干擾素的制備及檢定

干擾素的制備及檢定(一)原理干抗素是干擾素誘生劑作用于有關(guān)生物細(xì)胞所產(chǎn)生的一類高活性、多功能蛋白質(zhì)。它從細(xì)胞產(chǎn)生和釋放出來以后，又作用于相應(yīng)的其它同種細(xì)胞，使其獲得抗病毒及抗腫瘤等多方面的免疫力。所謂干擾素誘生劑，是指能誘導(dǎo)有關(guān)生物細(xì)胞產(chǎn)生干擾素的一類物質(zhì)。能誘導(dǎo)有關(guān)生物細(xì)胞產(chǎn)生α和β干擾素者稱甲類干擾素誘生劑，如各種動物病毒、細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物等；可誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素的稱為乙類干擾素誘生劑，如脂多糖、鏈球菌毒素、腸毒素A等。在實(shí)際工作中，制備干擾素多采用兩種方法。一是用干擾素誘生劑誘導(dǎo)某些生物細(xì)胞產(chǎn)生干擾素，經(jīng)提取純化并檢定合格后即可使用。該法所用的細(xì)胞多為外周血白細(xì)胞。二是采用基因工程法進(jìn)行生產(chǎn)，即將干擾素基因?qū)氪竽c桿菌內(nèi)，通過培養(yǎng)大腸桿菌來生產(chǎn)干擾素。目前，大規(guī)模生產(chǎn)干擾素主要采用基因工程法。下面僅以用干擾素誘生劑制備人白細(xì)胞干擾素為例介紹干擾素的制備方法。(二)材料和方法1材料細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備(如培養(yǎng)瓶、多孔培養(yǎng)板、溫箱、顯微鏡、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器等)、水浴箱等。2方法(1)制備誘生劑：采用NDVF系弱毒株，以雞胚尿囊液形式保存于－20℃，其血凝滴度穩(wěn)定在1∶640～1∶1280之間。大量繁殖時(shí)，用05%水解乳蛋白稀釋100～1000倍，接種于9日齡雞胚尿囊腔，置37℃培養(yǎng)72h后，收獲尿囊液，效價(jià)測定應(yīng)大于1∶640，無菌檢查應(yīng)合格(2)制備誘生細(xì)胞：無菌采取人外周血(多用人臍帶血，或血庫貯藏血)，置于含肝素（抗凝血）的無菌瓶內(nèi)，于4℃保存不超過24h，誘生細(xì)胞(白細(xì)胞)不單獨(dú)提取，以全血代替。(3)制備粗制干擾素：①加誘生劑，按1ml抗凝全血加0.2ml誘生劑(即NDVF系尿囊液，其血凝滴度不低于1∶640)；②加溫吸附，將加有誘生劑的抗凝全血置37℃水浴中1h，每隔15min晃動一次，使NDVF吸附于白細(xì)胞上。然后以1000r/min離心20min，棄上清，留沉淀物；③加營養(yǎng)液孵育誘生，按抗凝全血的1～2倍量加Eagle營養(yǎng)液于上述沉淀物中，混勻，置35～36℃溫箱內(nèi)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)18～20h；④離心及酸處理，將上述培養(yǎng)物以2000r/min離心30min，取上清，以6mol/L鹽酸將其pH值調(diào)至20，置4℃冰箱5天滅活NDV；⑤中性化，經(jīng)5天酸化后，再用6mol/L氫氧化鈉將pH值調(diào)至72～74，即為粗制干擾素。