研究生分子免疫學(xué)技術(shù)-1課件

細(xì)胞因子及免疫細(xì)胞功能檢測方法簡介劉素俠山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所2011-2-23內(nèi)容細(xì)胞因子檢測的常用方法免疫細(xì)胞功能的常用檢測方法一、免疫學(xué)檢測的基本原理抗原與抗體反應(yīng)的特異性是各種免疫學(xué)檢測技術(shù)的基本原理二、細(xì)胞因子檢測方法細(xì)胞因子的臨床意義常規(guī)測定法胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測方法細(xì)胞因子檢測的主要臨床應(yīng)用

（一）細(xì)胞因子的臨床意義細(xì)胞因子與疾?。赫Ｇ闆r下，細(xì)胞因子表達(dá)和分泌受機(jī)體的嚴(yán)格調(diào)控，在病理狀態(tài)下細(xì)胞因子會出現(xiàn)異常性表達(dá)，表現(xiàn)為細(xì)胞因子及其受體的缺陷，細(xì)胞因子表達(dá)過高，以及可溶性細(xì)胞因子受體的水平增加等。細(xì)胞因子與治療：重組細(xì)胞因子做為生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑。已批準(zhǔn)生產(chǎn)：IFN-α、β、γ，Epo，GM-CSF，G-CSF，IL-2，正在進(jìn)行臨床試驗的：IL-1、3、4、6、11，M-CSF，SCF，TGF-β等

（二）常規(guī)檢測方法分子生物學(xué)測定法生物活性檢測法免疫化學(xué)測定法

1.分子生物學(xué)測定法是測定細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平，主要有兩種方法：分子雜交技術(shù)多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）PCR（polymerasechainreaction)技術(shù)，是一種高效的基因體外擴(kuò)增技術(shù)；將細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞的RNA提取出來，再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，在細(xì)胞因子引物的引導(dǎo)下，即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增；優(yōu)點：靈敏度高操作簡便缺點：測定結(jié)果只能代表細(xì)胞因子基因的表達(dá)，而不能代表活性細(xì)胞因子的水平。

5’3’5’3’變性退火延伸第二循環(huán)dsDNAssDNA加入引物5’3’3’5’dNTP,Taq酶5’3’5’5’3’3’3’5’5’3’5’5’RTPCRRT-PCR反應(yīng)過程反轉(zhuǎn)錄PCR：

mRNA---cDNA---PCR抽提RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNAPCR擴(kuò)增RT反應(yīng)體系模板：總RNA，mRNA引物：隨機(jī)引物，Oligo(dT)，基因特異性引物（GSP)逆轉(zhuǎn)錄酶：AMVM-MLVQuantReverseTranscriptasePCR反應(yīng)體系模板：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA目的基因特異性引物；反應(yīng)混合液：dNTP，Taq聚合酶，Mg++RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物檢測凝膠電泳分析：初步判斷產(chǎn)物的特異性。酶切分析：對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定、對靶基因分型及進(jìn)行變異性研究。分子雜交：檢測產(chǎn)物特異性，分析堿基突變核酸序列分析（測序）：是檢測PCR產(chǎn)物特異性的最可靠方法（1）原理實時熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

1)常用名詞概念擴(kuò)增曲線熒光閾值Ct值設(shè)定熒光域值PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號；熒光域值的設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，即：threshold=10′SDcycle3-15

意義：大于熒光背景值和陰性對照熒光最高值，進(jìn)入指數(shù)期的最初階段；真正熒光信號：熒光信號大于閾值熒光閾值（threshold）Ct值的確定橫坐標(biāo)：PCR循環(huán)數(shù)縱坐標(biāo)：熒光信號強(qiáng)度黑線：熒光域值紅線：無模板---域值下一直線綠線：樣品Ct值=17（第17個循環(huán)時，熒光信號強(qiáng)度達(dá)到域值）Ct值與起始模板的關(guān)系

研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線（2）常用標(biāo)記方法非特異性熒光標(biāo)記：

SYBRGreenI特異性熒光標(biāo)記：

TaqManProbe；

分子信標(biāo)SYBRGreenI染料法原理注意事項因為SYBRGreenI可以與所有dsDNA結(jié)合而激發(fā)熒光，因此，如果反應(yīng)體系中有非特異性擴(kuò)增或引物二聚體，也可以同時被檢測，將導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確；關(guān)鍵：設(shè)計特異性引物！結(jié)果判定——融解曲線（3）qPCR結(jié)果分析——

