第七章-層析分離技術(shù)3離子交換層析課件

7.3離子交換層析一、基本原理及特點(diǎn)二、離子交換劑的種類與性質(zhì)三、離子交換層析的影響因素四、離子交換層析的操作要點(diǎn)7.3離子交換層析一、基本原理及特點(diǎn)1一、基本原理及特點(diǎn)離子交換層析（IonExchangeChromatography，簡(jiǎn)稱為IEC）是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力（靜電作用力）的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。1.基本原理一、基本原理及特點(diǎn)離子交換層析（IonExchangeC2載體官能團(tuán)可交換離子載體官能團(tuán)可3第七章-層析分離技術(shù)3離子交換層析課件4一、基本原理及特點(diǎn)IEC具有如下的特點(diǎn)：料液處理量大，在適宜的操作條件下，分離過(guò)程具有濃縮作用；分辨率較高：優(yōu)化操作條件可大幅度提高分離的選擇性；所需柱長(zhǎng)較短可在較高流速下操作；吸附作用機(jī)理明確，非特異性吸附小，產(chǎn)品回收率高；離子交換劑種類多，選樣余地大，價(jià)格也遠(yuǎn)低于親和吸附劑。2.特點(diǎn)一、基本原理及特點(diǎn)IEC具有如下的特點(diǎn)：2.特點(diǎn)5

二、離子交換劑的種類與性質(zhì)離子交換劑主要由三部分組成——載體（基質(zhì)）、官能團(tuán)及可交換離子。

按可交換離子帶電性不同，可分為陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑。按官能團(tuán)不同，可分為強(qiáng)/弱酸性離子交換劑（陽(yáng)）和強(qiáng)/弱堿性離子交換劑（陰）。常用的載體基質(zhì)有：纖維素、葡聚糖、瓊脂糖及玻璃珠等。。

二、離子交換劑的種類與性質(zhì)離子交換劑主要由三部分組成——載6二、離子交換劑的種類與性質(zhì)疏水性樹(shù)脂——聚苯乙烯樹(shù)脂

親水性聚合物纖維素(Cellulose)球狀纖維素(Sephacel)葡聚糖(Sephadex)SephadexG-25和G-50瓊脂糖(Sepharose)SepharoseCL-6B1.離子交換劑的載體（基質(zhì)）二、離子交換劑的種類與性質(zhì)疏水性樹(shù)脂——聚苯乙烯樹(shù)脂1.7二、離子交換劑的種類與性質(zhì)酸性基團(tuán)——陽(yáng)離子交換劑強(qiáng)酸型：（-SO3H）中等酸型：（-PO3H2、-PO2H）弱酸型：（-COOH）一般來(lái)講強(qiáng)酸型離子交換劑對(duì)H+的結(jié)合力<Na+；弱酸型離子交換劑對(duì)H+的結(jié)合力>Na+。

堿性基團(tuán)——陰離子交換劑強(qiáng)堿型：季胺基團(tuán)（-N(CH3)3）中等堿型：叔胺（-N(CH3)2）弱堿型：仲胺（-NHCH3）、伯胺（-NH2）一般來(lái)講強(qiáng)堿型離子交換劑對(duì)OH-的結(jié)合力<Cl-，弱酸型離子交換劑對(duì)OH-的結(jié)合力>Cl-。

2.離子交換劑的功能基團(tuán)及種類

二、離子交換劑的種類與性質(zhì)酸性基團(tuán)——陽(yáng)離子交換劑2.離子8（強(qiáng)酸性陽(yáng)離子）（弱酸性陽(yáng)離子）（強(qiáng)堿性陰離子）（強(qiáng)堿性陰離子）（中等堿性陰離子）（強(qiáng)酸性陽(yáng)離子）（弱酸性陽(yáng)離子）（強(qiáng)堿性陰離子）（強(qiáng)堿性陰離9二、離子交換劑的種類與性質(zhì)交換容量是指離子交換劑能提供交換離子的量，它反映離子交換劑與溶液中離子進(jìn)行交換的能力?？偨粨Q容量：指離子交換劑所能提供交換離子的總量，它只和離子交換劑本身的性質(zhì)有關(guān)。

