微生物及無菌知識(shí)培訓(xùn)、六步洗手法及進(jìn)入潔凈車間的程序課件

微生物及無菌知識(shí)培訓(xùn)六步洗手法微生物及無菌知識(shí)培訓(xùn)一、前言

我們所生活的環(huán)境中，到處都存在著大量的微生物。在一般空氣中，微生物達(dá)800~3500個(gè)/m3，在土壤中達(dá)1~500×108個(gè)/g，在嚴(yán)重污染的水中可達(dá)107個(gè)/ml。（飲用水要求細(xì)菌總數(shù)≤100個(gè)/ml，大腸桿菌≤3個(gè)/ml。經(jīng)水塔或貯水池貯存后，短期內(nèi)可繁殖至105~106個(gè)/ml。）人的頭皮上有140萬個(gè)/cm2，兩手上約有4~40萬個(gè)，1g指甲污垢有38億個(gè)，1g糞便可達(dá)10~1000億個(gè)?？梢哉f微生物是無處不在，無處不有。許多以前被人們認(rèn)為是極端（高溫、高壓、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、低溫等）甚至是致死的環(huán)境，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)生活著各種類型的微生物（稱為極端微生物）。事實(shí)說明，微生物有特別頑強(qiáng)的生存、繁殖和變異能力來適應(yīng)環(huán)境。

微生物種類繁多，有的對(duì)人有益，有的有害，有的無益也無害。但在藥品生產(chǎn)過程中，不可能對(duì)環(huán)境中的各種微生物加以區(qū)別對(duì)待，為保證藥品的安全有效，需要對(duì)其進(jìn)行控制?？諝庵械奈⑸锒鄶?shù)附著在灰塵上，或以芽孢形式懸浮于空氣中，1μm以下者處于懸浮狀態(tài)，10μm以上者會(huì)逐漸沉下來而形成菌塵。所以也要對(duì)塵粒進(jìn)行控制。

大量臨床資料表明，注射劑（尤其是靜脈注射劑）如污染了7~12μm的塵粒，可導(dǎo)致熱原反應(yīng)、肺動(dòng)脈炎、微血栓或異物肉芽腫等，嚴(yán)重的還會(huì)致人死命。而如果污染了細(xì)菌，輕則局部紅腫化膿，重則引起全身細(xì)菌性感微生物是廣泛存在于自然界的一群體形微?。ㄖ睆叫∮?mm）、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、肉眼看不見，必須藉助光學(xué)或電子顯微鏡放大數(shù)百至數(shù)萬倍才能觀察到的生物。需要說明的是，微生物是一個(gè)比較籠統(tǒng)的概念，界線有時(shí)非常模糊。如單細(xì)胞藻類和一些原生動(dòng)物也應(yīng)算是微生物，但通常它們并不放在微生物中進(jìn)行研究。

微生物具有以下特點(diǎn)：①體積小，面積大；②吸收多，轉(zhuǎn)化快（2000倍體重/h）；③生長(zhǎng)旺，繁殖快（20min分裂一次）；④易變異，適應(yīng)強(qiáng)；⑤分布廣，種類多（10萬種以上）。

微生物按其結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成及生活習(xí)性等差異可分成三大類：

1．真核細(xì)胞型細(xì)胞核的分化程度較高，有核膜、核仁和染色體；胞質(zhì)內(nèi)有完整的細(xì)胞器（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體及線粒體等）。真菌屬于此類型微生物。

2．原核細(xì)胞型細(xì)胞核分化程度低，僅有原始核質(zhì)，沒有核膜與核仁；細(xì)胞器不很完善。這類微生物種類眾多，有細(xì)菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體和放線菌。

3．非細(xì)胞型沒有典型的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，亦無產(chǎn)生能量的酶系統(tǒng)，只能在活細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖。體積微小，能通過除菌濾器。病毒屬于此類型微生物。

微生物在自然界中的分布極為廣泛，空氣、土壤、江河、湖泊、海洋等都有數(shù)量不等、種類不一的微生物存在。在人類、動(dòng)物和植物的體表及其與外界相通的腔道中也有多種微生物存在。

