延長(zhǎng)液相色譜柱使用壽命的方法

9/9延長(zhǎng)液相色譜柱使用壽命的方法我們的色譜柱可以有金剛不壞之身而永久服役嗎？我們都知道這是不可能的，但是倒有方法可以預(yù)防色譜柱使用壽命過(guò)短。

我們會(huì)不會(huì)覺(jué)得實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)費(fèi)好像都在用來(lái)買(mǎi)色譜柱了？我們是否會(huì)想為什么色譜廠(chǎng)家不能生產(chǎn)壽命更長(zhǎng)的色譜柱呢？實(shí)際上，如果在使用過(guò)程中有適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)，購(gòu)買(mǎi)色譜柱的費(fèi)用只占色譜分析總費(fèi)用中非常小的部分。一般色譜柱正常使用的壽命大概500-1000針左右，如果以這個(gè)數(shù)字來(lái)計(jì)算，色譜柱所占有的費(fèi)用大概是整個(gè)分析費(fèi)用的1-2%而已。所以就算是我們覺(jué)得色譜柱的單價(jià)很高，想努力增加額外的保護(hù)以增加其壽命，其實(shí)對(duì)整體分析而言也無(wú)法省下太多費(fèi)用。我的觀(guān)點(diǎn)是，如果一支色譜柱能有500針的進(jìn)樣，就可以算是完成它的使命了。在一般情況下，對(duì)色譜柱壽命的合理期望是什么樣的呢？又有哪些保護(hù)措施可以延長(zhǎng)色譜柱使用壽命？

什么是對(duì)色譜柱的壽命的合理期望呢？

首先看看另外一位色譜學(xué)家RonMajors的發(fā)現(xiàn)。在他發(fā)表的文章中，他對(duì)色譜柱的壽命做了一些調(diào)研。圖1是他在文章中對(duì)2011年調(diào)研得到的數(shù)據(jù)，我們可以看到有將近3/4的受調(diào)研者可以得到至少500針的進(jìn)樣次數(shù)（24%+47%=71%），而將近一半的可以得到至少1000針的進(jìn)樣次數(shù)（47%）。這是很令人驚訝的結(jié)果，因?yàn)檫@個(gè)調(diào)研包括了各種不同類(lèi)型的色譜柱，而不只是針對(duì)一般比較常用和耐用的150mm×4.6mm規(guī)格、粒徑為5μm的反相色譜柱。

圖12011年每支色譜柱壽命結(jié)束前的進(jìn)樣量調(diào)研結(jié)果

再來(lái)看看由1997到2011年之間又有何變化（圖2），這圖表有幾點(diǎn)值得一提：

（1）

進(jìn)樣量少于1000針（綠色）的比例由1997年的76%逐年降到2011年的53%；（2）

進(jìn)樣量超過(guò)1000針（紫色）的比例則逐年上升；（3）

進(jìn)樣量500針以?xún)?nèi)（棕色）的比例由1997的50%左右減少到2011年的25%左右；（4）

進(jìn)樣量100針以下（藍(lán)色）的不良結(jié)果在那么多年來(lái)大概就保持10%左右。

圖2

1997-2011年色譜柱壽命結(jié)束前進(jìn)樣量的比較

對(duì)這些結(jié)果我做了以下大膽的推測(cè)：首先我不認(rèn)為色譜柱壽命增加主要是因?yàn)樯V廠(chǎng)家生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)步，因?yàn)樵?997年以后（本文調(diào)研開(kāi)始），裝填色譜柱的技術(shù)已經(jīng)算是很成熟了。所以我認(rèn)為壽命增長(zhǎng)的主要原因是實(shí)驗(yàn)室人員在色譜柱的使用上得到了更好的教育和訓(xùn)練，也就是說(shuō)實(shí)驗(yàn)室人員了解如何前處理樣品和知道如何保護(hù)色譜柱。而我懷疑那些進(jìn)樣量少于100針的主要原因是不恰當(dāng)?shù)牟僮?，而不是色譜柱的問(wèn)題。這篇文章將針對(duì)如何保護(hù)色譜柱提出一些建議。

絕對(duì)不要進(jìn)樣“垃圾”

