載體系統(tǒng)課件

第六節(jié)載體系統(tǒng)一、質(zhì)粒載體二、噬菌體載體三、cosmid克隆載體四、噬菌粒載體五、酵母人工染色體載體六、細(xì)菌人工染色體載體第六節(jié)載體系統(tǒng)一、質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒載體（一）質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性（二）基因工程中質(zhì)粒載體的構(gòu)建（三）pBR322質(zhì)粒載體（四）pUC質(zhì)粒載體（五）質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性問(wèn)題一、質(zhì)粒載體（一）質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性（一）質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性1質(zhì)粒的概念質(zhì)粒（plasmid）是獨(dú)立于染色體外、具有自主復(fù)制能力的遺傳單位，其本質(zhì)是較小的核酸分子，大小范圍在1kb-200kb以上不等。（一）質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性1質(zhì)粒的概念2細(xì)菌質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性：1）很多細(xì)菌中已發(fā)現(xiàn)；2）是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外的輔助性遺傳單位，基因組絕大部分為雙鏈環(huán)狀DNA，不同質(zhì)粒大小各異；3）大多數(shù)質(zhì)粒的宿主范圍較窄；2細(xì)菌質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性：4）已發(fā)展進(jìn)化出多種機(jī)制以維持其在細(xì)菌宿主中的穩(wěn)定的拷貝數(shù)；在不同的宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)可能不同。5）復(fù)制轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行依賴(lài)于宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)；6）常含有一些編碼對(duì)細(xì)菌宿主有利的酶的基因。4）已發(fā)展進(jìn)化出多種機(jī)制以維持其在細(xì)菌宿主中的穩(wěn)定的拷貝數(shù)；單鏈切割連接單鏈切割連接共價(jià)閉合環(huán)形DNA（SC型）開(kāi)環(huán)DNA（oc型）線(xiàn)性DNA（L型）環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒DNA分子具有三種不同構(gòu)型單鏈切割連接單鏈切割連接共價(jià)閉合環(huán)形DNA開(kāi)環(huán)DNA線(xiàn)性DN3質(zhì)粒的命名用小寫(xiě)字母p代表質(zhì)粒（plasmid），在p字母后用兩個(gè)大寫(xiě)字母代表發(fā)現(xiàn)這一質(zhì)粒的作者或?qū)嶒?yàn)室名稱(chēng)，再加上質(zhì)粒編號(hào)。如：pBR322：p表示一種質(zhì)粒，而“BR”則是分別取自該質(zhì)粒的兩位主要構(gòu)建者F.Bolivar和R.L.Rodriguez，322為編號(hào)。3質(zhì)粒的命名用小寫(xiě)字母p代表質(zhì)粒（plasmid）4質(zhì)粒給宿主細(xì)胞的標(biāo)記

(1)氨芐青霉素(Ampicillin)

(2)卡那霉素(Kanamycin)

(3)四環(huán)素（Tetracycline）

(4)氯霉素(Chloramphenicol)

(5)鏈霉素（Streptomycin）(6）潮霉素（Hygromycin）4質(zhì)粒給宿主細(xì)胞的標(biāo)記(1)氨芐青霉素(Ampic5質(zhì)粒的復(fù)制類(lèi)型據(jù)質(zhì)粒DNA復(fù)制與宿主之間的關(guān)系分為：（1）“嚴(yán)緊型”復(fù)制控制的質(zhì)粒(stringentplamid)：拷貝數(shù)少；（2）“松弛型”復(fù)制控制的質(zhì)粒(relaxedplasmid)：拷貝數(shù)多。5質(zhì)粒的復(fù)制類(lèi)型據(jù)質(zhì)粒DNA復(fù)制與宿主之間的關(guān)系分為：6質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的類(lèi)型據(jù)能否自我轉(zhuǎn)移可分為:

接合型（conjugativeplasmid)

非接合型（non-conjugativeplasmid)(2)F質(zhì)粒(fertilityfactor)

F+又叫雄性決定因子，所以F+細(xì)胞又叫雄性細(xì)胞，相應(yīng)的F–又叫雌性細(xì)胞。F質(zhì)粒(94kb)在寄主細(xì)胞中有三種不同存在方式：①F+②F`③Hfr。6質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的類(lèi)型據(jù)能否自我轉(zhuǎn)移可分為:7質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化（transformation）：是將異源DNA分子引入另一細(xì)胞品系，使受體細(xì)胞獲得新遺傳性狀的一種手段。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌常用方法：熱激法、電擊法7質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化（transformation）：（二）基因工程中的質(zhì)粒載體克隆載體(cloningvector)

