生物化學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué)二

2022/11/211第四節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其應(yīng)用一、蛋白質(zhì)的兩性解離和等到電點(diǎn)二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)三、蛋白質(zhì)的變性作用四、蛋白質(zhì)的沉淀作用五、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)六、蛋白質(zhì)的免疫學(xué)性質(zhì)2022/11/212蛋白質(zhì)分子的大小1.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量1萬至幾萬.2.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定方法根據(jù)化學(xué)組成測定最低相對分子質(zhì)量用物理化學(xué)方法來測蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量2022/11/213一、蛋白質(zhì)兩性解離和等電點(diǎn)蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的側(cè)鏈上存在游離的氨基和羧基，因此蛋白質(zhì)與氨基酸一樣具有兩性解離性質(zhì)，具有特定的等電點(diǎn)（pI）。溶液pH＝pI時(shí)，蛋白質(zhì)所帶正負(fù)電荷相等；

pH＞pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶凈負(fù)電荷；

pH＜pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶凈正電荷。2022/11/214蛋白質(zhì)兩性解離和等電點(diǎn)主要由肽鏈中可解離的功能團(tuán)決定兩性解離：蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)PI：蛋白質(zhì)等離子點(diǎn)：蛋白質(zhì)電泳：用于蛋白質(zhì)的分離鑒定。2022/11/215等電點(diǎn)時(shí)特點(diǎn)：（1）凈電荷為零（2）一定離子強(qiáng)度的緩沖液：等離子點(diǎn)特征常數(shù)（3）多數(shù)蛋白質(zhì)在水中等電點(diǎn)偏酸

堿性AA/酸性AA等電點(diǎn)胃蛋白酶0.21.

血紅蛋白1.76

細(xì)胞色素C2.910.7

菊糖酶0.348.2（4）導(dǎo)電性、溶解度、黏度及滲透壓都最小。等電沉淀和白泳：遷移率與凈電荷量、分子大小、分子形狀等有關(guān)2022/11/216等電點(diǎn)沉淀和電泳：等電點(diǎn)沉淀：遷移率與凈電荷量、分子大小、分子形狀等有關(guān)電泳：帶電粒子在電場中移動的現(xiàn)象稱為電泳2022/11/217蛋白質(zhì)分子在一定pH的溶液中可帶凈的負(fù)電荷或正電荷，故可在電場中發(fā)生移動。不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷量不同，且分子大小也不同，故在電場中的移動速度也不同，據(jù)此可互相分離。2022/11/218二、蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)１．蛋白質(zhì)溶液是膠體溶液維持蛋白質(zhì)的膠體系統(tǒng)穩(wěn)定的因素①1－100nm大小的質(zhì)點(diǎn)在動力學(xué)上是穩(wěn)定的.②某一pH下質(zhì)點(diǎn)帶有同種電荷，互相排斥?？蓸?gòu)成雙電層③質(zhì)點(diǎn)能與溶劑（水）形成水化層，相互間不易靠攏。2022/11/2192.蛋白質(zhì)具有膠體溶液的性質(zhì)

蛋白質(zhì)分子的顆粒直徑已達(dá)1~100nm，處于膠體顆粒的范圍。（親水膠體）蛋白質(zhì)具有膠體溶液的性質(zhì)：布朗運(yùn)動、丁道爾現(xiàn)象、不能透過半透膜、具有吸附力等。2022/11/21103、穩(wěn)定蛋白質(zhì)親水溶膠的兩個(gè)重要因素：水化膜----通過氫鍵與水結(jié)合表面電荷----在非等電點(diǎn)狀態(tài)下，雙電層，帶同性電荷蛋白質(zhì)分子互相排斥。

2022/11/2111蛋白質(zhì)顆粒的表面電荷和水化膜+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用2022/11/21124.蛋白質(zhì)凝膠

凝膠具有脹潤作用：分類：（1）可逆性凝膠

（2）不可逆性凝膠部分破壞水化膜、適當(dāng)加熱和遠(yuǎn)離等電點(diǎn)2022/11/21135.蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應(yīng)用

1、蛋白質(zhì)是生物大分子——不能透過半透膜2、蛋白質(zhì)溶液是穩(wěn)定的膠體溶液——具有親水膠體性質(zhì)3、臨床應(yīng)用——維持有效循環(huán)血量、實(shí)驗(yàn)室透析技術(shù)