(4)制備精品干擾素：①KCNS沉淀，取上述粗制干擾素，加KCNS并用2mol/LHCl調(diào)pH值為35，然后以2000r/min離心30min取沉淀；②酒精提取，將沉淀溶于95%酒精(預(yù)冷至－20℃)，用2mol/LNaOH調(diào)pH值為42，以2000r/min離心30min取上清；用2mol/LHCl調(diào)pH值至35，離心后取上清，再將pH值調(diào)至5.6，離心后取上清，最后將pH值調(diào)至71，離心后取沉淀；③過碘酸鈉沉淀，將沉淀溶于PBS中，加過碘酸鈉，并調(diào)pH值為4.5，用50%乙醇10倍稀釋，離心后取上清，將上清液對03mol/L(NH4)2CO3(pH值76)在4℃下透析過夜。sephacrylS200柱層析：將sephacrylS200按要求處理后裝柱(4～5×100cm柱)，用PBS平衡后，加樣(即上述上清液)，用洗液洗脫。洗脫期間用核酸蛋白儀連續(xù)檢測，收集相應(yīng)峰即為精制干擾素。取樣進(jìn)行效價(jià)測定，按結(jié)果進(jìn)行稀釋，分裝并凍干。(三)檢定1效價(jià)測定(1)制備攻擊病毒：將水泡性口炎病毒(VSV)在雞胚成纖維母細(xì)胞上傳代后，再在豬細(xì)胞(IBRS)上傳3～5代，使其對IBRS有良好致病效應(yīng)，其TCID50應(yīng)穩(wěn)定(一般在10-6～10-7之間)。(2)準(zhǔn)備測定細(xì)胞：生長良好的幼齡IBRS單層細(xì)胞。(3)測定：取上述單層細(xì)胞分為若干組，每組加不同稀釋度的干擾素，置37℃孵育20～24h，然后每管均用100個(gè)TCID50的VSV攻擊，置37℃48～72h孵育后，觀察結(jié)果。同時(shí)設(shè)細(xì)胞對照組和病毒對照組。病毒對照組CPE＞75%，正常細(xì)胞對照組CPE=0，即認(rèn)為該測定系統(tǒng)有效。干擾素判定標(biāo)準(zhǔn)是以能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞免受攻擊病毒損害的干擾素最高稀釋度的倒數(shù)作為干擾素的單位。2酸堿度測定取本品10支，加水溶解，精密測量pH值應(yīng)為6～75。3水分測定按磺硫溶液法測定，不得超過3%。4安全試驗(yàn)取本品加水溶解，小鼠尾靜脈注射，48h內(nèi)不得有死亡。5熱原檢查取本品1支，加水溶解，依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。6菌檢取本品3支，無菌水溶解，分別接種到檢查需氧菌、厭氧菌及霉菌用培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)1周，應(yīng)無菌生長。7超敏反應(yīng)取健康豚鼠6只，每只腹腔注射本品適量，連續(xù)3次，于20天后再于耳靜泳注入本品適量，應(yīng)無過敏反應(yīng)現(xiàn)象發(fā)生。(四)注意事項(xiàng)1制備NDVF系弱毒誘生劑時(shí)，種毒應(yīng)無菌檢查合格，且滴度在1∶640以上。收毒時(shí)，應(yīng)將污染的雞胚棄去。2不必從血液中將白細(xì)胞提取出來，因紅細(xì)胞對白細(xì)胞產(chǎn)生干擾素有營養(yǎng)作用。純化的白細(xì)胞產(chǎn)生干擾素效價(jià)不一定高。3酸化的目的是殺死其中的誘生劑NDV，而在pH值20時(shí)，干擾素是穩(wěn)定的。4在常溫下干擾素半衰期很短。故各種操作要在低溫環(huán)境下進(jìn)行，動作要迅速，純化所用試劑要作預(yù)冷處理。干擾素粗品及精品要及時(shí)置低溫下存放。效價(jià)測定時(shí)，干擾素應(yīng)于臨用時(shí)現(xiàn)溶解。