絕大多數(shù)微生物對(duì)人類和動(dòng)、植物的生存是有益而必需的。自然界中氮、碳、硫等多種元素循環(huán)靠微生物的代謝活動(dòng)來進(jìn)行。例如空氣中的大量氮?dú)庵挥幸揽课⑸锏淖饔貌拍鼙恢参镂眨寥乐械奈⑸锬軐?dòng)、植物蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為無機(jī)含氮化合物，以供植物生長(zhǎng)的需要，而植物又為人類和動(dòng)物所利用。因此，沒有微生物，植物就不能新陳代謝，而人類和動(dòng)物也將無法生存。

另一方面，由極少數(shù)微生物引起的傳染病發(fā)病快、死亡率高、傳播迅速、傳播范圍廣，嚴(yán)重危害著人民健康。

三．微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)

1．細(xì)菌（原核單細(xì)胞生物）

細(xì)菌按形狀可分為：球菌（0.5~2μm）、桿菌（長(zhǎng)1~5μm，寬0.3~1μm）和螺形菌（大小與桿菌相似）。

按革蘭氏染色法染色的不同，分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁表面含較多的磷壁酸，會(huì)產(chǎn)生外毒素，如金黃色葡萄球菌；革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁表面多含脂蛋白和脂多糖，會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素（即熱原），如大腸桿菌。

細(xì)菌一般有細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核，有的還有莢膜、鞭毛、菌毛和芽胞等特殊結(jié)構(gòu)。

細(xì)菌一般為無性繁殖，以二分法繁殖，幾十分鐘或1~2小時(shí)分裂一次。

霉菌是真菌的一部分。在培養(yǎng)基上長(zhǎng)成絨毛狀或棉絮狀的菌絲體的真菌統(tǒng)稱為霉菌。

霉菌細(xì)胞呈狹長(zhǎng)的管狀，稱為菌絲。菌絲直徑比細(xì)菌、放線菌大，約2~10μm。菌絲分枝連接，交錯(cuò)集合在一起的總體稱為菌絲體。

霉菌大多數(shù)是多細(xì)胞微生物，菌絲細(xì)胞由細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和各種細(xì)胞器組成。細(xì)胞壁很薄，往往在表面產(chǎn)生色素，使菌落出現(xiàn)各種顏色。

霉菌靠孢子繁殖，有無性繁殖和有性繁殖兩種方式，以無性繁殖為主。

有些真菌可用釀酒造醬，或用于發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸、葡萄糖酸、酶、抗生素（如青霉素、頭孢菌素）；少數(shù)真菌能引起各種真菌病。真菌產(chǎn)生的真菌毒素（如黃曲霉素）有毒。

繁殖方式為無性孢子繁殖。最適pH6.7~7.5，溫度25~30℃。

放線菌可用于生產(chǎn)抗生素、維生素和酶類，少數(shù)可引起人畜放線菌病。

5．病毒

病毒是一類體積十分微小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，只含一種核酸（DNA或RNA），沒有產(chǎn)生能量的酶系統(tǒng)，只能在活細(xì)胞內(nèi)以復(fù)制方式增殖的非細(xì)胞型微生物。病毒在自然界分布非常廣泛，在所有其它生物中都有病毒寄居。病毒是最常見的致病微生物，人類傳染病中大約75%是由病毒引起的。

病毒體主要由核酸和蛋白質(zhì)組成。病毒體積微小，最大直徑300nm（如牛痘病毒），最小直徑20nm（如口蹄疫病毒），絕大多數(shù)在在含水的環(huán)境中微生物才能存活。但也有人發(fā)現(xiàn)在無水碳?xì)浠衔镏形⑸锟砷L(zhǎng)期存活。

2．碳源：碳源是構(gòu)成細(xì)胞的重要物質(zhì)。有些微生物的碳源必須來自有機(jī)碳化合物如糖、蛋白質(zhì)、脂肪、有機(jī)酸等（同時(shí)利用其化學(xué)能），屬異養(yǎng)型；有些微生物不需有機(jī)碳化合物，以CO2為碳源，屬自養(yǎng)型（分為光能自養(yǎng)型和化能自養(yǎng)型）。

3．氮源：氮是組成蛋白質(zhì)和核酸的重要元素。

4．無機(jī)鹽類：細(xì)菌所需無機(jī)鹽包括磷、硫、鎂、鐵、鉀、鈉、鈣、氯、錳、鋅、鈷、銅等。其中磷、硫、鎂、鉀、鈉、鐵需要量較多，其他只需微量。

5．生長(zhǎng)因子：生長(zhǎng)因子是某些微生物生長(zhǎng)發(fā)育所必需，而其自身又不能合成的一類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。包括維生素、嘌呤和嘧啶等。五．微生物生長(zhǎng)的影響因素