我經(jīng)常開(kāi)玩笑說(shuō)，要保護(hù)色譜柱以得到最長(zhǎng)壽命的方法就是不要開(kāi)封色譜柱。一旦開(kāi)始使用，色譜柱的壽命就逐漸衰減一直到用壞為止。而影響色譜柱壽命的兩個(gè)主要因素是樣品中的雜質(zhì)和顆粒，因此如果我們能夠在進(jìn)樣前去除樣品中的雜質(zhì)和顆粒，色譜柱的壽命一定會(huì)延長(zhǎng)。前處理的方法包括固相萃取（SPE），液液萃取和其他的過(guò)濾方法。簡(jiǎn)單地說(shuō)，如果在樣品進(jìn)入色譜柱前能大量減少其中的污染物，色譜柱的壽命一定會(huì)延長(zhǎng)，但是同時(shí)我們也必須考慮花在前處理的時(shí)間和費(fèi)用是否能得到合理的回報(bào)。如果目前使用的色譜柱已經(jīng)達(dá)到500針的進(jìn)樣量，而使用前處理所增加的時(shí)間和費(fèi)用，如果需要將色譜柱的壽命由進(jìn)樣500針增加到2500針才劃得來(lái)的話(huà)，就必須好好考慮是否前處理有其經(jīng)濟(jì)效益。但是如果進(jìn)血漿樣品，不經(jīng)過(guò)前處理，可能不到10針柱子就廢了，這時(shí)候前處理就非常有必要了。但是除了經(jīng)濟(jì)效益以外，對(duì)于使不使用前處理，對(duì)色譜數(shù)據(jù)的優(yōu)劣也必須做一個(gè)比較。在我們實(shí)驗(yàn)室中，這些前處理往往能夠讓我們即使在更低的濃度下也能收集到有效的數(shù)據(jù)，也能讓我們得到更一致的結(jié)果。

不管有沒(méi)有使用前處理，建議所有的樣品在進(jìn)樣前經(jīng)過(guò)過(guò)濾或是離心處理。例如當(dāng)樣品經(jīng)過(guò)濾膜可以濾除顆粒從而減少堵塞色譜柱的篩板，濾膜的孔隙大小必須小于色譜柱的篩板孔徑大小。一般大于3μm顆粒的色譜柱使用2μm大小的篩板，3μm顆粒的色譜柱則使用0.5μm的篩板，而小于3μm顆粒的色譜柱一般使用0.2μm的篩板，因此最通用的0.45μm的濾膜基本可以用在除了亞2μm顆粒以外所有的色譜柱；對(duì)于亞2μm顆粒的色譜柱，一般使用0.2μm大小孔隙的濾膜。大多濾膜是事先封裝好，可以直接接在注射器進(jìn)行過(guò)濾或是作為96孔板的過(guò)濾板。

雖然使用濾膜是有效果，但是建議首先考量以下四點(diǎn)：（1）濾膜并不便宜，雖然每一片的單價(jià)并不是很貴，但是加起來(lái)的費(fèi)用就不便宜了；（2）過(guò)濾會(huì)花費(fèi)額外的時(shí)間，使用0.5μm濾膜過(guò)濾很慢，而使用0.2μm濾膜就更慢了；（3）嚴(yán)格地講，一旦過(guò)濾一個(gè)樣品，對(duì)其他樣品，不管有沒(méi)有必要過(guò)濾，都得過(guò)濾，以免出現(xiàn)不必要的變量干擾實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；（4）一旦使用過(guò)濾，對(duì)方法開(kāi)發(fā)進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，也必須驗(yàn)證過(guò)濾程序。由于過(guò)濾過(guò)程往往會(huì)損失樣品，因此我們需要確定是否存在不同成分損失程度不一致的情況，特別在高濃度和低濃度的時(shí)候。

由于使用濾膜是費(fèi)時(shí)費(fèi)錢(qián)的工作，因此每個(gè)實(shí)驗(yàn)室要先做評(píng)估是否值得。但是不可否認(rèn)，使用濾膜過(guò)濾樣品在絕大多數(shù)的情形下是可以增長(zhǎng)色譜柱的壽命。

另外可以取代或是補(bǔ)充濾膜過(guò)濾的方法就是進(jìn)樣前使用離心處理樣品。這是簡(jiǎn)單又經(jīng)濟(jì)的方法。離心后，一些容易堵塞篩板的大顆粒會(huì)沉淀在離心管底部，然后可以很簡(jiǎn)單取樣進(jìn)行分析。多年來(lái)我們一直使用這種方法在蛋白樣品的分析，幾乎沒(méi)有發(fā)生過(guò)因?yàn)轭w粒堵塞色譜柱的問(wèn)題。我曾經(jīng)有過(guò)在使用UHPLC時(shí)，雖然樣品經(jīng)過(guò)0.2μm的濾膜過(guò)濾但是還是有些渾濁，進(jìn)這種樣品而造成色譜柱堵塞的經(jīng)歷，但是一旦渾濁的樣品經(jīng)過(guò)離心后，取不再渾濁的樣品進(jìn)樣，色譜柱堵塞的問(wèn)題也解決了。