:

使目的片段能在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制的載體;表達(dá)載體（ExpressionVector）:

使目的基因能在細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)為RNA或蛋白質(zhì)的載體。（二）基因工程中的質(zhì)粒載體克隆載體(cloningvect克隆載體必備條件（1）具有復(fù)制起點(diǎn)（2）具有抗菌素抗性基因（3）具有若干限制酶單一識(shí)別位點(diǎn)（4）具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量和較高的拷貝數(shù)?？寺≥d體必備條件（1）具有復(fù)制起點(diǎn)表達(dá)載體的必備條件(1)能自主復(fù)制(2)具有方便、靈活的克隆位點(diǎn)和篩擇標(biāo)記(3)具有能為大腸桿菌RNA聚合酶所識(shí)別的強(qiáng)大啟動(dòng)子(4)啟動(dòng)子應(yīng)可受誘導(dǎo)調(diào)控(5)具有強(qiáng)終止子(6)具有翻譯起始信號(hào)表達(dá)載體的必備條件(1)能自主復(fù)制1天然質(zhì)粒用作載體的局限性天然質(zhì)粒相對(duì)分子質(zhì)量拷貝數(shù)單一酶切位點(diǎn)選擇性標(biāo)記復(fù)制類(lèi)型pSC1015.8×1061~3EcoRItetr嚴(yán)緊ColE14.2×10620EcoRI大腸桿菌素松弛RSF21247.4×10610EcoRI(BamHI)ampr松弛局限性：分子量高、拷貝數(shù)低、合適的單一酶切位點(diǎn)少、選擇標(biāo)記不合適1天然質(zhì)粒用作載體的局限性天然質(zhì)粒相對(duì)分子質(zhì)量拷貝數(shù)單2質(zhì)粒載體的選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記的應(yīng)用：利用質(zhì)粒編碼的可選擇標(biāo)記選擇目標(biāo)菌落。常用的選擇標(biāo)記：

抗氨芐青霉素、抗四環(huán)素、抗氯霉素和抗卡那霉素等基因。2質(zhì)粒載體的選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記的應(yīng)用：（三）pBR322質(zhì)粒載體（三）pBR322質(zhì)粒載體pBR322質(zhì)粒載體的形體圖pBR322質(zhì)粒載體的形體圖pBR322質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)來(lái)源TetrAmprOripBR322質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)來(lái)源TetrAmprOripBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：?具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量(4363bp)?具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)(Ampr和Tetr)?具有較高的拷貝數(shù)（松弛型）pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：DNA連接酶pBR322質(zhì)粒載體tetr基因插入失活效應(yīng)DNA連接酶pBR322質(zhì)粒載體tetr基因插入失活效應(yīng)（四）pUC質(zhì)粒載體（四）pUC質(zhì)粒載體pUC18pUC19含四個(gè)部分：（1）來(lái)自pBR322的質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)（ori）；（2）ampr;（3）大腸桿菌β半乳糖苷酶基因（lacZ）的啟動(dòng)子及其編碼α-肽鏈的DNA序列；（4）多克隆位點(diǎn)（MCS）lacZ`OriAmprMCSpUC18pUC19含四個(gè)部分：lacZ`OriAmprMCBlueWhiteampramprInsertInsertNoinsertLacZ`LacZ`Blue?具更小的分子質(zhì)量(2.69kb)和更

高的拷貝數(shù)

?適于組織化學(xué)方法檢測(cè)重組體

?具多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)?具更小的分子質(zhì)量(2.69kb)和更

高的拷貝數(shù)

?其它重要的質(zhì)粒載體改造過(guò)的質(zhì)粒載體非常多其它重要的質(zhì)粒載體改造過(guò)的質(zhì)粒載體非常多能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體穿梭質(zhì)粒載體（shuttleplasmidvector）是一類(lèi)由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇記號(hào)，因而可在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。穿梭質(zhì)粒載體大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體（五）質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性問(wèn)題（1）不穩(wěn)定性類(lèi)型?分離不穩(wěn)定性?結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性（2）影響穩(wěn)定性主要因素?新陳代謝負(fù)荷?拷貝數(shù)差度（五）質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性問(wèn)題（1）不穩(wěn)定性類(lèi)型二、噬菌體載體1噬菌體的結(jié)構(gòu)及其核酸類(lèi)型2噬菌體的生命周期λ噬菌體載體4M13噬菌體載體二、噬菌體載體1噬菌體的結(jié)構(gòu)及其核酸類(lèi)型1噬菌體的結(jié)構(gòu)及其核酸類(lèi)型不同種類(lèi)的噬菌體顆粒，在結(jié)構(gòu)上有很大差別。