1．營(yíng)養(yǎng)物

2．pH值：各種微生物都有其最適宜的pH值，大多數(shù)細(xì)菌最適pH為6.8~7.4，但一般有較大的容忍度，在4~9也可存活和生長(zhǎng)，少數(shù)細(xì)菌能在極端pH值范圍內(nèi)生長(zhǎng)。真菌適于pH值3~6的微酸性環(huán)境，但在2~10也可生長(zhǎng)。

3．溫度：微生物適于生長(zhǎng)繁殖要有適宜的溫度，當(dāng)超過其最低或最高可耐受的溫度時(shí)，即停止生長(zhǎng)或死亡。一般細(xì)菌最適溫度為30~40℃，真菌為20~30℃。

4．氧氣：大多數(shù)細(xì)菌和所有霉菌都是需氧菌（在有氧環(huán)境中才能生長(zhǎng)），少數(shù)細(xì)菌是厭氧菌（在無氧環(huán)境中才能生長(zhǎng)），有些細(xì)菌和酵母菌是兼性需氧厭氧的，在有氧或無氧環(huán)境中都能生長(zhǎng)繁殖。

5．滲透壓：微生物細(xì)胞膜和所有生物膜一樣是一種半透膜，可讓水自由通過，對(duì)溶質(zhì)則有選擇性。由于細(xì)胞壁的保護(hù)，微生物能存活在低滲透壓的水中。而在高滲溶液（如高濃度的鹽溶液或糖溶液、40%甘油）中，細(xì)胞會(huì)脫水并停止生長(zhǎng)繁殖。但也有一些專性耐高鹽細(xì)菌只有在高鹽（10~15%）條件下才生長(zhǎng)。

6．表面張力：表面活性劑可降低表面張力它是影響細(xì)菌生長(zhǎng)的因素之一。很多革蘭氏陰性菌，特別是大腸菌群可很好地在表面活性劑包圍的介質(zhì)中生長(zhǎng)，而大多數(shù)革蘭氏陽性菌在表面張力低時(shí)（0.05N/m）不能很好生長(zhǎng)。陽離子表面活性劑對(duì)很多有機(jī)體有毒性，陰離子表面活性劑毒性很小，非離子表面活性劑幾乎沒有毒性，并可成為某些微生物的營(yíng)養(yǎng)物。

六．消毒與滅菌

消毒與滅菌是微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最基本的操作，從事藥品生產(chǎn)和檢驗(yàn)的人員都應(yīng)當(dāng)了解消毒與滅菌的方法及其意義，嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，否則會(huì)影響產(chǎn)品質(zhì)量，危害患者安全。

1．概念

1．概念

無菌——不存在活的生物（GMP指南）。

“無菌”從定義上來說是一個(gè)絕對(duì)的概念，但遺憾的是，在科學(xué)和技術(shù)高度發(fā)展的今天，藥品的絕對(duì)無菌即做不到，也無法加以證實(shí)。然而，無菌制劑的安全性要求人們?cè)O(shè)定無菌的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)。

FDA、歐洲制藥工業(yè)界曾將百萬分之一微生物污染率作為滅菌產(chǎn)品“無菌”的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)，它和蒸汽滅菌后產(chǎn)品中微生物存活的概率為10-6（即產(chǎn)品的無菌保證值為6），系同一標(biāo)準(zhǔn)的不同表示法。這一標(biāo)準(zhǔn)于1980起收錄于USPXX中，如今已為世界各國(guó)普遍接受和采用。

滅菌——使達(dá)到無菌狀態(tài)的方法（GMP指南乙醇

①70%~75%水溶液

②0.5%洗必泰溶于70%乙醇，再加入2%甘油

用于皮膚、器具等消毒

供洗手用消毒

異丙醇

75%水溶液

用于皮膚、器具等消毒

甲醛

37%~40%甲醛液8~9ml，再加入4~5g高錳酸鉀

每m3熏蒸量，密閉12~24h。刺激性強(qiáng)

