凱氏法蛋白質(zhì)測定課件

第十一講

食品蛋白質(zhì)及氨基酸的測定

第十一講食品蛋白質(zhì)及氨基酸的測定11.蛋白質(zhì)概況蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五種元素組成。某些蛋白質(zhì)中還含有微量的P、Cu、Fe、I等。在食品和生物材料中常包括蛋白質(zhì)，可能還包括有非蛋白質(zhì)含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物堿等；含氮類脂、卟啉和含氮的色素）。第一節(jié)概述1.蛋白質(zhì)概況第一節(jié)概述2食品中蛋白質(zhì)的含量食物名稱蛋白質(zhì)含量食物名稱蛋白質(zhì)含量豬肉（肥瘦）9.5稻米8.3牛肉（肥瘦）20.1小麥粉（標(biāo)準(zhǔn))9.9羊肉（肥瘦）11.1小米9.7馬肉19.6玉米8.5驢肉18.6大豆36.3兔肉21.2大白菜1.1牛乳3.3油菜（秋）1.2乳粉（全）26.2油菜（春）2.6雞21.5菠菜2.4鴨16.5黃瓜0.8雞蛋14.7蘋果0.4大黃魚17.6桃0.8小黃魚16.7柑桔0.9帶魚18.1鴨梨0.1鮐魚21.4鯉魚17.3第一節(jié)概述食品中蛋白質(zhì)的含量食物名稱蛋白質(zhì)含量食物名稱蛋白質(zhì)含量豬肉3測定蛋白質(zhì)最基本的方法是通過先測定樣品中的總氮量，再由總氮量計(jì)算出樣品中的蛋白質(zhì)含量。食品和其原料中蛋白質(zhì)含量的測定，主要（也是最常用的）用凱氏定氮法測定總氮量和杜馬法。這里也包括非蛋白的氮，所以只能稱為粗蛋白的含量（但馬鈴薯等非蛋白氮多的要單測）。第一節(jié)概述測定蛋白質(zhì)最基本的方法是通過先測定樣品中的總氮量，再由總氮量4蛋白質(zhì)氮(克)蛋白質(zhì)氮（克）肌動蛋白（兔肌肉）16.7谷蛋白（小麥）17.6清蛋白（牛血）16.07血紅蛋白（馬）16.8清蛋白（雞蛋白）15.9胰島素A（牛肉）15.88α-淀粉酶16.23β–乳球蛋白(牛乳)15.64抗生物素蛋白(雞蛋白)14.80溶菌酶（雞蛋白）18.80全酪蛋白（牛乳）15.63肌球蛋白（兔肌肉）16.70膠原（蛋白）（牛皮）18.70木瓜蛋白酶（木瓜）17.15伴清蛋白（雞蛋白）16.6核糖核酸酶A（牛胰）17.51白明膠（小牛皮）18.1鮭精蛋白（鮭精液）31.5麥醇溶蛋白（小麥）17.66胰蛋白酶（牛胰）16.95球蛋白（南瓜籽）18.55色氨酸合成酶17.5胰島血糖素（豬）17.29玉米醇溶蛋白(玉米)16.2一些蛋白質(zhì)的含氮量第一節(jié)概述蛋白質(zhì)氮(克)蛋白質(zhì)氮（克）肌動蛋白（兔肌肉）16.7谷蛋白5一些蛋白質(zhì)的含氮量