三種不同基本類(lèi)型：?無(wú)尾部的二十面體型?具尾部的二十面體型（大多數(shù)噬菌的構(gòu)形）?線(xiàn)狀體型1噬菌體的結(jié)構(gòu)及其核酸類(lèi)型不同種類(lèi)的噬菌體顆粒，在結(jié)構(gòu)T2噬菌體結(jié)構(gòu)示意圖T2噬菌體結(jié)構(gòu)示意圖

?雙鏈線(xiàn)性DNA（最常見(jiàn)）

?雙鏈環(huán)形DNA?單鏈環(huán)形DNA?單鏈線(xiàn)性DNA?單鏈RNA噬菌體的核酸：?雙鏈線(xiàn)性DNA（最常見(jiàn)）

?雙鏈環(huán)形DNA2噬菌體的生命周期（1）溶菌生長(zhǎng)周期噬菌體（烈性噬菌體）（2）溶源生長(zhǎng)周期噬菌體（溫和噬菌體）2噬菌體的生命周期（1）溶菌生長(zhǎng)周期噬菌體（烈性噬菌體）（1）烈性噬菌體的生活周期（1）烈性噬菌體的生活周期t=0噬菌體吸附到寄主菌的細(xì)胞壁，大約在吸附的2秒鐘內(nèi)就會(huì)發(fā)生噬菌體DNA的注入；t=1寄主DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成反應(yīng)被全部關(guān)閉；t=2第一個(gè)噬菌體mRNA開(kāi)始合成；t=3細(xì)菌DNA開(kāi)始降解；t=5噬菌體DNA合成開(kāi)始啟動(dòng)；t=9“晚期”噬菌體mRNA開(kāi)始合成；t=12出現(xiàn)完整的頭部和尾部結(jié)構(gòu)；t=15出現(xiàn)頭一個(gè)完整的噬菌體顆粒；t=22細(xì)菌發(fā)生溶菌作用，釋放出約300個(gè)左右的噬菌體時(shí)粒E.coliT4噬菌體的生命周期（以分鐘記）t=0噬菌體吸附到寄主菌的細(xì)胞壁，大約在吸附的2秒（2）溫和噬菌體（2）溫和噬菌體裂解循環(huán)溶源態(tài)（2）溫和噬菌體的生活周期裂解循環(huán)溶源態(tài)（2）溫和噬菌體的生活周期3λ噬菌體載體（1）λ噬菌體的分子生物學(xué)概述（2）λ噬菌體載體3λ噬菌體載體（1）λ噬菌體的分子生物學(xué)概述（1）λ噬菌體的分子生物學(xué)概述λ噬菌體（溫和型）顆粒中的DNA是一線(xiàn)性雙鏈DNA分子，長(zhǎng)48502bp，兩端各有12個(gè)堿基的5`凸出黏性末端是互補(bǔ)的。進(jìn)入細(xì)胞的λDNA通過(guò)兩端的黏性末端環(huán)化。λ噬菌體上有些基因可被取代而不影響其生活周期。（1）λ噬菌體的分子生物學(xué)概述λ噬菌體（溫和型）顆粒中的D第六節(jié)載體系統(tǒng)課件第六節(jié)載體系統(tǒng)課件第六節(jié)載體系統(tǒng)課件第六節(jié)載體系統(tǒng)課件λ噬菌體DNA的核酸內(nèi)切限制酶的限制圖（Kb）λ噬菌體DNA的核酸內(nèi)切限制酶的限制圖（Kb）（2）λ噬菌體載體

主要有如下特點(diǎn)：1)篩選簡(jiǎn)便；2)可克隆的片段大，最大可達(dá)23kb，而質(zhì)粒最大僅10kb左右；3)轉(zhuǎn)化效率高。（2）λ噬菌體載體λ噬菌體載體可分為：

