鐵皮石斛組培方案

鐵皮石斛組培方案鐵皮石斛組培方案鐵皮石斛組培方案xxx公司鐵皮石斛組培方案文件編號(hào)：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準(zhǔn)審核制定方案設(shè)計(jì)，管理制度鐵皮石斛組織培養(yǎng)方案報(bào)告實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私忤F皮石斛培養(yǎng)的方法和步驟，熟練掌握外植體的取材、消毒、接種、初代培養(yǎng)的操作過程。實(shí)驗(yàn)器材超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、電磁爐、長鑷子、培養(yǎng)皿、酒精燈、接種工具、燒杯、玻璃棒、移液管、培養(yǎng)箱、剪刀、培養(yǎng)瓶等。實(shí)驗(yàn)步驟配方：根據(jù)不同階段，培養(yǎng)基配方有所差異。如表1表1各種培養(yǎng)基配方不同階段培養(yǎng)基備注愈傷組織（原球莖）的誘導(dǎo)MS+L6-BA+3%蔗糖+%瓊脂pH=原球莖的增殖MS+20%馬鈴薯+3%蔗糖+%瓊脂pH=原球莖的分化MS+20%馬鈴薯+LNAA+3%蔗糖+%瓊脂pH=幼株的生根壯苗MS+10%香蕉+LNAA+3%蔗糖+%瓊脂pH=配制（以1000ml幼株的生根壯苗培養(yǎng)基為例）10%香蕉（w/w）+MS+3%蔗糖（w/w）+%瓊脂（w/w）+LNAA1）量取800ml蒸餾水于潔凈的大燒杯中，加熱至沸騰；2）準(zhǔn)確稱量100g香蕉果肉，切成碎片狀，并倒入上述燒杯中，加熱煮沸5min，其間攪拌使之充分溶解；3）按照大量、微量、Fe2+鹽、有機(jī)Ⅰ、有機(jī)Ⅱ順序，量取MS各種母液于盛有50ml蒸餾水的燒杯，混合均勻；4）將2）和3）的溶液混合，然后加入30g蔗糖，并移取2mlNAA（ml），混合均勻；5）加熱至沸騰，加入8g瓊脂并煮沸5min，其間不斷攪拌使之充分溶解；6）冷卻至50±5℃時(shí)，調(diào)pH至—。分裝于培養(yǎng)瓶內(nèi)，瓶。注意事項(xiàng)：①溶解香蕉的蒸餾水盡可能多，以確保香蕉各種成分完全溶解；②各種母液混合時(shí)，要按照大量、微量、Fe2+鹽、有機(jī)Ⅰ、有機(jī)Ⅱ的順序；③煮沸時(shí)，小心溶液溢出；④分裝時(shí)不要污染培養(yǎng)瓶瓶口。滅菌：1）檢查滅菌鍋的水位、電源、排氣閥、排氣管、安全閥以及壓力表，確保滅菌鍋各指標(biāo)和功能的正常，以防事故發(fā)生；2）把帶滅菌的培養(yǎng)基裝入鍋內(nèi)，蓋上鍋蓋，對稱而均勻地扭緊螺絲；3）打開電源和排氣閥，調(diào)節(jié)電壓至220V；4）待排氣閥排除水蒸氣30s—1min后，關(guān)閉排氣閥；5）當(dāng)溫度上升到121℃后，調(diào)節(jié)電壓至135V，保持20min；6）關(guān)閉電源，使之自動(dòng)降溫至0℃。10min后，打開排氣閥和鍋蓋；7）5—10min后，取出培養(yǎng)基放于試驗(yàn)臺(tái)上冷卻，待用。表2滅菌時(shí)間統(tǒng)計(jì)階段單鍋滅菌（耗時(shí)64min）多鍋連續(xù)滅菌第一鍋（耗時(shí)63min）第二鍋（耗時(shí)46min）起始22:218:049:30排氣22:418:239:43T=121℃22:508:329:50關(guān)閉電源23:108:5210:10氣壓降至023:259:0710:16注意事項(xiàng)：①啟動(dòng)滅菌前，應(yīng)檢查水位、電源、排氣閥、安全閥、排氣管等，確保正常；②滅菌鍋底部應(yīng)鋪墊一層報(bào)紙，以防培養(yǎng)瓶機(jī)械破損；③滅菌電壓不宜超過220V，否則滅菌鍋會(huì)劇烈搖晃，造成不必要的損害和安全隱患；④當(dāng)溫度達(dá)到121℃后，調(diào)節(jié)電壓至135V，并且時(shí)不時(shí)注意溫度的變化，確保溫度介于121-122℃之間；⑤氣壓降至0后，不宜立即揭蓋；最好在5-10min后揭蓋，這樣才能緩和內(nèi)外“氣壓和溫度差”；⑥揭蓋5-10min后，再轉(zhuǎn)移鍋內(nèi)培養(yǎng)基，以免燙傷。