一般為15%~17.6%，有的上下浮動可以測出總氮N=N×6.25=蛋白質(zhì)含量第一節(jié)概述一些蛋白質(zhì)的含氮量

一般為15%~17.6%62.蛋白質(zhì)定量法利用蛋白質(zhì)共性的方法定氮法雙縮脲法物理法利用特定氨基酸殘基法染料結(jié)合法福林—酚試劑法凱氏定氮法——最常用的，國內(nèi)外應(yīng)用普遍。第一節(jié)概述2.蛋白質(zhì)定量法利用蛋白質(zhì)共性的方法定氮法利用特定氨基酸殘基7一、凱氏定氮法由Kieldhl于1833年提出，現(xiàn)發(fā)展為常量、微量、自動定氮儀法，半微量法及改良凱氏法。書中只介紹前三種。1.原理樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化(digest)，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出。而樣品中的有機(jī)氮(organicnitrogen)轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定。第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定一、凱氏定氮法由Kieldhl于1833年提出，現(xiàn)發(fā)展為常量8整個過程分三步：消化、蒸餾、吸收與滴定（1）消化總反應(yīng)式：2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用濃硫酸（98%）<1>加硫酸鉀作為增溫劑，提高溶液沸點(diǎn)，純硫酸沸點(diǎn)340℃，加入硫酸鉀之后可以提高至400℃以上。也可加入硫酸鈉，氯化鉀等提高沸點(diǎn)，但效果不如硫酸鉀。第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定整個過程分三步：消化、蒸餾、吸收與滴定2NH2（CH2）2C9<2>加硫酸銅作為催化劑。還可以作消化終點(diǎn)指示劑（做蒸餾時堿性指示劑）。還可以加氧化汞、汞（均有毒，價格貴）、硒粉、二氧化鈦。<3>加氧化劑如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機(jī)物氧化速度。第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定<2>加硫酸銅作為催化劑。還可以作消化終點(diǎn)指示劑（做10消化裝置“自動回流消化儀”第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定消化裝置第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定11（2）蒸餾消化完全的樣品溶液，濃氫氧化鈉使呈堿性，加熱蒸餾，即可釋放出氨氣(NH4)2SO4+2NaOH→NH3+Na2SO4+2H2O第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定（2）蒸餾第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定12(3）吸收與滴定(titration)吸收：加熱蒸餾所放出的氨，硼酸溶液滴定：鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.8×10-10），用酸滴定不影響指示劑的變色反應(yīng)，它有吸收氨的作用也可采用硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收，然后再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液反滴定吸收液中過剩的硫酸或鹽酸，從而計(jì)算總氮量第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定(3）吸收與滴定(titration)第二節(jié)蛋白質(zhì)的測132、適用范圍（application)

此法可應(yīng)用于各類食品中蛋白質(zhì)含量測定。3、試劑濃硫酸：脫水、氧化硫酸銅：催化劑及消化指示劑硫酸鉀：提高溶液的沸點(diǎn)氫氧化鈉混合指示劑硼酸鹽酸第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定2、適用范圍（application)第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定144、操作方法（1）消化：固體樣品0.2-2g，半固體樣品2-5g，液體樣品10-20ml，加入催化劑及濃硫酸進(jìn)行消化至溶液綠色透明。（同時做空白實(shí)驗(yàn)）（2）蒸餾：按裝置進(jìn)行連接，奈氏試劑檢查，無紅棕色物質(zhì)生成(檢查氨是否全部蒸完)，蒸餾過程中用硼酸吸收。（3）滴定用0.1000mol/L鹽酸滴定至由蘭色變?yōu)槲⒓t色。（甲基紅為指示劑）第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定4、操作方法第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定155.蛋白質(zhì)計(jì)算(V1－V0)×C×0.014×F×100蛋白質(zhì)=——————————————————m×nV1－V0——滴定時所耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)；C——標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液的當(dāng)量濃度；0.14——1毫升當(dāng)量氮的克數(shù)；F——氮的蛋白質(zhì)換算系數(shù)；m——樣品克數(shù)。n——稀釋倍數(shù)第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定5.蛋白質(zhì)計(jì)算第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定166.注意事項(xiàng)當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30％過氧化氫2—3m1后再繼續(xù)加熱消化。消化時不要用強(qiáng)火，應(yīng)保持和緩沸騰，以免粘貼在凱氏瓶內(nèi)壁上的含氮化合物在無硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損失。樣品含脂肪或糖較多時，消化時間要長些。同時注意消化過程中產(chǎn)生泡沫溢出瓶外。在蒸餾過程中注意接頭處有無松漏現(xiàn)象。蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1分鐘后關(guān)掉熱源．否則可能造成吸收液倒吸。第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定6.注意事項(xiàng)第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定17二、 微量凱氏定氮法1、原理及適用范圍同前2、與常量法不同點(diǎn)：加入硼酸量有50ml10ml,滴定用鹽酸濃度由0.1mol/L0.01mol/L,可用微量滴定管。3、蒸餾裝置第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定二、 微量凱氏定氮法1、原理及適用范圍同前第二節(jié)蛋白質(zhì)的18第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定19三、 自動凱氏定氮法1、原理及適用范圍同前2、特點(diǎn)：（1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時消化8個樣品，30分鐘可消化完畢。（3）自動：自動加堿蒸餾，自動吸收和滴定，自動數(shù)字顯示裝置?？捎?jì)算總氮百分含量并記錄，12分鐘完成1個樣。第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定三、 自動凱氏定氮法1、原理及適用范圍同前第二節(jié)蛋白質(zhì)的20第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定21四、雙縮脲法傳統(tǒng)的凱氏定氮法應(yīng)用范圍廣，靈敏度高、準(zhǔn)確，不要大儀器，但費(fèi)時間，有環(huán)境污染。新開發(fā)的：雙縮脲法、紫外分光光度法、染料結(jié)合法、水楊酸比色法等。都是快速測定蛋白質(zhì)的方法第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定四、雙縮脲法傳統(tǒng)的凱氏定氮法應(yīng)用范圍廣，靈敏度高、準(zhǔn)確，不要221、原理當(dāng)脲（尿素NH2—CO—NH2）加熱至150～160℃時，可由兩個分子間脫去一個氨分子而生成二縮脲（也叫雙縮脲），反應(yīng)式如下：第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定1、原理第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定23雙縮脲與堿及少量硫酸銅溶液作用生成紫紅色的配合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定雙縮脲與堿及少量硫酸銅溶液作用生成紫紅色的配合物，此反應(yīng)稱為24蛋白質(zhì)分子含有肽鍵,