插入型載體

替換型載體λ噬菌體載體可分為：第六節(jié)載體系統(tǒng)課件第六節(jié)載體系統(tǒng)課件注意：λ噬菌載體作為載體，其重組噬菌體DNA大小只能：38kb~52kb。體外包裝：λ噬菌載體+尾部蛋白+頭部蛋白λ噬菌體載體是主要用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建，也經(jīng)常用于外源目的基因的克隆。注意：λ噬菌載體作為載體，其重組噬菌體DNA大小只能：384M13噬菌體載體

6.4kb單鏈環(huán)狀正鏈DNA基因組。作載體的優(yōu)點(diǎn)：

(1)RFDNA和SSDNA都可感染E.coli，產(chǎn)生噬菌斑；(2)無(wú)包裝限制問(wèn)題（可6倍于M13基因組）；

(3)復(fù)制以雙鏈環(huán)形DNA為中間媒介；(4）易測(cè)出外源DNA的插入方向；(5）可產(chǎn)生能直接測(cè)序的單鏈DNA分子。4M13噬菌體載體6.4kb單鏈環(huán)狀正鏈DNA基三、cosmid克隆載體cosmid（cossite-carringplasmid）人工構(gòu)建的含有λDNA的cos位點(diǎn)序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類(lèi)型的質(zhì)粒載體。三、cosmid克隆載體cosmid（cossitepHC79柯斯質(zhì)粒載體pHC79的形體圖由pBR322質(zhì)粒DNA與λ噬菌體DNA的cos位點(diǎn)及其控制包裝作用的序列構(gòu)成pHC79柯斯質(zhì)粒載體pHC79的形體圖部分柯斯質(zhì)粒的基本特性部分柯斯質(zhì)粒的基本特性柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)：1）具有λ噬菌體的特性（但因不含全部必需基因，因此不能通過(guò)溶菌周期，無(wú)法形成子代噬菌體顆粒）；2）具有質(zhì)粒的特性（有質(zhì)粒復(fù)制子及抗菌素基因）；3）具有高容量的克隆能力（本身僅5-7kb,克隆極限可達(dá)45kb左右）；4）具有與同源序列質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力。廣泛應(yīng)用于基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建?？滤官|(zhì)粒載體的特點(diǎn)：柯斯克?。╟osmidcloning）理論依據(jù)是：1）在線(xiàn)性噬菌體DNA分子的每一端，都具有一段彼此互補(bǔ)的單鏈突出序列（cos位點(diǎn))。2）在λ噬菌體的正常生命周期中，會(huì)產(chǎn)生出由數(shù)百個(gè)λDNA拷貝組成的多連體分子。在此種分子中，前后兩個(gè)λDNA基因組之間都是通過(guò)cos位點(diǎn)連接起來(lái)的。3）λ噬菌體具有的一種位點(diǎn)特異的切割體系(site-specificcuttingsystem),又叫Ter體系，能識(shí)別兩個(gè)相距適宜的cos位點(diǎn)(38-45kb)，將多連體分子切割成λ單位長(zhǎng)度的片段，并將它們包裝到λ噬菌體頭部中去。柯斯克?。╟osmidcloning）理論依據(jù)是：(如EcoRI)38kb~52kb(如EcoRI)38kb~52kb四噬菌粒載體（phagemidvector)由質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w載體結(jié)合而成的新型載體系列，稱(chēng)為噬菌粒（phagemid或phasmid）四噬菌粒載體（phagemidvector)由噬菌體質(zhì)粒單鏈?zhǔn)删w輔助噬菌體大腸桿菌寄主菌株pEMBL8pUC8f1IR171/18pRSA101πVXM13M13變異株XS127，XS101pUC118/pUC119pUC18/pUC19M13M13K07MV1184pBSpUCf1M13K07XL-Blue幾種常用的噬菌粒載體的一般特征噬菌體質(zhì)粒單鏈?zhǔn)删w輔助噬菌體大腸桿菌寄主菌株pEMBL8ppUC119(MCS)pUC118(MCS)puC118和pUC119噬菌粒載體的分子結(jié)構(gòu)pUC119(MCS)pUC118(MCS)puC118和ppBluescriptSK(+/-)2958bppBluescriptSK(+/-)噬菌粒載體的分子結(jié)構(gòu)圖pBluescriptSK(+/-)pBluescrip噬菌粒載體的