相對定量解析1）相對定量的必要性必須用內(nèi)對照基因（管家基因）進(jìn)行校正2）管家基因篩選管家基因：維持細(xì)胞生命活動代謝所必須的基因，如GAPDH,beta-Actin,18srRNA等；篩選方法：根據(jù)文獻(xiàn)提供；通過具體實驗。3）分析方法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法2-△△Ct法（Ct值比較法）1）雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對對照樣品、待測樣品目的基因及管家基因進(jìn)行定量，然后根據(jù)公式計算相對值，即為相對表達(dá)量。公式：校正值目的基因定量結(jié)果管家基因定量結(jié)果相對值待測樣品校正值對照樣品校正值==校正值=目的基因定量結(jié)果校正值=管家基因定量結(jié)果目的基因定量結(jié)果校正值=對照樣品校正值待測樣品校正值對照樣品校正值=待測樣品校正值對照樣品校正值相對值=待測樣品校正值對照樣品校正值優(yōu)缺點優(yōu)點：分析簡單，實驗優(yōu)化相對簡單；缺點：對每一個基因，每一輪實驗均需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線；應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究2）2-△△Ct法2-△△Ct法：假設(shè)目的基因、對照基因擴(kuò)增效率均是100%

△Ct（處理前/對照組）=18-17=1

△Ct（處理后/實驗組）=16-17.4=-1.4

△△Ct=△Ct（處理后）-△Ct（處理前)=-2.4

比率（處理后/處理前）=2-△△Ct=2--2.4=5.3結(jié)論：JUN處理后表達(dá)水平是處理前的5.3倍修正：擴(kuò)增效率不是1，而是E，

2-△△Ct可修正為（1+E）-△△Ct優(yōu)點特異性好；簡單、安全、自動化程度高；速度快、高通量；線性關(guān)系好、線性范圍寬2.生物活性檢測法

測定細(xì)胞因子的生物學(xué)活性：刺激細(xì)胞增殖、維持細(xì)胞生長和存活、抑制細(xì)胞生長、溶解或殺滅細(xì)胞、抗病毒、促進(jìn)細(xì)胞趨化、刺激細(xì)胞生成集落等活性；指示細(xì)胞：多選用造血系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)細(xì)胞，最好用依賴性細(xì)胞株細(xì)胞；顯示細(xì)胞反應(yīng)：用3H-胸腺嘧啶核苷參入，或用四唑鹽轉(zhuǎn)化引致的顏色反應(yīng)。（1）依賴性細(xì)胞株

一些腫瘤細(xì)胞株必須依賴于細(xì)胞因子方能在體外增殖，如DTLL細(xì)胞株依賴IL-2；FDC-PL細(xì)胞株依賴于小鼠IL-3；TF-1細(xì)胞株依賴于人IL-3和人GM-CSF，因而可利用這些依賴細(xì)胞株檢測相應(yīng)的細(xì)胞因子；優(yōu)點：敏感性高，特異性強(qiáng)；缺點：應(yīng)用有限。

（2）功能檢測

利用一些細(xì)胞因子的功能特性，可建立相應(yīng)的活性測定方法，如干擾素的抑制病毒感染效應(yīng)，腫瘤壞死因子對L929細(xì)胞的殺傷作用等。優(yōu)點：敏感性高；缺點：特異性不夠，容易受一些擾因素的影響。A.增殖或增殖抑制法

其基本原理是應(yīng)用某一細(xì)胞因子能特異地刺激或抑制某些指示細(xì)胞的增殖，通過3H-TdR摻入或MTT法顯色，反映待檢細(xì)胞因子的活性水平。B.集落形成法

其基本原理是應(yīng)用骨髓干細(xì)胞體外半固體培養(yǎng)系統(tǒng)，根據(jù)不同造血因子能誘導(dǎo)干細(xì)胞或定向造血祖細(xì)胞形成某一種或某些種類細(xì)胞的集落，通過對形成集落形態(tài)學(xué)、酶學(xué)鑒定，計算不同種類集落形成的數(shù)量和比例，反映待測標(biāo)本中CSF的種類和活性水平。C.直接殺傷靶細(xì)胞

細(xì)胞因子TNF-α、TNF-β具有直接殺傷某些腫瘤細(xì)胞的作用，采用TNF敏感的細(xì)胞株如小鼠成纖維細(xì)胞株L929，以WEHI164亞克隆13（鼠纖維肉瘤細(xì)胞系）作為指示細(xì)胞，通過3H-TdR釋放法或染料染色等可檢測待檢樣品中TNF的活性水平。