與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，故也能呈現(xiàn)此反應(yīng)而生成紫紅色配合物在一定條件下其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，據(jù)此可用吸收光度法來測定蛋白質(zhì)含量，該配合物的最大吸收波長為560nm。第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定蛋白質(zhì)分子含有肽鍵,第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定252.方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍本法靈敏度較低，但操作簡單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測定蛋白質(zhì)含量時常用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測定3.主要儀器：分光光度計(jì)，離心機(jī)（4000r/min）4.試劑：(1)堿性硫酸銅溶液(2)四氯化碳第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定2.方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定265．操作方法：

①

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用凱氏法測出的蛋白質(zhì)樣品為標(biāo)準(zhǔn)樣繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。顯色（加入試劑靜置1小時）比色（取上清離心）

②

樣品的測定顯色比色查標(biāo)準(zhǔn)曲線第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定5．操作方法：第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定276、結(jié)果計(jì)算蛋白質(zhì)（mg/100g）=式中：c—由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)mg數(shù)；m—樣品質(zhì)量，g第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定6、結(jié)果計(jì)算第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定287、說明及注意事項(xiàng)①蛋白質(zhì)的種類不同，對發(fā)色程度的影響不大，有大量脂肪存在時，會出現(xiàn)混濁可以先脫脂②標(biāo)準(zhǔn)曲線作完整后，無需每次再作標(biāo)準(zhǔn)曲線③樣品含有脯氨酸且有大量糖類存在時，顯色不好還會出現(xiàn)結(jié)果偏低。第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定7、說明及注意事項(xiàng)第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定29五、紫外吸收法1．原理：利用蛋白質(zhì)的特有基團(tuán)，對紫外光有吸收作用在280nm下，吸光度與蛋白質(zhì)濃度成直線關(guān)系，求含量。│R（—NH—CH—CO）第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定五、紫外吸收法1．原理：利用蛋白質(zhì)的特有基團(tuán)，對紫外光有吸收302．適用范圍：常用于生物化學(xué)工作，因?yàn)楦蓴_因素多，故在食品分析領(lǐng)域應(yīng)用不廣泛。3．主要儀器：①紫外分光光度計(jì)②離心機(jī)（3000—5000r/min）4．操作：用凱氏法測定作標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定2．適用范圍：常用于生物化學(xué)工作，因?yàn)楦蓴_因素多，故在食品分31第三節(jié)揮發(fā)性鹽基氮的測定揮發(fā)性鹽基氮是指動物性食品由于酶和細(xì)菌的作用，在腐敗過程中，使蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì)。此類物質(zhì)具有揮發(fā)性，在堿性溶液中蒸出后，用標(biāo)準(zhǔn)酸滴定計(jì)算含量。1.原理

