艾草中黃酮類化合物的提取步驟

艾草中黃酮類化合物的提取步驟一、試驗(yàn)儀器及藥品試驗(yàn)儀器：天平、紫外分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、小鼠固定器、灌胃器、恒溫干燥箱、真空抽濾機(jī)、毛細(xì)血管、容量瓶、移液管等。試驗(yàn)藥品：鹽酸、乙醇、蘆丁標(biāo)品、5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液、1mol/L氫氧化鈉溶液、阿司匹林、生理鹽水二、技術(shù)路線技術(shù)路線1：艾草采集→干燥→粉碎→過篩→浸提→趁熱抽濾2次→合并濾液→冷卻→黃酮類粗品→乙醇重結(jié)晶→冷卻→黃酮類化合物精品技術(shù)路線2：小鼠編號(hào)分組—灌胃給藥—毛細(xì)血管靜脈取血—觀察并記錄凝血時(shí)間技術(shù)路線3：小鼠編號(hào)分組—灌胃給藥—小鼠斷尾—觀察并記錄凝血時(shí)間三、實(shí)驗(yàn)步驟：（一）艾草中黃酮類化合物的提取工藝研究分別以液料比（艾草質(zhì)量：溶劑體積）、浸提溫度、浸提時(shí)間3個(gè)方面進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以黃酮類化合物的提取率為指標(biāo)，確定單因素的合適范圍，然后做單因素正交實(shí)驗(yàn)，確定最佳的提取工藝組合。1、艾草中黃酮類化合物粗提取液的制備①艾草采集：采取8月中旬的艾草。1/5②干燥：以風(fēng)干為最佳干燥方法。③浸提：準(zhǔn)確稱取1g艾草粉末，加約 6倍量已煮沸的蒸餾水，攪拌下加飽和石灰水調(diào)pH至8～9，并保持此pH下微沸40～50min。④合并提取液：在80～90℃，攪拌下用鹽酸調(diào)pH4～5，靜止，沉淀完全抽濾，水洗至洗液呈中性，60℃干燥至恒重。⑤乙醇重結(jié)晶：收集干燥得黃酮粗提物，加500mL已煮沸的蒸餾水，加熱煮沸20min至溶液澄清，趁熱過濾，收集濾液，放置充分冷卻，沉淀完全抽濾，水洗至洗液呈中性，沉淀60℃干燥至恒重。2、黃酮含量測(cè)定：1）制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：取干燥恒重蘆丁配成濃度為0."065mg/mL標(biāo)溶液,取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0."0,2."0,4."0,6."0,8."0,10."0mL,分別置于25mL容量瓶中,加30%乙醇補(bǔ)足至2/512."5mL,加5%亞硝酸鈉溶液0."7mL搖勻,放置5min后,精確加入10%硝酸鋁溶液0."7mL搖勻,放置5min,精確加入1mol/L氫氧化鈉溶液5mL,用30%乙醇稀釋至刻度。以第1容量瓶為空白,于510nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,以吸光度為坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立回歸方程。2）黃酮類化合物的測(cè)定：取提取液0."1mL,置于25mL容量瓶中,加30%乙醇補(bǔ)足至12."5mL,加5%亞硝酸鈉溶液0."7mL搖勻,放置5min后,精確加入10%硝酸鋁溶液0."7mL搖勻,放置5min,精確加入1mol/L氫氧化鈉溶液5mL,用30%乙醇稀釋至刻度。以0."1氧化鈉溶液5mL,用30%乙醇稀釋至刻度。以0."1mL30%乙醇為空白,于510nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A,由標(biāo)準(zhǔn)曲線得對(duì)應(yīng)濃度C,可算得艾草樣品的總黃酮含量。3、黃酮化合物提取優(yōu)化試驗(yàn)（1）單因素試驗(yàn)①液料比：80℃水浴浸提3h，液料比分別為 1:15、"1:20、"1:25、"1:30、"1:3/535、"1:40條件下提取艾草中黃酮化合物，以黃酮化合物的提取率為指標(biāo)，研究液料比對(duì)黃酮提取效率的影響。選取對(duì)黃酮提取率影響較大的范圍，用于正交試驗(yàn)。②浸提溫度：液料比1:25水浴浸提3h，溫度分別為60℃、70℃、80℃、90℃、100℃條件下提取艾草中黃酮類化合物，以黃酮化合物的提取率為指標(biāo)，研究溫度對(duì)黃酮提取效率的影響。選取對(duì)黃酮提取率影響較大的范圍，用于正交試驗(yàn)。③浸提時(shí)間：80℃水浴、液料比1:25，時(shí)間分別為 1h.、1."5h、2h、2."5h、3h、3.5h條件下提取艾草中黃酮化合物，以黃酮化合物的提取率為指標(biāo)，研究液料比對(duì)黃酮提取效率的影響。選取對(duì)黃酮提取率影響較大的范圍，用于正交試驗(yàn)。（2）正交試驗(yàn)以（1）單因素試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行 L9(33)正交試驗(yàn)。（二）艾草中黃酮類化合物的凝血試驗(yàn)①小鼠分組：將50只2周齡的小鼠隨即分成5組，分別為：空白對(duì)照組（生理鹽水0."2mL/10g（體重）），陽(yáng)性對(duì)照組（ 20mg/kg阿司匹林），5."0、10."4/50、15."0g/黃酮類化合物組。②灌胃給藥：按照步驟①所述條件，用針管將生理鹽水、阿司匹林、各濃度黃酮類化合物注射到小鼠嘴內(nèi)，每天2次，連續(xù)3d。③毛細(xì)管靜脈取血：末次給藥1h后，用內(nèi)徑1mm毛細(xì)管插入小鼠內(nèi)齜靜脈叢中取血，血液注滿毛細(xì)管后輕輕放于桌面。④觀察并記錄凝血時(shí)間：從血液開始流入毛細(xì)管開始計(jì)時(shí)，每隔30s打斷毛細(xì)管，觀察斷裂處有無凝血絲的出現(xiàn)，一旦出現(xiàn)則說明凝血，停止計(jì)時(shí)，記錄時(shí)間，即為凝血時(shí)間。（三）、艾草中黃酮類化合物的出血試驗(yàn)①、②于二中的①、②相同。③小鼠斷尾：小鼠固定于