D.抗病毒效應(yīng)靶細(xì)胞受某些病毒感染后可發(fā)生明顯病變和死亡，干擾素可保護(hù)靶細(xì)胞免受病毒的攻擊；常用的病毒是水皰性口炎病毒（vesicularstomatitisvirus,VSV），敏感的指示細(xì)胞為喉癌的上皮細(xì)胞株Hep2和羊膜的上皮細(xì)胞WISH，通過干擾素（IFN-α、IFN-β、IFN-γ）抑制病毒致病變的程度，計算出待測樣品中IFN的活性單位。

E.趨化作用IL-8對多形核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞具有趨化作用，可用小室法或軟瓊脂趨化法，PMN或淋巴細(xì)胞作為指示細(xì)胞，以細(xì)胞趨化的程度來反映樣品中IL-8活性水平。F.抗體形成法IL-6可在體外刺激某些B淋巴細(xì)胞系產(chǎn)生和分泌免疫球蛋白；指示細(xì)胞：分泌IgG的ARH-77、CESS分泌IgM的SKW6.CL-4方法：在一定條件下，待檢樣品中IL-6水平與培養(yǎng)細(xì)胞上清IgG或IgM水平正相關(guān)，通過標(biāo)準(zhǔn)IL-6的對照可推算出待檢樣品中IL-6的活性。IL-2的誘生及生物活性測定（試驗四）

一般方法

細(xì)胞因子敏感的細(xì)胞株

細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)品及待測品指示劑：MTT，3H-TdR酶聯(lián)免疫吸附測定儀測定OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)品50%最大OD值找出與標(biāo)準(zhǔn)品50%最大OD值相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度(S)找出與標(biāo)準(zhǔn)品50%最大OD值相對應(yīng)的待測品稀釋度(A)待測品單位數(shù)=S/A×標(biāo)準(zhǔn)品單位稀釋度OD值

1/81/4S1/2A1100%OD50%OD標(biāo)準(zhǔn)品待測品對生物學(xué)活性測定法的評價優(yōu)點：靈敏度高；測定的是有生物活性的細(xì)胞因子缺點：維持靶細(xì)胞株，操作繁雜和難定量特異性差實驗周期較長易受其它因素的影響3.免疫化學(xué)測定法

用來檢測細(xì)胞因子蛋白質(zhì)的抗原特性，利用抗體對抗原表位的識別，測定的是可溶性細(xì)胞因子的抗原性。基本原理是細(xì)胞因子（或受體）與相應(yīng)的特異性抗體（單克隆抗體或多克隆抗體）結(jié)合，通過同位素、熒光素或酶等標(biāo)記技術(shù)加以放大和顯示，從而定性或定量顯示細(xì)胞因子（或受體）的水平。免疫標(biāo)記技術(shù)

RadioimmunoassayImmunofluorescence酶免疫分析

(EIA)：ELISA：體液中的細(xì)胞因子

免疫組織化學(xué)

ELISPOT：分泌細(xì)胞因子的T細(xì)胞（頻率）60（三）胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測方法測定的是細(xì)胞因子的前體分子，是單一細(xì)胞行為；一般要用先活化細(xì)胞，使之合成欲測細(xì)胞因子。在活化過程中加入蛋白質(zhì)運(yùn)輸抑制物，如莫能菌素(monensin)和布雷菲爾德菌素A，阻止了細(xì)胞因子分泌，提高了胞內(nèi)檢測的陽性率；檢測方法：ELISPOT

熒光標(biāo)記：熒光顯微鏡或FCM

活化劑活化T細(xì)胞：除特異性抗原外，主要植物血凝素(PHA)、巴豆酯(PMA)、離子霉素（ionomycin）、鈣離子載體A23187、T細(xì)胞受體抗體或CD3的抗體等；活化B細(xì)胞：特異性抗原，脂多糖（LPS）、金黃色葡萄球菌腸內(nèi)毒素A、B細(xì)胞受體抗體；活化單核細(xì)胞：LPS和某些細(xì)胞因子。人外周血單個核細(xì)胞IL-17A流式檢測方法