⑦每鍋只能滅菌18瓶轉(zhuǎn)接轉(zhuǎn)接前準(zhǔn)備1）培養(yǎng)皿、鑷子、剪刀等轉(zhuǎn)接用具的滅菌（可以在培養(yǎng)基滅菌時(shí)附帶）；2）檢查超凈臺(tái)內(nèi)各種用具，及時(shí)補(bǔ)充酒精燈的酒精，確保用具齊全；3）放置待轉(zhuǎn)接材料和待接入培養(yǎng)基，以“方便操作為宜”而陳列；轉(zhuǎn)接1）揭去防塵膜，打開電源、通風(fēng)和紫外燈，滅菌15—20min；2）關(guān)掉紫外，打開白熾燈，用75%酒精仔細(xì)擦拭手指、指甲、材料瓶瓶蓋及蓋邊緣、工作區(qū)等處，確保“消毒”徹底；3）點(diǎn)燃酒精燈，用無菌鑷子把材料夾取于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，挑選生命力旺盛的植株用于轉(zhuǎn)接；4）用無菌剪刀修去多余的根系，“雙鑷子”法將材料轉(zhuǎn)接于新的培養(yǎng)基中；5）標(biāo)注相關(guān)日期和品系，轉(zhuǎn)至培養(yǎng)室培養(yǎng)。注意事項(xiàng)①操作時(shí)，所有用具均不能從“核心工作區(qū)”和開啟的培養(yǎng)瓶上面晃過，防止細(xì)菌落入而導(dǎo)致污染；②在打開材料瓶和培養(yǎng)瓶后，其蓋均在酒精燈外焰灼燒3-5s，瓶口灼燒5-10s；蓋瓶蓋時(shí)，亦如此操作；③轉(zhuǎn)接時(shí)，確保手一直在超凈臺(tái)內(nèi)，以免帶入外界細(xì)菌。培養(yǎng)：培養(yǎng)條件：白熾燈12h/黑暗12h＋20℃PDA培養(yǎng)基的配制方法，培養(yǎng)基的濕熱滅菌操作一、目的要求1．學(xué)習(xí)并掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。2．學(xué)習(xí)并掌握棉塞的制作方法。二、培養(yǎng)基的配制原理培養(yǎng)基是人工配制的各種營養(yǎng)物質(zhì)供微生物生長繁殖的基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。在自然界中，微生物種類繁多，營養(yǎng)類型多樣，加上實(shí)訓(xùn)和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多，但不論是何種培養(yǎng)基，均應(yīng)含有水分、碳源、氮源、能源、無機(jī)鹽等。不同微生物對pH值要求不一樣，所以配制培養(yǎng)基時(shí)，還應(yīng)根據(jù)不同微生物對pH值的要求，將培養(yǎng)基調(diào)到合適的pH值范圍。三、實(shí)訓(xùn)材料和用具瓊脂，可溶性淀粉，葡萄糖，10﹪NaOH，10﹪HCl，1mol／LNaOH，lmol／LHCl，KNO3，NaCl，K2HPO4·3H20，MgSO4·7H20，F(xiàn)eSO4·7H2O；試管，三角瓶，燒杯，量筒，玻璃棒，天平，牛角匙，PH試紙，棉花，牛皮紙，記號(hào)筆，紗布，四、操作方法與步驟(一)培養(yǎng)基的配制PDA培養(yǎng)基的配制其配方如下：土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂15～20g，水1000mL，pH值自然。(1)稱量和熬煮藥品實(shí)際用量計(jì)算后，按培養(yǎng)基配方逐一稱取去皮土豆。