揮發(fā)性鹽基氮遇到弱堿氧化鎂游離蒸餾出來，蒸餾出來的氨，被硼酸吸收后生成硼酸銨，使吸收液變?yōu)閴A性，混合指示劑由紫色變?yōu)榫G色。再由標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定至紫色。第三節(jié)揮發(fā)性鹽基氮的測定揮發(fā)性鹽基氮是指動物性食品由于酶322、試劑

2.1氧化鎂混懸液（10g/L）：稱取1.0g氧化鎂，加100mL水，振搖成混懸液。

2.2硼酸吸收液（20g/L）。

2.3鹽酸[c(HCL)=0.01mol/L]或硫酸[c(1/2H2SO4)=0.01mol/L]的標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液。

2.4甲基紅乙醇指示劑（2g/L）。

2.5次甲基藍(lán)指示劑（1g/L）。2、試劑

2.1氧化鎂混懸液（10g/L）：稱取333.分析步驟

樣品處理：精確取10g試樣（粉碎好的樣品）于200mL磨口三角瓶中，加100.0mL(V總)蒸餾水于振蕩器上振蕩30分鐘，4000轉(zhuǎn)離心。

蒸餾滴定：將盛有20.0mL吸收液及5-6滴混合指示液的錐形瓶置于冷凝管下端，并使其下端插入吸收液的液面下，準(zhǔn)確吸取10.0mL（V分?。┥鲜鰳悠飞锨逡河谡麴s器反應(yīng)室內(nèi)，加10mL氧化鎂混懸液（10g/L），迅速蓋塞，并加水以防漏氣，通入蒸汽，進(jìn)行蒸餾，蒸餾5min即停止，吸收滴定：吸收液用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液0.01mol/L）或硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，終點(diǎn)至藍(lán)紫色。同時做試劑空白試驗(yàn)。3.分析步驟

樣品處理：精確取10g試樣（粉碎好的樣品344.計(jì)算式及結(jié)果表述：

(V1-V0)×c×14X=×100m×（5/100）4.計(jì)算式及結(jié)果表述：

(V1-V035第四節(jié)氨基酸定量測定一、甲醛滴定法1、原理

氨基酸具有酸性的-COOH基和堿性的-NH2基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當(dāng)加入甲醛溶液時，-NH2基與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消失。這樣就可以用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液來滴定-COOH基，并用間接的方法測定氨基酸總量。第四節(jié)氨基酸定量測定一、甲醛滴定法362、方法特點(diǎn)及應(yīng)用此法簡單易行、快速方便。在發(fā)酵工業(yè)中常用此法測定發(fā)酵液中氨基氮含量的變化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情況，并以此作為控制發(fā)酵生產(chǎn)的指標(biāo)之一。2、方法特點(diǎn)及應(yīng)用373、試劑40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用氫氧化鈉將40%甲醛中和至淡藍(lán)色。0.1%百里酚酞乙醇溶液0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液3、試劑40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用氫氧化鈉將384、操作方法樣品溶液（氨基酸約20-30mg），+50ml蒸餾水加入3滴百里酚酞指示劑+中性甲醛20ml，搖勻，靜置1分鐘，0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定（淡蘭色，終點(diǎn)）記錄所消耗的堿液ml數(shù)。4、操作方法395、結(jié)果計(jì)算X＝（V2－VI）×C×0.014×100／V