有效交換容量：在實(shí)際應(yīng)用層析柱與樣品中各個(gè)待分離組分進(jìn)行交換時(shí)的交換容量，它不僅與所用的離子交換劑有關(guān)，還與實(shí)驗(yàn)條件有很大的關(guān)系。

靜態(tài)容量：流速為零時(shí)，所測(cè)定的有效交換容量。動(dòng)態(tài)容量：在特定流速下測(cè)定的有效交換容量。3.交換容量及其影響因素

二、離子交換劑的種類與性質(zhì)交換容量是指離子交換劑能提供交換離10總交換容量離子交換劑的總交換容量通常以每毫克或每毫升交換劑含有可解離基團(tuán)的毫克當(dāng)量數(shù)來(lái)表示，通常可以由滴定法測(cè)定。

陽(yáng)離子交換劑首先用HCl處理，使其平衡離子為H。再用水洗至中性，對(duì)于強(qiáng)酸型離子交換劑，用NaCl充分置換出H，再用標(biāo)準(zhǔn)濃度的NaOH滴定生成的HCl，就可以計(jì)算出離子交換劑的交換容量；對(duì)于弱酸型離子交換劑，用一定量的堿將H充分置換出來(lái)，再用酸滴定，計(jì)算出離子交換劑消耗的堿量，就可以算出交換容量。交換容量=（CHCl×50-CNaOH×VNaOH）/W陰離子交換劑的交換容量也可以用類似的方法測(cè)定?？偨粨Q容量離子交換劑的總交換容量通常以每毫克或每毫升交換劑含11有效交換容量的影響因素離子交換劑顆粒大小、顆粒內(nèi)孔隙大小以及所分離的樣品組分的大小等。這些因素主要影響離子交換劑中能與樣品組分進(jìn)行作用的有效表面積。分離小分子樣品時(shí)，可以選擇較小孔隙的交換劑，使小分子可以自由進(jìn)入孔隙，與離子交換劑的接觸表面積較大；對(duì)于較大分子樣品，可以選擇小顆粒交換劑，因?yàn)榇蠓肿右话悴荒苓M(jìn)入孔隙內(nèi)部，交換只限于顆粒表面，而小顆粒的離子交換劑相對(duì)表面積較大。層析條件——離子強(qiáng)度、pH值、流速等。主要影響樣品中組分和離子交換劑的帶電性質(zhì)。一般來(lái)說(shuō)，pH對(duì)弱酸和弱堿型離子交換劑影響較大，如對(duì)于弱酸酸型離子交換劑在pH較高時(shí)，電荷基團(tuán)充分解離，交換容量大，而在較低的pH時(shí)，電荷基團(tuán)不易解離，交換容量小；同時(shí)pH也影響樣品組分的帶電性。離子強(qiáng)度增大，交換容量則下降。實(shí)驗(yàn)中增大離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫，就是要通過(guò)降低交換容量把結(jié)合在離子交換劑上的樣品組分洗脫下來(lái)。靜態(tài)容量>動(dòng)態(tài)容量有效交換容量的影響因素離子交換劑顆粒大小、顆粒內(nèi)孔隙大小以及127.3離子交換層析

