生物物理試驗(yàn)方法

第3講熒光光譜熒光是怎么產(chǎn)生的？有什么用途？常用熒光光譜有哪些？熒光光譜有哪些特征？熒光強(qiáng)度和物質(zhì)濃度是什么樣的關(guān)系?還有哪些因素會(huì)影響到熒光強(qiáng)度？熒光光譜的有哪些光譜參數(shù)？有哪些實(shí)驗(yàn)方法？各種熒光測(cè)量方法有什么用途？熒光：某些物質(zhì)受到照射后發(fā)出能量較低的光，一旦光照停止，光線也立即消失，稱為熒光。入射光和發(fā)射光頻率之差稱為斯托克頻移。滿足上述條件即為熒光。因此熒光范圍比較寬，從X射線到紅外光譜區(qū)仍然是熒光。其他的能量如（化學(xué)反應(yīng)、加熱、生物代謝等）也會(huì)有熒光。生活中很多現(xiàn)象都與熒光相關(guān)。如：鈔票防偽，日光燈管，螢火蟲發(fā)光。1.熒光介紹1）熒光產(chǎn)生及其物理機(jī)制S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫a)光吸收：熒光物質(zhì)從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，過(guò)程約10-15s。此時(shí)，熒光分子處于激發(fā)態(tài)。b)內(nèi)轉(zhuǎn)換：處于電子激發(fā)態(tài)的分子由于內(nèi)部的作用，以無(wú)輻射躍遷過(guò)渡到低的能級(jí)。c)外轉(zhuǎn)換：處于電子激發(fā)態(tài)的分子由于和溶劑以及其他分子的作用，以及能量轉(zhuǎn)移，過(guò)渡到低的能級(jí)d)熒光發(fā)射：如果不以內(nèi)轉(zhuǎn)換的方式回到基態(tài)，處于第一電子激發(fā)態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的分子將以輻射的方式回到基態(tài)，平均壽命約為10ns左右。e)系間轉(zhuǎn)換：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的非輻射躍遷。如電子自旋改變，禁阻躍遷，通過(guò)自旋—軌道耦合進(jìn)行。f）振動(dòng)馳豫：高振動(dòng)能級(jí)至低相鄰振動(dòng)能級(jí)間的躍遷。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間10-12s。

熒光發(fā)光分為內(nèi)源熒光和外源熒光。外源熒光應(yīng)用很廣，如染料結(jié)合作為熒光探針與蛋白質(zhì)結(jié)合后吸附在大分子上可以提供微區(qū)極性、疏水區(qū)大小、粘性、分子間距離等。熒光壽命和量子產(chǎn)率：熒光猝滅：熒光能量共振轉(zhuǎn)移：時(shí)間分辨熒光光譜：熒光各向異性：熒光量子點(diǎn)標(biāo)記，轉(zhuǎn)基因熒光標(biāo)記雙光子熒光光譜2）熒光的應(yīng)用2.常用熒光光譜1）熒光的激發(fā)光譜，發(fā)射譜激發(fā)譜：固定測(cè)量波長(zhǎng)(選最大發(fā)射波長(zhǎng)),化合物發(fā)射的熒光強(qiáng)度與激發(fā)光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線。

激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大；熒光光譜有瞬態(tài)熒光光譜和穩(wěn)態(tài)熒光光譜兩類。通常熒光光譜指的是穩(wěn)態(tài)熒光光譜。熒光的發(fā)射譜：固定激發(fā)波長(zhǎng)，發(fā)射強(qiáng)度與發(fā)射波長(zhǎng)的關(guān)系。2).熒光光譜的特征

a.Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)，振動(dòng)弛豫消耗了能量。

b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量(如能級(jí)圖2,1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光(如‘2)。

c.

鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱關(guān)系。鏡像規(guī)則的解釋

基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布類似（振動(dòng)波函數(shù)一樣）；

基態(tài)上的零振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)的二振動(dòng)能級(jí)之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。

3.熒光光譜儀及使用技術(shù)光源

激發(fā)單色器樣品池檢測(cè)器發(fā)射單色器檢測(cè)器

熒光是散射譜，所以一般在垂直入射方向接收。背景是沒(méi)有入射光，是“暗背景”，因此靈敏度更高。1）熒光光譜儀I0dF薄層吸收的光強(qiáng)為：溶液發(fā)出的熒光光強(qiáng)正比于吸收光強(qiáng)。如果kcl<<1，進(jìn)行展開(kāi)，有2）熒光強(qiáng)度和溶液濃度的關(guān)系樣品池長(zhǎng)度通常為1cm，因此熒光強(qiáng)度為