2022/11/2114三、蛋白質(zhì)的變性作用吳憲教授是中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)(原北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院)生物化學(xué)系創(chuàng)始人，曾任中國生理學(xué)會會長。他早在20世紀(jì)30年代就提出了蛋白質(zhì)變性理論，在中國和國際生物界有很高的學(xué)術(shù)地位和廣泛的影響。變性復(fù)性2022/11/21151.蛋白質(zhì)變性的本質(zhì)蛋白質(zhì)分子中次級鍵被破壞，引起天然構(gòu)象松散。不涉用共價(jià)鍵的斷裂（肽鍵和二硫鍵），蛋白質(zhì)只有在比較溫和的條件下才傾向于穩(wěn)定。溫和條件指的是：溫度為0℃~40℃，

pH范圍為5.5~9.0，沒有有機(jī)溶劑。2022/11/21162.導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性的因素物理因素高溫、高壓、超聲波、劇烈振蕩、攪拌、X射線和紫外線等；化學(xué)因素強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、尿素、胍、去污劑、重金屬鹽（Hg2＋、Ag+、Pb2＋等）、三氯乙酸、濃乙醇等都能蛋白質(zhì)變性。2022/11/21173.常用的變性劑尿素：與多肽主鏈競爭氫鍵；增加非極性側(cè)鏈在水中的溶解度，從而降低疏水相互作用。CCCNNHHHHOOO蛋白質(zhì)肽鏈尿素分子2022/11/21184.變性蛋白質(zhì)的特點(diǎn)①生物活性喪失：②某些物理化學(xué)性質(zhì)改變：易與相應(yīng)的試劑起化學(xué)反應(yīng)；溶解度降低，易形成沉淀析出；結(jié)晶能力喪失；分子不對稱性加大；粘度增加；紫外吸收光譜有所改變；肽鍵易被酶水解和消化。2022/11/21195.蛋白質(zhì)的復(fù)性當(dāng)變性因素除去后，變性蛋白質(zhì)又可重新回復(fù)到天然構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性。可逆變性（三、四級結(jié)構(gòu)）與不可逆變性（二、三、四）不是所有的變性蛋白都能復(fù)性。大部分蛋白質(zhì)變性后不能恢復(fù)其原有的各種性質(zhì)復(fù)性后的蛋白質(zhì)多數(shù)不能完全恢復(fù)活力。2022/11/2120四、蛋白質(zhì)的沉淀改變穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體溶液的條件時(shí)，穩(wěn)定性就被破壞，蛋白質(zhì)分子相聚集而從溶液中析出，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的沉淀作用。帶正電荷的蛋白質(zhì)脫水作用OH-H+在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)脫水作用帶正電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒聚集而沉淀帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)++++++++++++++----------------OH-H+2022/11/2121沉淀蛋白質(zhì)的方法１、鹽析法(saltingout)：定義，原理，應(yīng)用２、重金屬鹽法：pH>pIPr－＋M＋→PrM↓３、生物堿試劑：三氯乙酸，單寧酸，苦味酸，鎢酸等。４、有機(jī)溶劑法：定義，原理，注意5、加熱沉淀蛋白質(zhì)2022/11/21221.鹽析—中性鹽沉淀

定義：在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽，以破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)，使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出，稱為鹽析作用機(jī)制:中和電荷的同時(shí)破壞水化膜;2022/11/2123

2.重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)分子在PH大于其等電點(diǎn)時(shí)，帶負(fù)電，易與重金屬離子如Hg+、Pb2+、Cu2+等結(jié)合生成不溶于水的蛋白質(zhì)鹽沉淀，引起蛋白質(zhì)變性。人誤食重金屬鹽中毒是因?yàn)橹亟饘冫}與蛋白質(zhì)沉淀變性有關(guān)，臨床上采用口服大量新鮮牛奶、豆?jié){搶救重金屬中毒的病人，就是根據(jù)牛奶、豆?jié){等蛋白質(zhì)能與重金屬鹽結(jié)成不溶沉淀物，可阻止機(jī)體對重金屬鹽的吸收。然后用催吐劑將結(jié)合的重金屬嘔吐出來，達(dá)到搶救目的。2022/11/21243.生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)分子在PH小于其等電點(diǎn)時(shí)，帶正電，易于生物堿（苦味酸、三氯乙酸、磺基水楊酸等）結(jié)合，生成不溶性鹽，引起蛋白質(zhì)變性。臨床上用三氯乙酸作尿蛋白的檢測試劑。