三、離子交換色譜的影響因素1.離子交換劑的選擇2.層析柱的尺寸3.緩沖液的種類4.pH的影響5.離子強(qiáng)度6.層析流速7.3離子交換層析

三、離子交換色譜的影響因素1.離子交131.離子交換劑的選擇（1）交換劑基質(zhì)的選擇：它主要影響層析的分辨率、速度、容量及回收率；（2）離子交換劑管能團(tuán)的種類：這主要取決于目標(biāo)分子的帶電性質(zhì)和pH穩(wěn)定性；（3）離子交換劑強(qiáng)弱的選擇：強(qiáng)、弱離子交換劑之間最大的差異在于適用的pH范圍不同，強(qiáng)離子交換劑在較寬的pH范圍內(nèi)能保持帶電荷狀態(tài)，而弱離子交換劑只能在較窄的pH范圍內(nèi)使用。1.離子交換劑的選擇（1）交換劑基質(zhì)的選擇：142.層析柱的尺寸離子交換層析要根據(jù)待分離樣品的量選擇合適的層析柱，離子交換用的層析柱一般粗而短，不宜過(guò)長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)室用典型的離子交換層析柱高度在5~20cm，高徑比一般小于5。在大規(guī)模的分離過(guò)程中，當(dāng)分離參數(shù)確定后，可以通過(guò)簡(jiǎn)單的增加層析柱的直徑來(lái)達(dá)到擴(kuò)大分離規(guī)模的目的。2.層析柱的尺寸離子交換層析要根據(jù)待分離樣品的量選擇合適的153.緩沖液的種類選擇不與離子交換劑發(fā)生相互作用的緩沖液（如：陰離子交換用Tris緩沖液；陽(yáng)離子交換用磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液）；根據(jù)體系的pH值選擇合適的緩沖液。根據(jù)緩沖物質(zhì)的pK值，選用pK與層析pH很接近的物質(zhì)作為緩沖成分。例如，某蛋白的等電點(diǎn)為6.5，選用陰離子交換劑為層析介質(zhì)，起始緩沖液pH定為8.0，則可選擇Tris緩沖液（pK=8.06）。

另外，緩沖液中還可以添加一些其他物質(zhì)氯仿、甲醇、表面活性劑等——增加疏水性蛋白的溶解性；尿素、鹽酸胍等——增加包涵體蛋白的溶解性；酶抑制劑——如：PMSF（苯甲基磺酰氟）,EDTA等。3.緩沖液的種類選擇不與離子交換劑發(fā)生相互作用的緩沖液（如164.pH的影響根據(jù)目的蛋白的pI選擇合適的緩沖液pHpH=pI時(shí)，蛋白質(zhì)表面電荷為零；pH<pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷；pH>pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷?？刹捎靡环N簡(jiǎn)單的試管試驗(yàn)法來(lái)確定最佳的初始pH(以陰離子交換為例)（具體操作可參見(jiàn)P116-117）采用Good氏緩沖液使pH間隔為0.5(pH5.0~9.0)樹(shù)脂與樣品混合（4℃、30~60min）后，離心取上清;測(cè)定上清中的活性，確定活性剛好消失時(shí)的pH;確定最佳的初始pH應(yīng)比活性剛好消失時(shí)的pH高0.5單位?？梢酝ㄟ^(guò)改變pH對(duì)目的蛋白進(jìn)行洗脫陰離子交換時(shí)，通常在較高pH下樣品吸附上樣，然后逐漸降低pH進(jìn)行洗脫；陽(yáng)離子交換時(shí)，低pH上樣，遞增pH進(jìn)行洗脫。注意：pH值變化幅度不宜過(guò)大，否則容易使目的蛋白發(fā)生變性。4.pH的影響根據(jù)目的蛋白的pI選擇合適的緩沖液pH175.離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度越高，蛋白與離子交換劑的結(jié)合力越弱；反之亦然。上樣時(shí)可選擇低鹽濃度；洗脫時(shí)可逐漸增加鹽濃度。確定目標(biāo)蛋白的最佳初始離子強(qiáng)度可依照上述pH的選擇策略（具體操作可參見(jiàn)P116-117）。①取10支試管分別用相同pH不同鹽濃度的緩沖液分別平衡等量樹(shù)脂，鹽濃度間隔為0.05mol/L（0.5~0.05mol/L）；②樹(shù)脂與樣品混合（4℃、30~60min）后，離心取上清液；③測(cè)定上清液中目的蛋白的活性（鹽濃度由高到低），確定活性剛好消失時(shí)的鹽濃度；④確定最佳的初始鹽濃度應(yīng)比活性剛好消失時(shí)低0.05mol/L。采用類似的方法也可以同時(shí)確定目的蛋白的洗脫離子強(qiáng)度范圍，即當(dāng)鹽濃度從低到高時(shí)，上清液中目的蛋白活性剛好恢復(fù)時(shí)的鹽濃度，可認(rèn)為是洗脫的最低濃度，可選擇比該濃度高0.05mol/L的鹽濃度作為最佳的洗脫濃度。5.離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度越高，蛋白與離子交換劑的結(jié)合力越弱；反186.層析流速層析時(shí)流速大小與被分離物質(zhì)的分子大小有關(guān)：對(duì)于低分子物質(zhì)，由于其具有高擴(kuò)散速率，可適當(dāng)提高流速；對(duì)于大分子物質(zhì)，由于其擴(kuò)散速率較低，需適當(dāng)降低流速。對(duì)于柱層析，流速過(guò)大，會(huì)使柱壓增大。尤其對(duì)于高粘度的物料，需限制其最大流速。6.層析流速層析時(shí)流速大小與被分離物質(zhì)的分子大小有關(guān)：197.3離子交換層析