熒光隨著濃度增高，強(qiáng)度反而減小，稱為濃度猝滅。原因可能是：a濃度增加，分子碰撞機(jī)會(huì)增加，增加了非輻射損耗。b溶液中其他雜質(zhì)吸收發(fā)出的熒光。（內(nèi)濾光）c吸收譜和發(fā)射譜重疊，熒光又被吸收。（自吸收）d儀器原因3）.熒光光譜的環(huán)境效應(yīng)4.熒光光譜參數(shù)1）熒光光譜參數(shù)：（1)熒光壽命和熒光量子產(chǎn)率去掉激發(fā)光以后，熒光強(qiáng)度并不是立即消失，而是以指數(shù)形式衰減。定義熒光強(qiáng)度降低到激發(fā)狀態(tài)最大熒光強(qiáng)度的1/e所需要的時(shí)間稱為熒光壽命。熒光壽命是個(gè)很重要的參數(shù)，可以不再對(duì)熒光的絕對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量。熒光壽命方程：公式中的τ即為熒光壽命熒光壽命和量子產(chǎn)率示意圖Q為量子產(chǎn)率，為熒光發(fā)射速率，knr為非輻射轉(zhuǎn)移速率,τn為熒光自然壽命.通常量子效率和波長(zhǎng)相關(guān)，但生化的熒光通常和波長(zhǎng)無(wú)關(guān)。（2).熒光各向異性

熒光偏振：熒光偏振（參數(shù)）：p=(F∥-F⊥)/(F∥+F⊥)

熒光各向異性:γ=(F∥-F⊥)/(F∥+2F⊥)XYZF⊥F∥μaμeIp和同時(shí)描述熒光偏振。從對(duì)稱性考慮，F(xiàn)x=Fy,通常用描述熒光偏振各向異性與偏振度轉(zhuǎn)換：5.熒光實(shí)驗(yàn)方法及其用途熒光猝滅熒光各向異性熒光能量共振轉(zhuǎn)移時(shí)間分辨熒光光譜熒光標(biāo)記雙光子熒光光譜

熒光猝滅泛指任何可以減低樣品熒光強(qiáng)度的過(guò)程。狹義主要指那些由于熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用所引起的熒光強(qiáng)度降低的情況。原因：溶劑猝滅劑和熒光物質(zhì)之間發(fā)生相互作用而引起熒光效率降低或激發(fā)態(tài)壽命縮短，導(dǎo)致強(qiáng)度降低。鹵素離子、重金屬離子、氧分子都是猝滅劑。研究主要集中在可測(cè)量的“狹義熒光猝滅”。生化方面主要應(yīng)用猝滅現(xiàn)象指示分子之間的相互作用。揭示發(fā)色團(tuán)和猝滅劑的接近程度，反映發(fā)色團(tuán)在蛋白和膜上的局域位置，質(zhì)子的通透性和膜的通透性。碰撞猝滅可以用來(lái)確定猝滅及的擴(kuò)散系數(shù)。采用Stern-Volmer方程來(lái)解釋1）.熒光猝滅（1）碰撞猝滅分析Lackowicz“Principleoffluorescentspectroscopy”Chapt8,p237-p265碰撞猝滅的Stern-Volmer方程F0/F=1+kqτ0

[Q]＝1＋KD[Q]

其中kq是猝滅速率

τ0是無(wú)猝滅劑存在時(shí)的熒光壽命

[Q]是猝滅劑的濃度

F0/F～[Q]曲線。單一線性猝滅曲線預(yù)示所有發(fā)色團(tuán)和猝滅劑是具有相同的可接近性。如果其中有一種不可接近，則Stern-Volmer曲線不是線性的。熒光發(fā)色團(tuán)和猝滅劑形成不發(fā)熒光的復(fù)合物，吸收光以后，以無(wú)輻射躍遷的形式回到基態(tài)。解離常數(shù)為：

與動(dòng)力學(xué)猝滅的形式相仿，然而熒光壽命并沒(méi)有發(fā)生改變。靜態(tài)猝滅也是和猝滅劑呈線性關(guān)系，因此需要通過(guò)改變溫度或測(cè)量熒光壽命來(lái)區(qū)分。kq～T/η（因?yàn)楹蛿U(kuò)散系數(shù)相關(guān)）另外可以通過(guò)測(cè)量吸收譜的方法確定。（2)靜態(tài)猝滅2）熒光偏振（1）熒光偏振現(xiàn)象及用途一旦用偏振光照射，從許多樣品出射的光也是偏振的。當(dāng)樣品各個(gè)方向出射的偏振光是不相同的，可以說(shuō)樣品顯示出偏振的特性。研究偏振可以提供分子及周圍環(huán)境更多的信息：