土豆切成小塊放入鍋中，加水1000ml，在加熱器上加熱至沸騰，維持20－30min，用可用2層紗布趁熱在量杯上過濾，濾渣棄取。濾液補(bǔ)充水分到1000ml。(2)加熱溶解把濾液放入鍋中，加入葡萄糖20g，瓊脂15～20g（提前搞碎），然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，待瓊脂完全溶解后，再補(bǔ)充水分至所需量。(3)分裝按實(shí)訓(xùn)要求，將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或500ml三角瓶內(nèi)。分裝時(shí)可用三角漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上造成污染。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的1／5，滅菌后制成斜面，分裝入三角瓶內(nèi)以不超過其容積的一半為宜；半固體培養(yǎng)基以試管高度的1／3為宜，滅菌后垂直待凝。(4)加棉塞培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角燒瓶口上塞上棉塞(或泡沫塑料塞或試管帽等)，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)造成污染，并保證有良好的通氣性能。(5)包扎加塞后，將全部試管用麻繩或橡皮筋捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道線繩或橡皮筋扎好，用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期。(二)棉塞的制作棉塞的作用有二：一是防止雜菌污染；二是可過濾空氣，保證通氣良好，并可減緩培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)，所以正確地制備棉塞是培養(yǎng)基制備中重要的一環(huán)。正確的棉塞是形狀、大小，松緊應(yīng)與試管口(或三角燒瓶)完全適合。過緊則妨礙空氣流通，操作不便；過松時(shí)，空氣會(huì)毫無障礙地進(jìn)入試管(或三角燒瓶)中，達(dá)不到滅菌的目的。棉塞過小往往易掉進(jìn)試管內(nèi)，因此棉塞質(zhì)量的優(yōu)劣對實(shí)訓(xùn)的結(jié)果有很大的影響。正確的棉塞頭較大，加塞時(shí)，應(yīng)使棉塞長度的1／3留在試管口外，2／3在試管口內(nèi)（見實(shí)訓(xùn)圖6-4）。目前，有條件的實(shí)訓(xùn)室已使用堅(jiān)固的塑料試管帽、金屬試管帽、硅膠泡沫塞替代棉塞，制作棉塞要選纖維較長的棉花，一般不選用脫脂棉。因?yàn)樗菀孜儩?，造成污染，而且價(jià)格也貴。棉塞制作方法見圖6-5實(shí)圖6-4棉塞實(shí)圖6-5棉塞的制作方法（三）斜面與平板培養(yǎng)基的制作斜面與平面培養(yǎng)基是常用的瓊脂固體培養(yǎng)基。將熬制好的瓊脂培養(yǎng)基趁熱裝入試管滅菌后擺鞋面，凝固后即成斜面培養(yǎng)基。斜面培養(yǎng)基常用于菌種培養(yǎng)、菌種保藏等工作。將滅菌后的瓊脂培養(yǎng)基傾注于無菌培養(yǎng)皿中，凝固后即成平板培養(yǎng)基。平板培養(yǎng)基常用于分離菌種、菌落計(jì)數(shù)、菌落形態(tài)觀察及菌種鑒定等。斜面與平板培養(yǎng)基的制作過程大致為：溶解原料、融化瓊脂、調(diào)PH、分裝、滅菌和制斜面或平板。1、溶解原料為加速原料的溶解，最好用熱水。先將原料依次加入到占配制量一半的水中，待全部溶解后在加足水量。如配方中有馬鈴薯、麩皮、胡羅卜、豆芽等天然原料，需將其熬制約30min，取出定量濾液，在將所需的其他原料加入濾液中。