四、離子交換柱層析的操作要點(diǎn)1.平衡緩沖液

2.上樣

3.洗脫緩沖液

4.洗脫速度

7.3離子交換層析

四、離子交換柱層析的操作要點(diǎn)1.平衡緩201.平衡緩沖液平衡緩沖液是指裝柱后及上樣后用于平衡離子交換柱的緩沖液。平衡緩沖液的離子強(qiáng)度和pH的選擇：首先要保證各個(gè)待分離物質(zhì)（如蛋白質(zhì)）的穩(wěn)定。其次是要使各個(gè)待分離物質(zhì)與離子交換劑有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合，并盡量使待分離樣品和雜質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合有較大的差別。另外注意平衡緩沖液中不能含有與離子交換劑結(jié)合力強(qiáng)的離子，否則會(huì)大大降低交換容量，影響分離效果。1.平衡緩沖液平衡緩沖液是指裝柱后及上樣后用于平衡離子交換柱212.上樣離子交換層析上樣時(shí)應(yīng)注意樣品液的離子強(qiáng)度和pH值，上樣量應(yīng)根據(jù)柱內(nèi)離子交換劑的交換容量決定，不宜過(guò)大，從而得到較好的分離效果。2.上樣離子交換層析上樣時(shí)應(yīng)注意樣品液的離子強(qiáng)度和pH值，223.洗脫緩沖液洗脫液的選擇首先要保證在整個(gè)洗脫液梯度范圍內(nèi)，所有待分離組分都是穩(wěn)定的。其次是要使結(jié)合在離子交換劑上的所有待分離組分在洗脫液梯度范圍內(nèi)都能夠被洗脫下來(lái)。

按操作方式A.恒定洗脫(isocraticelution)；B.分步洗脫(stageelution)；C.梯度洗脫(gradientelution)按洗脫機(jī)理增加緩沖液鹽濃度改變緩沖液pH陽(yáng)離子交換層析一般是采用pH從低到高的洗脫方式陰離子交換層析一般是采用pH從高到低的洗脫方式

改變緩沖液鹽濃度和緩沖液pH添加劑：表面活性劑、尿素、鹽酸胍洗脫體積：5倍床體積以上3.洗脫緩沖液洗脫液的選擇234.洗脫速度洗脫液的流速也會(huì)影響離子交換層析分離效果，洗脫速度通常要保持恒定。一般洗脫速度慢比快的分辨率要好，但洗脫速度過(guò)慢會(huì)造成分離時(shí)間長(zhǎng)、樣品擴(kuò)散、譜峰變寬等副作用，所以要根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的洗脫速度。如果洗脫峰相對(duì)集中某個(gè)區(qū)域造成重疊，則應(yīng)適當(dāng)縮小梯度范圍或降低洗脫速度來(lái)提高分辨率；如果分辨率較好，但洗脫峰過(guò)寬，則可適當(dāng)提高洗脫速度。4.洗脫速度洗脫液的流速也會(huì)影響離子交換層析分離效果，洗脫速24舉例：豬胰蛋白酶的離子交換層析豬胰蛋白酶等電點(diǎn)約為pH10.8上樣緩沖液：0.01mol/L,pH5.0檸檬酸鈉緩沖液離子交換劑種類：CM-纖維素離子交換樹(shù)脂洗滌緩沖液：0.01mol/L,pH5.0檸檬酸鈉緩沖液