戊二醛

2%水溶液

用于空氣、器具等消毒。廣譜、高效、低毒，可殺芽孢和病毒。刺激性較輕。

新潔爾滅（苯扎溴銨）

0.1%水溶液

用于皮膚、粘膜、器具等消毒，有清潔和消毒雙重功效?？咕V較窄。

杜滅芬（消毒寧）

0.05%~0.1%水溶液

用于皮膚、器具等消毒

過氧乙酸

①0.2%~0.5%水溶液

②新配0.5%水溶液

③1g/m3

用于器具等消毒抗菌譜廣，可

用于皮膚消毒殺滅某些病毒

熏蒸但性質(zhì)不穩(wěn)定

乳酸

①0.33~1mol/L

②1~1.5ml/m3熏蒸或與等量苯酚合用熏蒸

噴霧，用于空氣消毒，有強(qiáng)殺菌作用

熏蒸，密閉12h以上

麝香草酚

5%麝香草酚溶于50%乙醇

噴灑墻面、地面，殺霉菌

2）濕熱滅菌法通過熱蒸汽或沸水使蛋白質(zhì)變性而殺滅微生物的方法。濕熱穿透力強(qiáng)，滅菌效果較干熱好。

①煮沸或流通蒸汽滅菌：常壓下沸水和蒸汽的溫度是100℃，一般處理30~60min可殺死細(xì)菌繁殖體，但不能完全殺滅芽孢。此法適用于不能高壓蒸汽滅菌的物品。

②低溫間隙滅菌（巴斯德滅菌法）：將物品先用60~80℃加熱（或煮沸）1h，然后置20~25℃保存24h（或常溫過夜），使其中殘存的芽孢萌發(fā)成繁殖體，再用以上條件滅菌，如此反復(fù)三次。本法適用于不耐高溫或高溫下易變質(zhì)的物品，但很費(fèi)時(shí)。

③高壓蒸汽滅菌（熱壓滅菌法）：超過一個(gè)大氣壓時(shí)，水的沸點(diǎn)高于100℃，反之亦然。高壓蒸汽滅菌就是通過加壓提高蒸汽溫度，滅菌效果最好。它簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、可靠、無毒，是最可靠、應(yīng)用最廣泛的滅菌法。此法適用于耐高溫和潮濕的物品。常用條件為：

115.5℃

30min

121.5℃

20min

126.5℃

15min

注意事項(xiàng)：

a.必須完全排出滅菌器內(nèi)的空氣。否則會(huì)影響滅菌器內(nèi)溫度達(dá)到規(guī)定的要求。

b.注意被滅菌物品的溫度。滅菌器內(nèi)溫度與被滅菌物品的溫度一般是一致的，但在蒸汽輸入過快時(shí)，后者可能低于前者，所以升溫時(shí)要有一定的預(yù)熱時(shí)間。另外，降溫過快易引起玻璃炸裂。因此，對(duì)于一種滅菌產(chǎn)品，過濾除菌的效果與濾膜的性能、孔徑的大小、密度、濾膜的厚度等因素有關(guān)。

濾過除菌法要求最終過濾的濾膜孔徑為0.22μm。由于各廠家生產(chǎn)的相同規(guī)格的濾膜質(zhì)量并不一致，為了保證除菌效果，在使用前后應(yīng)檢查濾器的完好性（如壓力維持試驗(yàn)或起泡點(diǎn)試驗(yàn)）。

一個(gè)過濾器的使用時(shí)間應(yīng)根據(jù)品種驗(yàn)證后確定，一般不應(yīng)超過8小時(shí)。

5）輻射滅菌法輻射有兩種類型：一種是電磁波輻射，如紫外線、紅外線、微波；一種是電離輻射，如可引起被照射物電離的X射線、γ射線。

①紫外線：紫外光波長(zhǎng)在136~390nm之間，其中260nm左右能破壞核酸，殺菌作用最強(qiáng)。另外，空氣中的氧受紫外線照射后，可微量轉(zhuǎn)變?yōu)槌粞豕餐饸⒕饔?。紫外線消毒的效果與光源的功率、光源與被照射物的距離、照射時(shí)間、溫度和濕度等因素有關(guān)。我國(guó)規(guī)定紫外燈照射強(qiáng)度在距離1m處不低于70μW/cm2（以紫外線測(cè)強(qiáng)儀測(cè)定）。在操作面上要求強(qiáng)度達(dá)40μW/cm2以上。一般每10m2裝30W燈管1支，工作前開30~60min。

紫外燈的輸出功率隨使用時(shí)間增加而降低。國(guó)產(chǎn)紫外燈的平均壽命（點(diǎn)到70%額定功率的時(shí)間）一般為2000h，超過平均壽命時(shí)，就達(dá)不到預(yù)期效果，必須更換。