2、融化瓊脂

瓊脂的用量可靈活掌握。用作保藏菌種的培養(yǎng)基，瓊脂用量可提高至%，以增加持水性。冬季的氣溫低，瓊脂用量可適當(dāng)減少。瓊脂用前可剪成小段，以利于融化。待溶液煮沸是再加入，不斷攪拌至完全無瓊脂塊狀物時(shí)再停止加熱。

3、調(diào)整PH

用潔凈干燥的玻璃棒沾一點(diǎn)培養(yǎng)基滴在試紙上，立即與比色板比較。一般用10%NaOH或HCl調(diào)節(jié)。

4、分裝

將培養(yǎng)基趁熱倒入墊有紗布的漏斗中，使培養(yǎng)基直接濾至試管或三角瓶中，試管裝量一般為管高的1/4左右，三角瓶的裝量約為其容量的一半。勿使培養(yǎng)基玷污容器口部?？诓咳忻奕嚬苊?或9支扎一捆，棉塞外面包牛皮紙，以防在滅菌過程中被水汽打濕。5、滅菌分裝后的培養(yǎng)基應(yīng)隨即滅菌。除特殊情況外，一般培養(yǎng)基均用高壓蒸汽滅菌，在104kPa壓力下，滅菌20-30min。6、制作斜面或平板將滅菌后的試管趁熱斜置于棍條上，傾斜度以試管中的培養(yǎng)基約占試管長度的1/2為宜，凝固后即成斜面培養(yǎng)基。待滅菌后三角瓶內(nèi)的培養(yǎng)基冷卻至45~50時(shí)，以無菌操作法向無菌培養(yǎng)皿中倒入培養(yǎng)基，裝置以剛覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿底部為宜（約15ml）,凝固后即成平板培養(yǎng)基。五、高壓蒸汽滅菌法該法使用高壓滅菌鍋，在121℃，O．105MPa壓力下滅菌15～30min。微生物實(shí)訓(xùn)所需的一切器皿、器具、培養(yǎng)基(不耐高溫者除外)、無菌水、工作服等物品都可用此法滅菌。高壓蒸汽滅菌鍋是能耐一定壓力的密閉金屬鍋，有立式或臥式(實(shí)圖8-1、2)兩種。滅菌鍋上附有壓力表、排氣閥、安全閥、加水口、排水口等。臥式滅菌鍋還附有溫度計(jì)。有的還有蒸汽人口。滅菌鍋的加熱源有電、煤氣和蒸汽三種。高壓蒸汽滅菌的操作過程(1)加水將滅菌鍋內(nèi)層滅菌桶取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，以水面與三角架相平為宜。立式鍋是直接加水至鍋內(nèi)底部隔板以下1／3處。有加水口者由加水口加入至止水線處。(2)裝料將裝料桶放回鍋內(nèi)，裝入待滅菌的物品。放置裝有培養(yǎng)基的容器時(shí)要防止液體溢出，瓶塞不要緊貼桶壁，以防冷凝水沾濕棉塞。(3)加蓋擺正鍋蓋，對齊螺口，然后以同時(shí)旋緊相對的兩個(gè)螺栓的方式擰緊所有螺栓，打開排氣閥。(4)排氣用電爐或煤氣加熱，待水煮沸后，水蒸氣和空氣一起從排氣孔排出。一般認(rèn)為，當(dāng)排氣流很強(qiáng)并有噓聲時(shí)，表明鍋內(nèi)空氣已排凈(沸后約5min)。(5)升壓當(dāng)鍋內(nèi)空氣排凈時(shí)，即可關(guān)閉排氣閥，壓力開始上升。實(shí)圖7-1立式滅菌鍋實(shí)圖7-2臥式滅菌鍋1．安全閥2．壓力表3．放氣閥4．軟管5．緊固螺栓6．滅菌桶7．篩架8．水(6)保壓當(dāng)壓力表指針達(dá)到所需壓力刻度時(shí)，控制熱源，開始計(jì)時(shí)并維持壓力至所需時(shí)間。本實(shí)訓(xùn)用121℃、20rnin滅菌。(7)降壓達(dá)到所需滅菌時(shí)間后，關(guān)閉熱源，讓壓力自然下降到零后，打開排氣閥。放凈余下的蒸汽后，再打開鍋蓋，取出滅菌物品，排掉鍋內(nèi)剩余水。(8)無菌檢查將已滅菌培養(yǎng)基冷卻后置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，若無菌生長，則放人冰箱或陰涼處保存?zhèn)溆谩?．化學(xué)藥品滅菌化學(xué)藥品消毒滅菌法是用能抑制或殺死微生物的化學(xué)制劑進(jìn)行消毒滅菌的方法。能破壞細(xì)菌代謝機(jī)能并有致死作用的化學(xué)藥劑為殺菌劑，如重金屬離子等；僅阻抑細(xì)菌代謝機(jī)能，使細(xì)菌不能增殖的化學(xué)藥劑為抑菌劑，如磺胺類及大多抗生素等?；瘜W(xué)藥品對微生物的作用是抑菌還是殺菌以及