洗脫緩沖液：0.05mol/L,pH5.0，檸檬酸鈉緩沖液0.1mol/L,pH6.0，檸檬酸鈉緩沖液洗脫方式：分步洗脫(stageelution)舉例：豬胰蛋白酶的離子交換層析豬胰蛋白酶等電點(diǎn)約為pH10.257.3離子交換層析

小結(jié)離子交換層析基本原理及特點(diǎn)離子交換劑的種類影響因素操作要點(diǎn)強(qiáng)堿性陰離子交換劑（如：Q型、QAE型）弱堿性陰離子交換劑（如：DEAE型）強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換劑（如：SP型、S型）弱酸性陽(yáng)離子交換劑（如：CM型）離子交換劑的選擇層析柱的尺寸緩沖液的種類pH的影響離子強(qiáng)度層析流速平衡緩沖液

上樣

洗脫緩沖液

洗脫速度

7.3離子交換層析

小結(jié)離子交換層析基本原理及特點(diǎn)離子交換26

思考題1.離子交換層析的基本原理是什么？常用的離子交換劑有哪幾類？2.影響離子交換色譜的因素有哪些？如何通過(guò)簡(jiǎn)易的方法確定離子交換色譜的初始pH和離子強(qiáng)度？3.離子交換層析的洗脫方式有幾種？分別在什么情況下適合?4．離子交換劑交換容量的基本含義是什么？交換容量煩哪幾種？影響有效交換容量的因素有哪些？

思考題1.離子交換層析的基本原理是什么？常用的離子交換劑277.3離子交換層析一、基本原理及特點(diǎn)二、離子交換劑的種類與性質(zhì)三、離子交換層析的影響因素四、離子交換層析的操作要點(diǎn)7.3離子交換層析一、基本原理及特點(diǎn)28一、基本原理及特點(diǎn)離子交換層析（IonExchangeChromatography，簡(jiǎn)稱為IEC）是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力（靜電作用力）的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。1.基本原理一、基本原理及特點(diǎn)離子交換層析（IonExchangeC29載體官能團(tuán)可交換離子載體官能團(tuán)可30第七章-層析分離技術(shù)3離子交換層析課件31一、基本原理及特點(diǎn)IEC具有如下的特點(diǎn)：料液處理量大，在適宜的操作條件下，分離過(guò)程具有濃縮作用；分辨率較高：優(yōu)化操作條件可大幅度提高分離的選擇性；所需柱長(zhǎng)較短可在較高流速下操作；吸附作用機(jī)理明確，非特異性吸附小，產(chǎn)品回收率高；離子交換劑種類多，選樣余地大，價(jià)格也遠(yuǎn)低于親和吸附劑。2.特點(diǎn)一、基本原理及特點(diǎn)IEC具有如下的特點(diǎn)：2.特點(diǎn)32

二、離子交換劑的種類與性質(zhì)離子交換劑主要由三部分組成——載體（基質(zhì)）、官能團(tuán)及可交換離子。

按可交換離子帶電性不同，可分為陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑。按官能團(tuán)不同，可分為強(qiáng)/弱酸性離子交換劑（陽(yáng)）和強(qiáng)/弱堿性離子交換劑（陰）。常用的載體基質(zhì)有：纖維素、葡聚糖、瓊脂糖及玻璃珠等。。

二、離子交換劑的種類與性質(zhì)離子交換劑主要由三部分組成——載33二、離子交換劑的種類與性質(zhì)疏水性樹(shù)脂——聚苯乙烯樹(shù)脂

親水性聚合物纖維素(Cellulose)球狀纖維素(Sephacel)葡聚糖(Sephadex)SephadexG-25和G-50瓊脂糖(Sepharose)SepharoseCL-6B1.離子交換劑的載體（基質(zhì)）二、離子交換劑的種類與性質(zhì)疏水性樹(shù)脂——聚苯乙烯樹(shù)脂1.34二、離子交換劑的種類與性質(zhì)酸性基團(tuán)——陽(yáng)離子交換劑強(qiáng)酸型：（-SO3H）中等酸型：（-PO3H2、-PO2H）弱酸型：（-COOH）一般來(lái)講強(qiáng)酸型離子交換劑對(duì)H+的結(jié)合力<Na+；弱酸型離子交換劑對(duì)H+的結(jié)合力>Na+。