2022/11/21254.有機(jī)溶劑沉淀法與水互溶的有機(jī)溶劑，如酒精、甲醇等破壞蛋白質(zhì)水化層，使得蛋白質(zhì)沉淀。（在等電點(diǎn)下效果更好）但是常溫下，有機(jī)溶劑會引起蛋白質(zhì)的變性，如酒精滅菌，而在低溫下蛋白質(zhì)變性減慢。因此利用有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)，為防止蛋白質(zhì)變性，可在低溫下進(jìn)行，嚴(yán)格控制引起變性的各種因素。2022/11/21265.加熱沉淀蛋白質(zhì)加熱使蛋白質(zhì)變性沉淀蛋白質(zhì)變性和沉淀是二個(gè)不同概念蛋白質(zhì)變性不一定沉淀蛋白質(zhì)沉淀也不一定變性2022/11/2127五、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)蛋白質(zhì)分子中某些氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)和肽鍵，可發(fā)生一些顏色反應(yīng)。它們可用于某氨基酸的鑒定、蛋白質(zhì)定性試驗(yàn)和定量測定。

2022/11/2128五、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)就是氨基酸某些基團(tuán)及肽鍵與一定試劑所產(chǎn)生的化學(xué)反應(yīng)。利用這些反應(yīng)，可對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量測定。但是這些化合反應(yīng)不是蛋白質(zhì)的特征反應(yīng)，在鑒定蛋白質(zhì)時(shí)，除利用這些方法外，還必須結(jié)合蛋白質(zhì)的其它性質(zhì)考慮。2022/11/21291.雙縮脲反應(yīng)

蛋白質(zhì)與堿性Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物反應(yīng)這是蛋白質(zhì)分子中肽鏈的反應(yīng)。肽鏈越多，反應(yīng)顏色越深。氨基酸無此反應(yīng)。可用于蛋白質(zhì)定量、定性，也可用于蛋白質(zhì)水解程度的測定

2022/11/21302.福林試劑反應(yīng)（酚試劑反應(yīng)）福林試劑：磷鉬酸-磷鎢酸在堿性條件下，蛋白質(zhì)與硫酸銅發(fā)生反應(yīng)蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物，將福林試劑還原，產(chǎn)生磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物2022/11/21313.乙醛酸反應(yīng)在蛋白質(zhì)溶液中加入HCOCOOH，將濃硫酸沿管壁緩慢加入，不使相混，在液面交界處，即有紫色環(huán)形成。色氨酸的反應(yīng)（吲哚環(huán)的反應(yīng)）鑒定蛋白質(zhì)中是否含有色氨酸2022/11/21324.茚三酮反應(yīng)在PH5.7時(shí)，蛋白質(zhì)與茚三酮可產(chǎn)生顏色反應(yīng)。可用于蛋白質(zhì)的定性和定量。2022/11/2133六、蛋白質(zhì)的免疫學(xué)性質(zhì)抗原：指能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并能與相應(yīng)的抗體特異性結(jié)合的物質(zhì)?？贵w：由相應(yīng)抗原刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)而由β-淋巴細(xì)胞新產(chǎn)生的免疫球蛋白。換句話說，抗體是動物針對外來物質(zhì)的出現(xiàn)而合成的一種蛋白質(zhì)。免疫反應(yīng)：指抗原與抗體所引起的反應(yīng)。過敏反應(yīng)：免疫反應(yīng)拌有組織損傷或生理功能紊亂。2022/11/2134第五節(jié)蛋白質(zhì)的提取、分離和純化的基本原理蛋白質(zhì)的分離純化是研究其結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)。在生物制藥工業(yè)中，蛋白質(zhì)、酶、多肽類激素等藥物生產(chǎn)制備都涉及到蛋白質(zhì)分離純化的問題。蛋白質(zhì)分離純化的工藝過程，既要考慮盡可能的除去雜蛋白，又要保持目的蛋白的產(chǎn)量，也就是要提高回收率。2022/11/2135一、提取1.選材：新鮮、富含目的蛋白且來源方便

2.組織細(xì)胞的粉碎：胞內(nèi)及膜中蛋白

1）物理法：如超聲、勻漿、加砂研磨、高壓擠壓等

2）化學(xué)法：如EDTA、SDS等

3）酶法：如自溶法、外加酶法（纖維素酶、果膠酶、溶菌酶等）

3.提?。哼m當(dāng)溶媒、適當(dāng)條件、適當(dāng)提取時(shí)間和次數(shù)、溶菌酶處理（分解肽聚糖）或用表面活性劑處理。2022/11/2136二、分離純化

