCl，0.3mol/L檸檬酸鈉。100Kpa20分鐘。5mL45mL。。二、器材操作方法DNA。取出凝膠，切去邊緣多于局部，EB染色，在紫外燈下照相〔DNA遷移的距離〕。45分鐘，并溫存地不斷振蕩，使凝膠上ss-DNA，然后用重蒸水沖洗凝膠幾次。分鐘，將凝膠中和至中性。防止凝膠的堿性破壞硝酸纖維膜?！不蛞粔K海綿20SSC3mm的二號濾紙，濾紙兩邊浸沒于20SSC溶液中，在玻璃和濾紙之間，趕掉全部的氣泡。把凝膠底面朝上放在濾紙上，趕走兩層之間消滅的氣泡。20SSC5分鐘，然后放在凝膠外表，兩層之間不行有氣泡。2SSC溶液中浸濕，掩蓋在硝酸纖維膜上，同樣要把氣泡趕走。5—8cm高，略小于濾紙〕，放置在濾紙上，500g的重物，放置過夜。凝膠的點樣與硝酸纖維膜的相對應(yīng)位置用鉛筆或解剖針的針尖做好標(biāo)記。6SSC5分鐘，然后放在濾紙上吸干溶液。再把它夾在兩層濾紙之間，802小時。留意事項pH,防止凝膠的堿性破壞硝酸纖維膜。(2)要留意趕走凝膠和濾紙及硝酸纖維素膜之間的氣泡。SDS-試驗原理及留意事項Osborn一、原理Acr)N，N’—亞甲基雙丙烯酰胺〔Bis〕在催化劑作用下，聚合交聯(lián)而成的具有網(wǎng)狀立體構(gòu)造的凝膠，并以此為支持物進(jìn)展電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳可依據(jù)不同蛋白質(zhì)分子所帶電的電荷，掩蓋了各種蛋白分子間自然的電荷差異。因此，各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在電泳時的遷移率，不再受原有電荷和分子外形的影響，而只是棒長的函數(shù)。SDS—SDS—電泳體系由兩種或兩種以上的緩沖液、pH和凝膠孔徑等所組成。1．樣品的濃縮效應(yīng)在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，含有上、下槽緩沖液(Tris—Gly，pH8.3)、濃縮膠緩HClCl－，Gly(pI＝6.0，pKa=9.7Gly的負(fù)離子，而酸性蛋白質(zhì)也可解離出負(fù)離子。這些離子在電泳時都向正極移動。C1—速度最快(先導(dǎo)離子)，其次為蛋白質(zhì)，GlyC1—很快超過蛋白Gly離子加于提高電泳的區(qū)分率。2．分子篩效應(yīng)蛋白質(zhì)離子進(jìn)入分別膠后，條件有很大變化。由于其pH9.0)，Gly解率急劇下降。此兩項變化，使Gly的移動超過蛋白質(zhì)，上述的高電壓梯度不復(fù)存在，蛋白質(zhì)便在一pH和電壓子質(zhì)量的蛋白質(zhì)來說，應(yīng)，把不同大小的蛋二、留意事項SDS線。不能利用這次的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為下次用。并且SDS-10％誤差，不行完全信任?！踩缪t蛋白〔α-胰凝乳蛋白酶組成的，它們在巰基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此，對于這一對分子量。有的蛋白質(zhì)〔如：電荷特別或構(gòu)造特別的蛋白質(zhì)；帶有較大輔基的蛋白質(zhì)〕不能承受該法測相對分子量。SDS不純引起。印跡法〔blotting〕是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反響來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜〔NC膜〕DNA－RNADNASouthern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)展印跡分析，對RNA的印跡分析稱為NorthernWesternEastern印跡法轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色一般流程：蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-原理：SDS是一種離子性的界面活性劑,它有強(qiáng)離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長碳鏈.當(dāng)SDS與蛋白質(zhì)混合時,它會以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來,而以硫酸根離子外露與水分子作用.大多數(shù)蛋白質(zhì)和SDS的平均結(jié)合量是1:1.4(以重量為單位),而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例之SDS後,由於SDS帶強(qiáng)負(fù)價,使蛋白質(zhì)原先的帶電價微缺乏道,且每單位重量之蛋白質(zhì)帶電價全都(chargedensity),所以打算不同蛋白的泳動速率就只剩下分子大小一項因素WesternBlot常見問題分析***SDS-電泳：膠板洗刷干凈APSTEMED的量要適宜參與試劑后搖勻，使其充分混合，防止局部膠塊聚合不均勻溫度適宜，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻兩塊玻璃板底部要對齊2“微笑”或“倒微笑”條帶？凝膠聚合不均勻，灌膠時候盡量混合均勻，動作輕緩拔梳子要快速，清洗加樣孔要留神，以免把上樣帶扭曲樣品鹽濃度過高會擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度膠板底部有氣泡會影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時留意電泳槽裝置是否適宜***轉(zhuǎn)膜及抗體檢測：1、凝膠腫脹或卷曲？條帶歪斜或漂移？單個或多個白點？轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱？可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min電轉(zhuǎn)儀長期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治”構(gòu)造不緊湊導(dǎo)致。可在兩塊海綿之間墊上少許一般的草紙確保膜和膠塊之間沒有氣泡緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過程留意降溫***背景太