式中：X為樣品中氨基氮含量（g／100g）；

V2------百里酚酞作指示劑時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液的體積（ml）；

V1----空白液消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液的體積（ml）；

C------氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液的濃度（mol／L）；

V-------為樣品液取用量（ml）

0.014-----為氮的毫摩爾質(zhì)量（g/mmol）5、結(jié)果計(jì)算406、說明及注意事項(xiàng)此法適用于測定食品中的游離氨基酸。固體樣品應(yīng)先進(jìn)行粉碎，準(zhǔn)確稱樣后用水萃取，然后測定萃取液；液體試樣如醬油、飲料等可直接吸取試樣進(jìn)行測定。萃取可在500C水浴中進(jìn)行0.5小時即可。若樣品顏色較深，可加適量活性炭脫色后再測定，或用電位滴定法進(jìn)行測定。與本法類似的還有單指示劑（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用標(biāo)準(zhǔn)堿完全中和-COOH基時的pH為8.5-9.5，但分析結(jié)果稍偏低，雙指示劑法的結(jié)果更準(zhǔn)確。6、說明及注意事項(xiàng)41誤差脯氨酸與甲醛作用時產(chǎn)生不穩(wěn)定的化合物，使結(jié)果偏低；酪氨酸含有酚羧基，滴定時也會消耗一些堿而致使結(jié)果偏高；溶液中若有銨存在也可與甲醛反應(yīng)，往往使結(jié)果偏高。誤差42二、電位滴定法1、

原理

根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計(jì)的玻璃電極及甘汞電極同時插入被測液中構(gòu)成電池，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，依據(jù)酸度計(jì)指示的pH值判斷和控制滴定終點(diǎn)。二、電位滴定法1、

原理432、儀器酸度計(jì)、磁力攪拌器、微量滴定管3、試劑20%中性甲醛溶液：參考甲醛滴定法試劑0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液4、操作方法pH8.2--計(jì)算總酸含量；pH9.2--試劑空白試驗(yàn)。2、儀器445、結(jié)果計(jì)算X=（V1－V2）×C×0.014×100／V式中：X為樣品中氨基酸的含量（g/l00ml）；V1--測定用樣品加人甲醛稀釋后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液的體積（ml）；V2--試劑空白試驗(yàn)加人甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（ml）；V--樣品稀釋液取用量（ml）；C--氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液的濃度（mol/L）0.014--氮的毫摩爾質(zhì)量（g/mmol）。5、結(jié)果計(jì)算456、說明本法準(zhǔn)確快速，可用于各類樣品游離氨基酸含量測定對于渾濁和色深樣液可不經(jīng)處理而直接測定。6、說明46三、其他方法1.茚三酮比色法(ninhydrinmethod)原理

氨基酸在堿性溶液中能與茚三酮作用，生成藍(lán)紫色(Ruhemannpurplecolor)化合物（除脯氨酸外均有此反應(yīng)）。該藍(lán)紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比，其最大吸收波長為570nm，故據(jù)此可以測定樣品中氨基酸含量。三、其他方法1.茚三酮比色法(ninhydrinmetho472.薄層色譜法（薄層層析法-TLC法）原理：

取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行雙向上行法展開，樣品各組分在薄層板上經(jīng)過多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質(zhì)具有相同的Rf值，不同成分則有不同的Rf值，因而各種混合物可達(dá)到彼此被分離的目的。然后用茚三酮顯色，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行對比，鑒別各種氨基酸種類，從顯色斑點(diǎn)顏色的深淺可以大致確定其含量。2.薄層色譜法（薄層層析法-TLC法）483.氨基酸自動分析儀法4.氣相色譜法5.高效液相色譜法3.氨基酸自動分析儀法49小結(jié)凱氏定氮法原理、分步、測定方法。雙縮脲法測定原理。氨基酸總量的測定方法（甲醛滴定法）。小結(jié)凱氏定氮法原理、分步、測定方法。50第十一講