偏振光照射到熒光分子上，分子對(duì)光的吸收和發(fā)射過(guò)程與分子框架相對(duì)偏振光的偏振方向相關(guān)。熒光偏振可以用來(lái)測(cè)量蛋白質(zhì)的變形，蛋白質(zhì)的結(jié)合以及蛋白質(zhì)的內(nèi)部動(dòng)力學(xué)。與膜結(jié)合的熒光發(fā)色團(tuán)用來(lái)估計(jì)膜的內(nèi)部粘性以及居于相變溫度之上的磷脂復(fù)合物的特性。XYZθφF∥F⊥設(shè)發(fā)射振子和Z軸夾角為Y為熒光檢測(cè)方向（2）.熒光偏振的定量描述p=(F∥-F⊥)/(F∥+F⊥)（1）能量轉(zhuǎn)移：Fluorescentresonanceenergytransfer（FRET)術(shù)語(yǔ)：F?rsterresonanceenergytransfer紀(jì)念德國(guó)科學(xué)家TheodorF?rster3）.熒光能量共振轉(zhuǎn)移TheodorF?rster簡(jiǎn)介

1910生于德國(guó)法蘭克福，1933獲Ph.D。1942年前，一直在研究有機(jī)復(fù)合物的光吸收。二次大戰(zhàn)后，于1945年加入馬克思普朗克研究所。1946年發(fā)表第一篇能量轉(zhuǎn)移的文章。能量轉(zhuǎn)移與供體的發(fā)射譜和受體的吸收譜的重疊、量子產(chǎn)率、距離、相對(duì)取向相關(guān)。激發(fā)態(tài)的供體能量被受體吸收，熒光強(qiáng)度下降。能量轉(zhuǎn)移可能以兩種方式：輻射和非輻射。共振轉(zhuǎn)移的機(jī)制：偶極子相互作用通過(guò)非輻射進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移（<10nm)。熒光能量轉(zhuǎn)移的先決條件：1)供體和受體有一定譜重疊（共振能量轉(zhuǎn)移）。2)供體和受體距離比較近（正比于R6)。3）供體和受體躍遷偶極距的方向不能垂直（2）.能量轉(zhuǎn)移的物理機(jī)制F?rster公式：kT=kD(R0/R)6,kD=1/

D

如果波長(zhǎng)采用cm，采用摩爾消光系數(shù)則：R0=9780(J(λ)к2n-4ΦD)1/6（單位為0.1nm)J=∫f(λ)ε(λ)λ4dλ（譜重疊積分）（3）Fret分析Lakowicz，JR.PrinciplesofFluorescentSpectroscopy,2ndEd,Chapt.13，p369.能量轉(zhuǎn)移經(jīng)常用于測(cè)定供體和受體的距離，稱為“光譜尺”（spectroscopicruler），有時(shí)也會(huì)受到供體和受體的擴(kuò)散影響。能量轉(zhuǎn)移效率4).時(shí)間分辨光譜：輸入脈沖，然后進(jìn)行對(duì)接收的信號(hào)進(jìn)行相應(yīng)分析。時(shí)間分辨壽命；時(shí)間分辨各向異性。

熒光各向異性可以采用穩(wěn)態(tài)測(cè)量，也可以用瞬態(tài)方法進(jìn)行測(cè)量。穩(wěn)態(tài)測(cè)量是得到的是一個(gè)平均值，雖然容易解釋，但需要做很多假設(shè)。瞬態(tài)測(cè)量是測(cè)量脈沖激發(fā)后的時(shí)間相關(guān)各向異性?？梢灾苯訌膶?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中觀察得到并進(jìn)行解釋。各向異性與樣品尺寸、形狀以及標(biāo)記分子的柔性相關(guān)，需要從各種分子模型進(jìn)行計(jì)算擬合。各向異性衰減可以從TD或FD方法得到。目前還是采用時(shí)間分辨進(jìn)行測(cè)量。一般情況下，要用水合體積進(jìn)行計(jì)算旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間。如果是球形的樣品，將會(huì)有單一衰減指數(shù)；大多數(shù)情況將會(huì)有多個(gè)衰減指數(shù)。原因主要是樣品為非球形蛋白質(zhì)或樣品中有不同運(yùn)動(dòng)狀況的熒光發(fā)色團(tuán)。衰減時(shí)間與沿各分子軸的旋轉(zhuǎn)相關(guān)。如果樣品內(nèi)部某些片斷是柔性的，衰減時(shí)間也會(huì)改變。因此熒光各向異性可用于研究蛋白的內(nèi)部動(dòng)力學(xué)。