堿性基團(tuán)——陰離子交換劑強(qiáng)堿型：季胺基團(tuán)（-N(CH3)3）中等堿型：叔胺（-N(CH3)2）弱堿型：仲胺（-NHCH3）、伯胺（-NH2）一般來(lái)講強(qiáng)堿型離子交換劑對(duì)OH-的結(jié)合力<Cl-，弱酸型離子交換劑對(duì)OH-的結(jié)合力>Cl-。

2.離子交換劑的功能基團(tuán)及種類

二、離子交換劑的種類與性質(zhì)酸性基團(tuán)——陽(yáng)離子交換劑2.離子35（強(qiáng)酸性陽(yáng)離子）（弱酸性陽(yáng)離子）（強(qiáng)堿性陰離子）（強(qiáng)堿性陰離子）（中等堿性陰離子）（強(qiáng)酸性陽(yáng)離子）（弱酸性陽(yáng)離子）（強(qiáng)堿性陰離子）（強(qiáng)堿性陰離36二、離子交換劑的種類與性質(zhì)交換容量是指離子交換劑能提供交換離子的量，它反映離子交換劑與溶液中離子進(jìn)行交換的能力?？偨粨Q容量：指離子交換劑所能提供交換離子的總量，它只和離子交換劑本身的性質(zhì)有關(guān)。

有效交換容量：在實(shí)際應(yīng)用層析柱與樣品中各個(gè)待分離組分進(jìn)行交換時(shí)的交換容量，它不僅與所用的離子交換劑有關(guān)，還與實(shí)驗(yàn)條件有很大的關(guān)系。

靜態(tài)容量：流速為零時(shí)，所測(cè)定的有效交換容量。動(dòng)態(tài)容量：在特定流速下測(cè)定的有效交換容量。3.交換容量及其影響因素

二、離子交換劑的種類與性質(zhì)交換容量是指離子交換劑能提供交換離37總交換容量離子交換劑的總交換容量通常以每毫克或每毫升交換劑含有可解離基團(tuán)的毫克當(dāng)量數(shù)來(lái)表示，通?？梢杂傻味ǚy(cè)定。

陽(yáng)離子交換劑首先用HCl處理，使其平衡離子為H。再用水洗至中性，對(duì)于強(qiáng)酸型離子交換劑，用NaCl充分置換出H，再用標(biāo)準(zhǔn)濃度的NaOH滴定生成的HCl，就可以計(jì)算出離子交換劑的交換容量；對(duì)于弱酸型離子交換劑，用一定量的堿將H充分置換出來(lái)，再用酸滴定，計(jì)算出離子交換劑消耗的堿量，就可以算出交換容量。交換容量=（CHCl×50-CNaOH×VNaOH）/W陰離子交換劑的交換容量也可以用類似的方法測(cè)定?？偨粨Q容量離子交換劑的總交換容量通常以每毫克或每毫升交換劑含38有效交換容量的影響因素離子交換劑顆粒大小、顆粒內(nèi)孔隙大小以及所分離的樣品組分的大小等。這些因素主要影響離子交換劑中能與樣品組分進(jìn)行作用的有效表面積。分離小分子樣品時(shí)，可以選擇較小孔隙的交換劑，使小分子可以自由進(jìn)入孔隙，與離子交換劑的接觸表面積較大；對(duì)于較大分子樣品，可以選擇小顆粒交換劑，因?yàn)榇蠓肿右话悴荒苓M(jìn)入孔隙內(nèi)部，交換只限于顆粒表面，而小顆粒的離子交換劑相對(duì)表面積較大。層析條件——離子強(qiáng)度、pH值、流速等。主要影響樣品中組分和離子交換劑的帶電性質(zhì)。一般來(lái)說(shuō)，pH對(duì)弱酸和弱堿型離子交換劑影響較大，如對(duì)于弱酸酸型離子交換劑在pH較高時(shí)，電荷基團(tuán)充分解離，交換容量大，而在較低的pH時(shí)，電荷基團(tuán)不易解離，交換容量??；同時(shí)pH也影響樣品組分的帶電性。離子強(qiáng)度增大，交換容量則下降。實(shí)驗(yàn)中增大離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫，就是要通過(guò)降低交換容量把結(jié)合在離子交換劑上的樣品組分洗脫下來(lái)。靜態(tài)容量>動(dòng)態(tài)容量有效交換容量的影響因素離子交換劑顆粒大小、顆粒內(nèi)孔隙大小以及397.3離子交換層析