從組織細(xì)胞中提取的蛋白質(zhì)溶液，含有許多不同分子量的蛋白質(zhì)，要獲取目的蛋白，須進(jìn)一步分離純化，將目的蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)分開。分離原理及原則：利用欲分離蛋白質(zhì)的溶解度、分子大小、電荷、吸附性質(zhì)、對配體分子的特殊的親和力。從混雜蛋白質(zhì)中分離出一個(gè)特殊蛋白質(zhì)。2022/11/2137基本步驟選材組織細(xì)胞破碎：機(jī)械法、物理法、化學(xué)法、酶法。提?。哼x用適當(dāng)?shù)娜軇┓蛛x純化：根據(jù)等分離蛋白質(zhì)的特異理化性質(zhì)設(shè)計(jì)分離純化方法。結(jié)晶：結(jié)晶過程本身也伴隨著一定程度的純化。鑒定、分析：純度、含量、相對分子質(zhì)量等。2022/11/2138

（一）根據(jù)溶解度不同的分離方法

利用各種蛋白質(zhì)的溶解度差異進(jìn)行分離。影響蛋白質(zhì)溶解度的因素有PH值、離子強(qiáng)度、溶液的介電常數(shù)等，各種蛋白質(zhì)的溶解度取決于它們的分子結(jié)構(gòu)，如：氨基酸組成、極性和非極性基團(tuán)的多少等。2022/11/21391.等電點(diǎn)沉淀

蛋白質(zhì)在PI使溶解度最小，此方法常與其它分離方法配合使用。2022/11/21402.鹽析沉淀

不同蛋白質(zhì)可通過加入不同飽和度的中式鹽分別沉淀出來（即分級沉淀）。常用飽和硫酸銨來沉淀蛋白質(zhì)。此法可用于工業(yè)大規(guī)模分離。2022/11/2141

3.低溫有機(jī)溶劑沉淀

利用有機(jī)溶劑能降低在Pro水中的溶解度，使蛋白質(zhì)沉淀。常用的有機(jī)溶劑有乙醇、甲醇、丙酮等。在低溫下操作，有機(jī)溶劑一般需預(yù)冷（-40℃），緩慢加入。2022/11/2142溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響：在一定范圍內(nèi)，0~40℃之間，大部分球狀蛋白質(zhì)隨溫度升高而溶解度增大（血紅蛋白除外，0~25℃隨隨溫度升高而溶解度降低）；在40~50℃以上，大部分蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，開始變性。所以大多數(shù)蛋白質(zhì)的分離在低溫下操作。

2022/11/2143（二）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的分離方法1.透析:是將待提純的Pro溶液在裝在半透膜的透析袋里，放入蒸餾水中進(jìn)行的，透析液可以進(jìn)行更換，直至透析袋內(nèi)無機(jī)小分子物質(zhì)降到最低點(diǎn)為止。超濾:是利用壓力或離心力，強(qiáng)行使水和其他小分子物質(zhì)通過半透膜。而蛋白質(zhì)截留在膜上。市場上有各種規(guī)格的半透膜出售，可根據(jù)目的蛋白的分子量選擇不同孔徑的膜。

2022/11/21442.分子篩層析（凝膠過濾、排阻層析）又稱凝膠過濾、分子排阻層析，它是根據(jù)分子量大小分離混合物最有效的方法之一。凝膠過濾所用的介質(zhì)是凝膠珠，內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠的膠聯(lián)度或孔度（網(wǎng)孔大?。Q定凝膠的分級范圍，即能被該凝膠分離開來的Pro混合物的分子量范圍。

2022/11/21453.密度梯度離心每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時(shí)，即停止不前，在離心管中被分離成各自獨(dú)立的區(qū)帶。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度等。密度梯度在管內(nèi)分布是管底的密度大，向上逐漸減少，待分離混合物平鋪在梯度的頂端，離心采用水平轉(zhuǎn)頭高速進(jìn)行。2022/11/2146（三）根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性的分離方法在一定PH下，不同蛋白質(zhì)所帶的電荷數(shù)量和性質(zhì)不同。2022/11/21471.電泳

在外電場作用下，帶電顆粒向與其電性相反的電極移動。帶電顆粒在電場中的泳動速度取決于它所帶的凈電荷量以及顆粒的大小和形狀。常用電泳的方法有：1）醋酸纖維薄膜電泳：2）聚丙烯酰胺凝膠電泳3）等電點(diǎn)聚焦電泳：、4）免疫電泳：、2022/11/21482.離子交換層析指一