能量轉(zhuǎn)移也會(huì)影響各向異性衰減。在膜蛋白的研究中，通過(guò)各向異性衰減也有很多信息。

（1）各向異性的時(shí)間相關(guān)特性所得到的是平均結(jié)果。一般來(lái)講，樣品不會(huì)是完全均勻分布也不是高度有序。利用瞬態(tài)測(cè)量壽命時(shí)，式中的時(shí)間壽命是基于只有一個(gè)衰減時(shí)間的假設(shè)。但如果有多組分，則需要取平均壽命。另外采用有供體和受體時(shí)的熒光強(qiáng)度，用的是積分強(qiáng)度。在固體樣品中，可以克服樣品在溶劑中旋轉(zhuǎn)擴(kuò)散的影響。熒光猝滅，熒光能量共振轉(zhuǎn)移都可以影響熒光的壽命，因此用時(shí)間分辨譜進(jìn)行研究。（2）時(shí)間分辨壽命5.熒光標(biāo)記有些物質(zhì)不發(fā)熒光，而且生化分子中如氨基酸中只有少數(shù)殘基發(fā)熒光，成為內(nèi)源熒光。如染料與與研究對(duì)象結(jié)合，作為探針應(yīng)用熒光方法與蛋白質(zhì)結(jié)合后吸附在大分子上可以提供微區(qū)極性、疏水區(qū)大小、粘性、分子間距離等。加入染料不應(yīng)影響大分子的結(jié)構(gòu)加入染料不應(yīng)影響大分子的功能標(biāo)在不同位置，效果不同。標(biāo)記方法：1）有轉(zhuǎn)基因標(biāo)記：?jiǎn)吸c(diǎn)轉(zhuǎn)基因標(biāo)記:把某個(gè)氨基酸改變成Trp,或者轉(zhuǎn)變成Cys再與熒光探針結(jié)合。熒光蛋白：在蛋白中插入含發(fā)色團(tuán)的熒光蛋白，GFP,YFP,1）綠色熒光蛋白（GFP,greenfluorescentprotein）BFP2）量子點(diǎn)熒光標(biāo)記量子點(diǎn)：QuantumDot量子點(diǎn)又可稱為半導(dǎo)體納米微晶體。目前研究較多的主要是硫化鎘、硒化鎘和碲化鎘（CdS、CdSe和CdTe）。量子點(diǎn)由于粒徑很小(約1～100nm)，因此光學(xué)行為與一些大分子相似,可以發(fā)射熒光。量子點(diǎn)的體積大小嚴(yán)格控制著它的光吸收和發(fā)射特征。晶體顆粒越小,比表面積越大,分布于表面的原子就越多,量子尺寸效應(yīng)越強(qiáng)

,從而使其光吸收帶藍(lán)移,熒光發(fā)射峰位也相應(yīng)藍(lán)移。單獨(dú)的量子點(diǎn)顆粒容易受多種因素影響,熒光量子產(chǎn)率很低。但是當(dāng)以其為核心,用另一種半導(dǎo)體材料包覆,形成核-殼結(jié)構(gòu)后,就可將量子產(chǎn)率提高到約50%,甚至更高,因而有很強(qiáng)的熒光發(fā)射。目前已合成了多種核-殼結(jié)構(gòu)的納米顆粒,如CdS/Ag2S、CdS/Cd(OH)2、CdS/ZnS、ZnS/CdSe、ZnSe/CdSe、CdS/HgS、CdS/PbS等，以及多層結(jié)構(gòu)的CdS/HgS/CdS。

1.激發(fā)量子點(diǎn)的激發(fā)光波長(zhǎng)范圍很寬,因此不同大小的(CdSe)ZnS量子點(diǎn)可以由同一波長(zhǎng)的光激發(fā)。

2.量子點(diǎn)具有較大的半徑位移和狹窄對(duì)稱的熒光譜峰,這樣就允許同時(shí)使用不同光譜特征的量子點(diǎn),而發(fā)射光譜不出現(xiàn)