食品蛋白質(zhì)及氨基酸的測定

第十一講食品蛋白質(zhì)及氨基酸的測定511.蛋白質(zhì)概況蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五種元素組成。某些蛋白質(zhì)中還含有微量的P、Cu、Fe、I等。在食品和生物材料中常包括蛋白質(zhì)，可能還包括有非蛋白質(zhì)含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物堿等；含氮類脂、卟啉和含氮的色素）。第一節(jié)概述1.蛋白質(zhì)概況第一節(jié)概述52食品中蛋白質(zhì)的含量食物名稱蛋白質(zhì)含量食物名稱蛋白質(zhì)含量豬肉（肥瘦）9.5稻米8.3牛肉（肥瘦）20.1小麥粉（標(biāo)準(zhǔn))9.9羊肉（肥瘦）11.1小米9.7馬肉19.6玉米8.5驢肉18.6大豆36.3兔肉21.2大白菜1.1牛乳3.3油菜（秋）1.2乳粉（全）26.2油菜（春）2.6雞21.5菠菜2.4鴨16.5黃瓜0.8雞蛋14.7蘋果0.4大黃魚17.6桃0.8小黃魚16.7柑桔0.9帶魚18.1鴨梨0.1鮐魚21.4鯉魚17.3第一節(jié)概述食品中蛋白質(zhì)的含量食物名稱蛋白質(zhì)含量食物名稱蛋白質(zhì)含量豬肉53測定蛋白質(zhì)最基本的方法是通過先測定樣品中的總氮量，再由總氮量計(jì)算出樣品中的蛋白質(zhì)含量。食品和其原料中蛋白質(zhì)含量的測定，主要（也是最常用的）用凱氏定氮法測定總氮量和杜馬法。這里也包括非蛋白的氮，所以只能稱為粗蛋白的含量（但馬鈴薯等非蛋白氮多的要單測）。第一節(jié)概述測定蛋白質(zhì)最基本的方法是通過先測定樣品中的總氮量，再由總氮量54蛋白質(zhì)氮(克)蛋白質(zhì)氮（克）肌動蛋白（兔肌肉）16.7谷蛋白（小麥）17.6清蛋白（牛血）16.07血紅蛋白（馬）16.8清蛋白（雞蛋白）15.9胰島素A（牛肉）15.88α-淀粉酶16.23β–乳球蛋白(牛乳)15.64抗生物素蛋白(雞蛋白)14.80溶菌酶（雞蛋白）18.80全酪蛋白（牛乳）15.63肌球蛋白（兔肌肉）16.70膠原（蛋白）（牛皮）18.70木瓜蛋白酶（木瓜）17.15伴清蛋白（雞蛋白）16.6核糖核酸酶A（牛胰）17.51白明膠（小牛皮）18.1鮭精蛋白（鮭精液）31.5麥醇溶蛋白（小麥）17.66胰蛋白酶（牛胰）16.95球蛋白（南瓜籽）18.55色氨酸合成酶17.5胰島血糖素（豬）17.29玉米醇溶蛋白(玉米)16.2一些蛋白質(zhì)的含氮量第一節(jié)概述蛋白質(zhì)氮(克)蛋白質(zhì)氮（克）肌動蛋白（兔肌肉）16.7谷蛋白55一些蛋白質(zhì)的含氮量