紫外線的穿透力很弱，不能穿透一般包裝材料，如玻璃、塑料薄膜、紙等。玻璃能強(qiáng)烈吸收小于350nm的紫外線，石英玻璃能吸收小于200nm的紫外線。因此，它主要用于空氣和物體表面消毒，特制的紫外燈裝置也可用于水的消毒。

紫外線對(duì)眼、皮膚有損壞，照射過程中產(chǎn)生的臭氧對(duì)眼、鼻腔有刺激，臭氧過多時(shí)使人頭暈、胸悶、血壓下降。

②紅外線：通過加熱碳化硅板產(chǎn)生的輻射熱能，由空氣傳導(dǎo)加熱滅菌。如紅外線烤箱，溫度可達(dá)180℃左右。熱效應(yīng)特點(diǎn)是由表及里。

③微波：微波滅菌主要是因其熱效應(yīng)。微波加熱升溫快，溫度高且均勻，殺菌作用強(qiáng)。熱效應(yīng)特點(diǎn)是由里及表。不同性質(zhì)的物品吸收微波的能力不同，其熱效應(yīng)和消毒效果也不同。

價(jià)，高劑量的輻射藥品更應(yīng)慎重。

美國(guó)藥典（？版）規(guī)定25kGy為有效滅菌劑量。1997年我國(guó)衛(wèi)生部頒發(fā)了60Co中藥滅菌標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)限國(guó)內(nèi)流通中藥可用60Co輻照滅菌，規(guī)定了允許輻照的藥材和中成藥的品種和劑量。

中藥輻照最大吸收劑量標(biāo)準(zhǔn)：

散劑

3kGy

片劑

3kGy

丸劑

5kGy

中藥原料粉

6kGy附錄：

1．藥品生產(chǎn)潔凈室（區(qū)）的空氣潔凈度等級(jí)（GMP1998）

潔凈度級(jí)別

塵粒最大允許數(shù)（個(gè)/m3）

微生物最大允許數(shù)

0.5μm

5μm

浮游菌（個(gè)/m3）

沉降菌（個(gè)/皿）

100級(jí)

3,500

0

5

1

10,000級(jí)

350,000

2,000

100

3

100,000級(jí)

3,500,000

20,000

500

10

300,000級(jí)

10,500,000

60,000

－

15

注：①我國(guó)GMP1998附錄規(guī)定：“潔凈室（區(qū)）在靜態(tài)條件下檢測(cè)的塵埃粒子數(shù)、浮游菌數(shù)或沉降菌必須符合規(guī)定，應(yīng)定期監(jiān)控動(dòng)態(tài)條件下的潔凈狀況?！币虼?，潔凈室（區(qū)）空氣潔凈度的測(cè)定要求為靜態(tài)測(cè)試，動(dòng)態(tài)監(jiān)控。對(duì)塵粒和微生物中的兩項(xiàng)測(cè)定指標(biāo)，至少各測(cè)一項(xiàng)。

②空氣潔凈度為100級(jí)的潔凈室，室內(nèi)大于等于5μm塵粒的計(jì)數(shù)，應(yīng)進(jìn)行多次采樣，當(dāng)某一測(cè)試值多次出現(xiàn)時(shí)，該值方可認(rèn)可。

③測(cè)試按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法》。

2．水和一些物料的衛(wèi)生學(xué)（法定）標(biāo)準(zhǔn)：

飲用水

某些輔料#

二部片劑

二部膠囊劑%

XX霜*

細(xì)菌總數(shù)

100/ml

1000/g

1000/g

1000/g

100/g

霉菌、酵母菌數(shù)

100/g

100/g

100/g

10/g

大腸桿菌

3/100ml

－

－

－

NC

沙門氏菌

NC

NC

NC

NC

銅綠假單胞菌

NC

NC

NC

－

金黃色葡萄球菌

NC

NC

NC

－

注：

#：包括有乳糖、藥用炭、淀粉、葡萄糖、糊精。

%：XX膠囊屬中藥制劑，含胎盤粉，按中國(guó)藥典2000版一部規(guī)定，還不得檢出沙門菌。

*：XX霜屬中藥制劑，用于創(chuàng)傷、燒傷，故要求細(xì)菌總數(shù)≤100個(gè)/g、霉菌數(shù)≤10個(gè)/g