三、離子交換色譜的影響因素1.離子交換劑的選擇2.層析柱的尺寸3.緩沖液的種類4.pH的影響5.離子強(qiáng)度6.層析流速7.3離子交換層析

三、離子交換色譜的影響因素1.離子交401.離子交換劑的選擇（1）交換劑基質(zhì)的選擇：它主要影響層析的分辨率、速度、容量及回收率；（2）離子交換劑管能團(tuán)的種類：這主要取決于目標(biāo)分子的帶電性質(zhì)和pH穩(wěn)定性；（3）離子交換劑強(qiáng)弱的選擇：強(qiáng)、弱離子交換劑之間最大的差異在于適用的pH范圍不同，強(qiáng)離子交換劑在較寬的pH范圍內(nèi)能保持帶電荷狀態(tài)，而弱離子交換劑只能在較窄的pH范圍內(nèi)使用。1.離子交換劑的選擇（1）交換劑基質(zhì)的選擇：412.層析柱的尺寸離子交換層析要根據(jù)待分離樣品的量選擇合適的層析柱，離子交換用的層析柱一般粗而短，不宜過(guò)長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)室用典型的離子交換層析柱高度在5~20cm，高徑比一般小于5。在大規(guī)模的分離過(guò)程中，當(dāng)分離參數(shù)確定后，可以通過(guò)簡(jiǎn)單的增加層析柱的直徑來(lái)達(dá)到擴(kuò)大分離規(guī)模的目的。2.層析柱的尺寸離子交換層析要根據(jù)待分離樣品的量選擇合適的423.緩沖液的種類選擇不與離子交換劑發(fā)生相互作用的緩沖液（如：陰離子交換用Tris緩沖液；陽(yáng)離子交換用磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液）；根據(jù)體系的pH值選擇合適的緩沖液。根據(jù)緩沖物質(zhì)的pK值，選用pK與層析pH很接近的物質(zhì)作為緩沖成分。例如，某蛋白的等電點(diǎn)為6.5，選用陰離子交換劑為層析介質(zhì)，起始緩沖液pH定為8.0，則可選擇Tris緩沖液（pK=8.06）。