人外周血單個核細(xì)胞（PBMC）的分離；調(diào)整細(xì)胞濃度接種24孔板或96孔板；加入BrefeldinA，PMA和ionomycin（離子霉素），進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；一定時間后，收集細(xì)胞進(jìn)行表面抗原染色（如CD4或CD8）、固定和通透、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色、流式細(xì)胞儀測定和結(jié)果分析。(1)抗凝靜脈血(2)加等量NS(4)密度梯度離心血漿分離液RBCPBMCPMN(3)混勻后，緩慢加于分離液上

圖1.表達(dá)IL-17和IFN-的CD4+T細(xì)胞分析圖2.CD4+T細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FoxP3的檢測（四）細(xì)胞因子檢測的臨床應(yīng)用

機(jī)體免疫狀態(tài)的評估；

疾病預(yù)后及治療監(jiān)測指標(biāo)；病理變化和損傷機(jī)理研究；輔助診斷。三、常用免疫細(xì)胞功能檢測方法評價機(jī)體的特異性和非特異性免疫功能內(nèi)容

淋巴細(xì)胞的功能檢測

T細(xì)胞功能檢測B細(xì)胞功能檢測NK細(xì)胞功能檢測吞噬細(xì)胞功能檢測免疫細(xì)胞功能檢測的臨床應(yīng)用

（一）淋巴細(xì)胞功能檢測淋巴細(xì)胞功能測定可分為體內(nèi)實驗和體外實驗；體內(nèi)實驗主要是間接了解淋巴細(xì)胞對抗原、半抗原或有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng)；體外實驗主要包括淋巴細(xì)胞對抗原或有絲分裂原刺激后的增殖反應(yīng)、細(xì)胞毒性試驗及淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)物的測定淋巴細(xì)胞T細(xì)胞：介導(dǎo)細(xì)胞免疫B細(xì)胞：介導(dǎo)體液免疫NK細(xì)胞：固有免疫

1.T細(xì)胞功能檢測體外實驗：T細(xì)胞增殖試驗T細(xì)胞分泌功能測定T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗.體內(nèi)試驗（1）T淋巴細(xì)胞增殖試驗A.原理：淋巴細(xì)胞DNA合成分化母細(xì)胞刺激物細(xì)胞變大細(xì)胞漿擴(kuò)大空泡核仁明顯核染色質(zhì)疏松

未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞的形態(tài)特征轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞淋巴母細(xì)胞過渡型細(xì)胞大小(直徑μm)12～2012～166～8核大小、染色質(zhì)增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1～4個有或無無有絲分裂有或無無無胞質(zhì)、著色增多、嗜堿增多、嗜堿極少、天青色漿內(nèi)空泡有或無有或無無偽足有或無有或無無B.刺激物特異性刺激物：異種抗原：破傷風(fēng)類毒素、鏈球菌激酶、純化蛋白衍生物（purifiedproteinderivative，PPD）和白色念珠菌同種組織抗原：HLA非特異性刺激物：

PHA：人T細(xì)胞

ConA：小鼠T細(xì)胞

PWM：T、B細(xì)胞

LPS：B細(xì)胞T細(xì)胞非特異性抗原刺激植物血凝素(PHA)---人刀豆蛋白A(ConA)---小鼠淋巴母細(xì)胞化核酸、蛋白合成增加細(xì)胞體積增大分裂、增殖模擬特異性抗原刺激下T細(xì)胞的分裂、增殖過程反映T細(xì)胞功能和機(jī)體細(xì)胞免疫水平常用方法形態(tài)計數(shù)法同位素?fù)饺敕–CK-8法MTT法FCM法,第4次實驗形態(tài)計數(shù)法外周血或分離的淋巴細(xì)胞PHA涂片染色共培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察計算轉(zhuǎn)化率方法評價優(yōu)點：簡便易行，普通光學(xué)顯微鏡便能觀察結(jié)果。缺點：是依靠肉眼觀察形態(tài)學(xué)變化，判斷結(jié)果易受主觀因素影響，重復(fù)性和準(zhǔn)確性較差。同位素?fù)饺敕ㄍ庵苎蚍蛛x的淋巴細(xì)胞PHA共培養(yǎng)DNA合成增加3H-TdR3H摻入到DNA中液體閃爍儀檢測信號SI＝PHA刺激管cpm均值/對照管cpm均值優(yōu)點：敏感性高，客觀性強(qiáng)，重復(fù)性好。缺點：但需一定設(shè)備條件，同時還存在放射性核素污染問題。CCK8法(CellCountingKit8)外周血或分離的淋巴細(xì)胞PHA共培養(yǎng)DNA合成增加CCK-8存活細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫還原酶還原CCK-8水溶性、黃色甲躦顆粒光密度值酶標(biāo)儀MTT法CFSE染色檢測淋巴細(xì)胞增殖(2)T細(xì)胞分泌功能測定體外培養(yǎng)的T細(xì)胞經(jīng)各種絲裂原或抗原刺激后,分泌各種細(xì)胞因子,可借助免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)分別檢測細(xì)胞因子含量、生物學(xué)活性或基因表達(dá)水平，以反映T細(xì)胞功能。(3)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒實驗T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性是致敏的T細(xì)胞再次遇相應(yīng)靶細(xì)胞抗原，可表現(xiàn)出對靶細(xì)胞的破壞和溶解作用。評價機(jī)體細(xì)胞免疫水平；測定腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，常作為判斷預(yù)后和觀察療效的指標(biāo)之一；選用適當(dāng)?shù)陌屑?xì)胞，常用可傳代的已建株的人腫瘤細(xì)胞如人肝癌、食管癌、胃癌等細(xì)胞株，經(jīng)培養(yǎng)后制成單個細(xì)胞懸液，按一定比例與受檢的淋巴細(xì)胞混合，共溫一定時間，觀察腫瘤細(xì)胞被殺傷情況。A.原理：靶細(xì)胞抗原T細(xì)胞觀察殺傷活力致敏CTL靶細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法：淋巴細(xì)胞+腫瘤細(xì)胞計數(shù)殘留腫瘤細(xì)胞同位素法：淋巴細(xì)胞（CTL）+含51Cr的腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞破壞51Cr釋放測定γ射線B.方法意義：腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的能力

