DB1709-2018牦牛胚胎快速冷凍保存及解凍技術

ICS65.020.30B43

DB63青 海 省 地 方 標 準DB63/T1709—2018牦牛胚胎快速冷凍保存及解凍技術操作規(guī)程2018-12-26發(fā)布 2019-03-20實施青海省市場監(jiān)督管理局 發(fā)布DB63/T1709DB63/T1709—2018II前 言本標準依據(jù)GB/T1.1—2009的規(guī)則編寫。本標準由青海省農(nóng)牧業(yè)標準化專業(yè)技術委員會提出并歸口。本標準起草單位：青海省畜牧獸醫(yī)科學院。本標準主要起草人：徐驚濤、孫永剛、李瑞哲。DB63/T1709DB63/T1709—2018PAGEPAGE4牦牛胚胎快速冷凍保存及解凍技術操作規(guī)程范圍本標準規(guī)定了牦牛胚胎快速冷凍和解凍的操作方法。本標準適用于牦牛胚胎生產(chǎn)技術推廣應用的規(guī)范化操作。規(guī)范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T5458液氮生物容器GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T25881牛胚胎GB/T26938 牛胚胎生產(chǎn)技術規(guī)程NY/T1572牛胚胎移植技術規(guī)程DB63/T1163牦牛體外受精胚胎生產(chǎn)技術操作規(guī)程術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1牦牛胚胎 yakembryo通過自然交配、人工授精、體外受精等方式產(chǎn)生的牦牛早期受精卵（受精后6d～8d）。3.2胚胎快速冷凍 embryorapidcryopreservation經(jīng)過清洗、胚胎冷凍保護劑平衡后，將胚胎直接置入液氮中保存的一種冷凍方法。3.3胚胎解凍thawingoffrozenembryo將冷凍保存的胚胎按照操作程序融化，去除冷凍保護劑，使胚胎恢復活性的過程。試劑、耗材、設備和實驗室要求試劑、耗材和設備所用的試劑、耗材和設備以及要求見附錄A。實驗室要求冷凍保存液、解凍液及移植液必須在符合GB19489相關條款的實驗室中配制。器具清洗、消毒所用器具的清洗、消毒見附錄B。試劑配制及保存試劑配制用水試劑配制用水按照GB/T6682中的分級標準采用一級水。冷凍保存液基礎液（BS）TCM-199中加入20%胎牛血清（FBS）。平衡液（ES）TCM-199中加入7.5%乙二醇（EG）、7.5%二甲基亞砜（DMSO）、20%胎牛血清（FBS）。冷凍液（VS）TCM-199中加入15%乙二醇（EG）、15%二甲基亞砜（DMSO）、0.5mol/L蔗糖（Su）、20%胎牛血清（FBS）。胚胎解凍液解凍液（TS）TCM-199中加入1.0mol/L蔗糖（Su）和20%胎牛血清（FBS）。稀釋液（DS）TCM-199中加入0.5mol/L蔗糖（Su）和20%胎牛血清（FBS）。PBS（m-PBS）改進PBS液（m-PBS）配制見附錄C。胚胎移植液（TM）m-PBS中加入4mg/mL牛血清白蛋白（BSA）和10%胎牛血清（FBS）。解凍后胚胎培養(yǎng)液TCM-199液中加入10%胎牛血清（FBS）和100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素。試劑保存基礎液、平衡液、冷凍液、解凍液、胚胎移植液等試劑在無菌操作臺中配制，配制后的試劑用0.22μm0℃～4℃冰箱或冷藏箱中保存。每次裝、取液后，均須即時封閉試劑保存管管口。7d胚胎生產(chǎn)按照GB/T26938和DB63/T1163相關技術操作規(guī)程生產(chǎn)。胚胎冷凍及解凍前準備胚胎冷凍、解凍操作室18℃～25射，提前清理好環(huán)境衛(wèi)生，對操作臺用75%酒精進行消毒。操作人員衛(wèi)生安全清洗雙手并用75%酒精消毒，佩戴一次性口罩和手套，穿著消毒后的工作服，進行胚胎冷凍、解凍操作。冷凍、解凍前胚胎預備8鏡下進行胚胎分揀和分類。10冷凍前胚胎分級GB/T25881ABCAB胚胎快速冷凍將裝有基礎液（BS）、平衡液（ES）、快速冷凍液（VS）20min。將適量液氮倒入泡沫箱中。在胚胎快速冷凍管和冷凍管包裝袋（桶）育期、胚胎級別、存入時間等。35mm3BS、ES、VS，用移液器加入相應的液體3mL。ABBS32min～3minES23min。VS15s～20s40s（Cryotop）管片上，迅速浸入泡沫箱中的液氮中。在泡沫箱的液氮中用鑷子將胚胎快速冷凍管管片端插入套管后，放入冷凍管保存袋（桶）冷凍管保存袋（桶）GB/T5458胚胎解凍20min。35mmTS、DS、BSTM，1mi