另外，緩沖液中還可以添加一些其他物質(zhì)氯仿、甲醇、表面活性劑等——增加疏水性蛋白的溶解性；尿素、鹽酸胍等——增加包涵體蛋白的溶解性；酶抑制劑——如：PMSF（苯甲基磺酰氟）,EDTA等。3.緩沖液的種類選擇不與離子交換劑發(fā)生相互作用的緩沖液（如434.pH的影響根據(jù)目的蛋白的pI選擇合適的緩沖液pHpH=pI時(shí)，蛋白質(zhì)表面電荷為零；pH<pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷；pH>pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷?？刹捎靡环N簡(jiǎn)單的試管試驗(yàn)法來(lái)確定最佳的初始pH(以陰離子交換為例)（具體操作可參見(jiàn)P116-117）采用Good氏緩沖液使pH間隔為0.5(pH5.0~9.0)樹(shù)脂與樣品混合（4℃、30~60min）后，離心取上清;測(cè)定上清中的活性，確定活性剛好消失時(shí)的pH;確定最佳的初始pH應(yīng)比活性剛好消失時(shí)的pH高0.5單位?？梢酝ㄟ^(guò)改變pH對(duì)目的蛋白進(jìn)行洗脫陰離子交換時(shí)，通常在較高pH下樣品吸附上樣，然后逐漸降低pH進(jìn)行洗脫；陽(yáng)離子交換時(shí)，低pH上樣，遞增pH進(jìn)行洗脫。注意：pH值變化幅度不宜過(guò)大，否則容易使目的蛋白發(fā)生變性。4.pH的影響根據(jù)目的蛋白的pI選擇合適的緩沖液pH445.離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度越高，蛋白與離子交換劑的結(jié)合力越弱；反之亦然。上樣時(shí)可選擇低鹽濃度；洗脫時(shí)可逐漸增加鹽濃度。確定目標(biāo)蛋白的最佳初始離子強(qiáng)度可依照上述pH的選擇策略（具體操作可參見(jiàn)P116-117）。①取10支試管分別用相同pH不同鹽濃度的緩沖液分別平衡等量樹(shù)脂，鹽濃度間隔為0.05mol/L（0.5~0.05mol/L）；②樹(shù)脂與樣品混合（4℃、30~60min）后，離心取上清液；③測(cè)定上清液中目的蛋白的活性（鹽濃度由高到低），確定活性剛好消失時(shí)的鹽濃度；④確定最佳的初始鹽濃度應(yīng)比活性剛好消失時(shí)低0.05mol/L。采用類似的方法也可以同時(shí)確定目的蛋白的洗脫離子強(qiáng)度范圍，即當(dāng)鹽濃度從低到高時(shí)，上清液中目的蛋白活性剛好恢復(fù)時(shí)的鹽濃度，可認(rèn)為是洗脫的最低濃度，可選擇比該濃度高0.05mol/L的鹽濃度作為最佳的洗脫濃度。5.離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度越高，蛋白與離子交換劑的結(jié)合力越弱；反456.層析流速層析時(shí)流速大小與被分離物質(zhì)的分子大小有關(guān)：對(duì)于低分子物質(zhì)，由于其具有高擴(kuò)散速率，可適當(dāng)提高流速；對(duì)于大分子物質(zhì)，由于其擴(kuò)散速率較低，需適當(dāng)降低流速。對(duì)于柱層析，流速過(guò)大，會(huì)使柱壓增大。尤其對(duì)于高粘度的物料，需限制其最大流速。6.層析流速層析時(shí)流速大小與被分離物質(zhì)的分子大小有關(guān)：467.3離子交換層析

四、離子交換柱層析的操作要點(diǎn)1.平衡緩沖液

2.上樣

3.洗脫緩沖液

4.洗脫速度

7.3離子交換層析

四、離子交換柱層析的操作要點(diǎn)1.平衡緩471.平衡緩沖液平衡緩沖液是指裝柱后及上樣后用于平衡離子交換柱的緩沖液。平衡緩沖液的離子強(qiáng)度和pH的選擇：首先要保證各個(gè)待分離物質(zhì)（如蛋白質(zhì)）的穩(wěn)定。其次是要使各個(gè)待分離物質(zhì)與離子交換劑有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合，并盡量使待分離樣品和雜質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合有較大的差別。另外注意平衡緩沖液中不能含有與離子交換劑結(jié)合力強(qiáng)的離子，否則會(huì)大大降低交換容量，影響分離效果。1.平衡緩沖液平衡緩沖液是指裝柱后及上樣后用于平衡離子交換柱482.上樣離子交換層析上樣時(shí)應(yīng)注意樣品液的離子強(qiáng)度和pH值，上樣量應(yīng)根據(jù)柱內(nèi)離子交換劑的交換容量決定，不宜過(guò)大，從而得到較好的分離效果。2.上樣離子交換層析上樣時(shí)應(yīng)注意樣品液的離子強(qiáng)度和pH值，493.洗脫緩沖液洗脫液的選擇首先要保證在整個(gè)洗脫液梯度范圍內(nèi)，所有待分離組分都是穩(wěn)定的。其次