圖15-2T細(xì)胞細(xì)胞毒試驗示意圖（4）體內(nèi)試驗特異性抗原皮膚試驗PHA皮膚試驗2.B細(xì)胞功能檢測B細(xì)胞增殖能力的試驗B細(xì)胞抗體形成功能的檢測體內(nèi)試驗(1)B細(xì)胞增殖能力檢測抗IgM細(xì)菌脂多糖SPA

B細(xì)胞增殖形態(tài)學(xué)3H－TdR摻入法（2）體外抗體形成細(xì)胞檢測微量溶血分光光度法測定抗體形成細(xì)胞——QHS

溶血空斑實驗PFC——液相小室法

固相瓊脂法ELISPOT檢測特異性抗體形成細(xì)胞功能溶血空斑試驗又稱為PFC（Plaqueformingcell）測定技術(shù)，是一種體外檢測單個抗體形成細(xì)胞（漿細(xì)胞）的方法。分為直接溶血空斑試驗和間接溶血空斑試驗；直接溶血空斑試驗：測定產(chǎn)生IgM型抗體的細(xì)胞，只加細(xì)胞和補(bǔ)體；間接溶血空斑試驗：檢測產(chǎn)生IgG或IgA的細(xì)胞，加靶細(xì)胞、顯斑劑、補(bǔ)體；顯斑劑：抗各類Ig高純度的抗血清原理將經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞與一定量的綿羊紅細(xì)胞（靶細(xì)胞）混合，在補(bǔ)體參與下，使抗體形成細(xì)胞周圍結(jié)合了抗體分子的羊紅細(xì)胞溶解形成肉眼可見的溶血空斑。

溶血空斑試驗主要用于測定藥物和手術(shù)等因素對體液免疫功能的影響;評價免疫治療或免疫重建后機(jī)體產(chǎn)生抗體的能力。B細(xì)胞抗體形成功能的檢測

——酶聯(lián)免疫斑點法該方法既可檢測抗體分泌細(xì)胞，又可檢測抗體分泌量。優(yōu)點：穩(wěn)定、特異、抗原用量少；可同時檢測不同抗原誘導(dǎo)的不同抗體分泌，并可定量；可檢測組織切片中分泌抗體的單個細(xì)胞。(4)體內(nèi)實驗體內(nèi)抗體產(chǎn)生的特異性抗原有白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、多價肺炎鏈球菌菌苗等。將適量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分別采血，分離血清，測定受檢者免疫前后相應(yīng)抗體的效價，判斷受檢者體內(nèi)B細(xì)胞的功能。染色計數(shù)離心取上清測LDH或AKP離心取沉淀測活細(xì)胞熒光測發(fā)光強(qiáng)度測CPM值形態(tài)法酶釋法熒光法同位素法化學(xué)發(fā)光法3、NK細(xì)胞活性測定靶細(xì)胞溶解