使用在線(xiàn)過(guò)濾器

我深信在線(xiàn)過(guò)濾器是HPLC或UHPLC儀器上最有經(jīng)濟(jì)效益的部件。在線(xiàn)過(guò)濾器放置在自動(dòng)進(jìn)樣器和色譜柱（或是保護(hù)柱）之間，常用的在線(xiàn)過(guò)濾器分為含有可替換篩板（0.5μm或0.2μm）的不銹鋼在線(xiàn)過(guò)濾器以及一次性的PEEK材質(zhì)的在線(xiàn)過(guò)濾器，一般必須選擇比柱篩板孔徑更小的篩板，這樣才能有效攔截可能堵塞色譜柱篩板的顆粒。一旦發(fā)現(xiàn)儀器的壓力開(kāi)始增加，可能在線(xiàn)過(guò)濾器篩板開(kāi)始堵塞了，我們必須在其被完全堵塞前更新。

在線(xiàn)過(guò)濾器的功能就如同使用濾膜一樣，但是不需要任何額外的工作。使用離心機(jī)處理樣品后，還是有可能會(huì)有少許的顆粒進(jìn)入儀器，而位在色譜柱前面的在線(xiàn)濾器就可以將殘留顆粒攔截下來(lái)。此外在線(xiàn)濾器的好處是簡(jiǎn)單易換，一般只需要5分鐘就可以換好，就可以重新開(kāi)機(jī)使用，也不需要花時(shí)間重新調(diào)節(jié)或是校正。另外一個(gè)好處就是在線(xiàn)過(guò)濾器也可以過(guò)濾掉儀器中一些零配件老化耗損所產(chǎn)生的顆粒。我是非常的主張每臺(tái)液相儀器都裝配在線(xiàn)過(guò)濾器，即使使用保護(hù)柱，我也建議在保護(hù)柱前加裝在線(xiàn)過(guò)濾器。

使用保護(hù)柱

保護(hù)柱可以簡(jiǎn)單的說(shuō)是裝在色譜柱前面的一支短的色譜柱。一般是1-2cm長(zhǎng)，裝的填料和使用的色譜柱填料相匹配，而使用的篩板孔徑不會(huì)比色譜柱中使用的篩板孔徑大。保護(hù)柱有兩種功能：（1）可以阻擋可能堵塞色譜柱的顆粒；（2）因?yàn)楸Ｗo(hù)柱和色譜柱填料相匹配，任何可能和色譜柱填料產(chǎn)生不可逆作用而不出峰的化學(xué)雜質(zhì)，會(huì)被保護(hù)柱先行捕獲。

使用保護(hù)柱絕對(duì)可以延長(zhǎng)色譜柱的壽命。但是考慮是否使用保護(hù)柱前，建議評(píng)估以下幾點(diǎn)：（1）保護(hù)柱也不便宜，所以要考慮購(gòu)買(mǎi)保護(hù)柱的費(fèi)用是否能由所增加的色譜柱壽命補(bǔ)償回來(lái)；（2）保護(hù)柱的壽命有多長(zhǎng)？必須注意何時(shí)需要換保護(hù)柱芯，不要因?yàn)楦鼡Q太晚而污染到色譜柱；（3）如何沖洗保護(hù)柱？沖洗時(shí)需要將保護(hù)柱和色譜柱分開(kāi)沖洗，以免將累積在保護(hù)柱內(nèi)的不純物沖洗到色譜柱中；（4）不要期望因?yàn)榧恿?-2cm的保護(hù)柱而會(huì)增加柱效。裝上保護(hù)柱雖然類(lèi)似增加柱長(zhǎng)，但是使用保護(hù)柱也增加了兩個(gè)接頭和連接管路，這些會(huì)造成儀器系統(tǒng)柱效減少，因此如果能維持不裝保護(hù)柱時(shí)的柱效就不錯(cuò)了。

毋庸贅言，使用保護(hù)柱肯定可以延長(zhǎng)色譜柱的壽命，但是建議每個(gè)實(shí)驗(yàn)室在經(jīng)濟(jì)效益和工作量方面來(lái)評(píng)估是否需要使用保護(hù)柱。即使使用保護(hù)柱，我也會(huì)建議在保護(hù)柱和自動(dòng)進(jìn)樣器之間裝個(gè)在線(xiàn)濾器，畢竟更換在線(xiàn)濾器比更換保護(hù)柱便宜，也可以同時(shí)增加保護(hù)柱和色譜柱的壽命。