白細(xì)胞介素2的制備及檢定優(yōu)爾生門戶網(wǎng)站2009-10-257:38:09作者：優(yōu)爾生白細(xì)胞介素2的制備及檢定(一)原理白細(xì)胞介素2(IL2)是Th細(xì)胞受有絲分裂原或特異性抗原刺激后，并在白細(xì)胞介素1的輔助下，產(chǎn)生的一種可溶性糖蛋白。IL2是體內(nèi)重要的廣譜免疫增強(qiáng)因子，臨床上常用于治療免疫缺陷病及腫瘤等。(二)材料和方法1制備粗制IL2無菌采血，肝素抗凝，用RPMI1640按1∶1將血液稀釋，然后重層于菲可液面上，以1500r/min離心30min，取白細(xì)胞層，用RPMI1640洗2次，按1～3×106細(xì)胞/ml濃度加入10%胎牛血清RPMI1640，注入一裝有磁棒的大瓶中，置37℃攪拌培養(yǎng)4天，取出，分裝于50ml離心管中，1500r/min離心20min，棄上清液，將細(xì)胞懸浮于1%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液中，使細(xì)胞濃度為106細(xì)胞/ml。同時(shí)加入純質(zhì)PHA1～2μg/ml以及多種B淋巴母細(xì)胞株，使其濃度為106細(xì)胞/ml，37℃攪拌培養(yǎng)18～24h后，取出以1500r/min離心30min，取上清，用045μg濾膜過濾除菌，濾液即為粗制IL2。2制備精品IL2(1)硫酸銨沉淀與真空濃縮透析：在4℃下將硫酸銨粉末按50%飽和量加入上述粗制IL2中，攪拌2h，12000g離心30min，取上清液，再加入80%飽和硫酸銨，4℃過夜，次日以12000g離心30min，棄上清液，將沉淀溶于01%PEG6000的1∶2PBS溶液(pH值73)中，置真空負(fù)壓濃縮透析器中透析濃縮至所需容量。(2)SephadexG100凝膠過濾：用2×180cm的過濾柱及PBS(同上)，以80ml/h流速過濾。將各管洗脫液用紫外分光光度計(jì)280nm檢測其OD值。同時(shí)將幾種不同分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白也用相同條件過濾及檢測其OD值，繪出IL2及標(biāo)準(zhǔn)蛋白OD值的曲線。將各管洗脫液過濾除菌后，作白細(xì)胞生物活性試驗(yàn)，按試驗(yàn)結(jié)果繪出曲線，找出具有最高IL2活性的幾管洗脫液，混合后，作下一步精制。(3)BlueSepharose層析：將上述混合后的洗脫液加入BlueSepharose柱中，流速約15ml/h，按每管10ml收集流出液，當(dāng)樣品全部流出柱中以后，用上述PBS洗滌樣品柱，再用梯度NaCl溶液(從0075mol/L至06mol/LNaCl的PBS溶液)洗脫，按2ml/管收集洗脫液。NaCl溶液梯度及流速均由梯度混合器調(diào)節(jié)控制。洗脫完畢后，作各管OD值及NaCl濃度的測定。各管洗脫液過濾除菌后，作出生物活性測定。將峰值前后的數(shù)管洗脫液混合，即為精制的IL2。置－20℃冰箱保存。(三)檢定1活性測定用10%胎牛血清RPMI1640將上述IL2稀釋為50%、25%、125%、625%，而后再將每個(gè)百分濃度以及100%濃度的IL2倍比稀釋，自1∶2至1∶128，將每個(gè)稀釋度分別加入多孔板的孔中，每孔01ml。然后取CT6細(xì)胞株(小鼠的IL2依賴性T細(xì)胞株)，調(diào)整濃度為106細(xì)胞/ml，每孔加入01ml，同時(shí)用培養(yǎng)基代替IL2作對照。將多孔板培養(yǎng)24h后，取出按每孔1μci的濃度加H3標(biāo)記胸腺嘧啶核苷繼續(xù)培養(yǎng)4h。取出后用MESHⅡ細(xì)胞收集器過濾洗滌細(xì)胞，用β計(jì)數(shù)器測定各孔細(xì)胞的cpm。必要時(shí)按此結(jié)果繪出曲