一般為15%~17.6%，有的上下浮動可以測出總氮N=N×6.25=蛋白質(zhì)含量第一節(jié)概述一些蛋白質(zhì)的含氮量

一般為15%~17.6%562.蛋白質(zhì)定量法利用蛋白質(zhì)共性的方法定氮法雙縮脲法物理法利用特定氨基酸殘基法染料結(jié)合法福林—酚試劑法凱氏定氮法——最常用的，國內(nèi)外應(yīng)用普遍。第一節(jié)概述2.蛋白質(zhì)定量法利用蛋白質(zhì)共性的方法定氮法利用特定氨基酸殘基57一、凱氏定氮法由Kieldhl于1833年提出，現(xiàn)發(fā)展為常量、微量、自動定氮儀法，半微量法及改良凱氏法。書中只介紹前三種。1.原理樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化(digest)，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出。而樣品中的有機(jī)氮(organicnitrogen)轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定。第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定一、凱氏定氮法由Kieldhl于1833年提出，現(xiàn)發(fā)展為常量58整個過程分三步：消化、蒸餾、吸收與滴定（1）消化總反應(yīng)式：2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用濃硫酸（98%）<1>加硫酸鉀作為增溫劑，提高溶液沸點(diǎn)，純硫酸沸點(diǎn)340℃，加入硫酸鉀之后可以提高至400℃以上。也可加入硫酸鈉，氯化鉀等提高沸點(diǎn)，但效果不如硫酸鉀。第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定整個過程分三步：消化、蒸餾、吸收與滴定2NH2（CH2）2C59<2>加硫酸銅作為催化劑。還可以作消化終點(diǎn)指示劑（做蒸餾時堿性指示劑）。還可以加氧化汞、汞（均有毒，價格貴）、硒粉、二氧化鈦。<3>加氧化劑如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機(jī)物氧化速度。第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定<2>加硫酸銅作為催化劑。還可以作消化終點(diǎn)指示劑（做60消化裝置“自動回流消化儀”第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定消化裝置第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定61（2）蒸餾消化完全的樣品溶液，濃氫氧化鈉使呈堿性，加熱蒸餾，即可釋放出氨氣(NH4)2SO4+2NaOH→NH3+Na2SO4+2H2O第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定（2）蒸餾第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定62(3）吸收與滴定(titration)吸收：加熱蒸餾所放出的氨，硼酸溶液滴定：鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.8×10-10），用酸滴定不影響指示劑的變色反應(yīng)，它有吸收氨的作用也可采用硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收，然后再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液反滴定吸收液中過剩的硫酸或鹽酸，從而計(jì)算總氮量第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定(3）吸收與滴定(titration)第二節(jié)蛋白質(zhì)的測632、適用范圍（application)

此法可應(yīng)用于各類食品中蛋白質(zhì)含量測定。3、試劑濃硫酸：脫水、氧化硫酸銅：催化劑及消化指示劑硫酸鉀：提高溶液的沸點(diǎn)氫氧化鈉混合指示劑硼酸鹽酸第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定2、適用范圍（application)第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定644、操作方法（1）消化：固體樣品0.2-2g，半固體樣品2-5g，液體樣品10-20ml，加入催化劑及濃硫酸進(jìn)行消化至溶液綠色透明。（同時做空白實(shí)驗(yàn)）（2）蒸餾：按裝置進(jìn)行連接，奈氏試劑檢查，無紅棕色物質(zhì)生成(檢查氨是否全部蒸完)，蒸餾過程中用硼酸吸收。（3）滴定用0.1000mol/L鹽酸滴定至由蘭色變?yōu)槲⒓t色。（甲基紅為指示劑）第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定4、操作方法第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定655.蛋白質(zhì)計(jì)算(V1－V0)×C×0.014×F×100蛋白質(zhì)=——————————————————m×nV1－V0——滴定時所耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)；C——標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液的當(dāng)量濃度；0.14——1毫升當(dāng)量氮的克數(shù)；F——氮的蛋白質(zhì)換算系數(shù)；m——樣品克數(shù)。n——稀釋倍數(shù)第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定5.蛋白質(zhì)計(jì)算第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定666.注意事項(xiàng)當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30％過氧化氫2—3m1后再繼續(xù)加熱消化。消化時不要用強(qiáng)火，應(yīng)保持和緩沸騰，以免粘貼在凱氏瓶內(nèi)壁上的含氮化合物在無硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損失。樣品含脂肪或糖較多時，消化時間要長些。同時注意消化過程中產(chǎn)生泡沫溢出瓶外。在蒸餾過程中注意接頭處有無松漏現(xiàn)象。蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1分鐘后關(guān)掉熱源．否則可能造成吸收液倒吸。第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定6.注意事項(xiàng)第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定67二、 微量凱氏定氮法1、原理及適用范圍同前2、與常量法不同點(diǎn)：加入硼酸量有50ml10ml,滴定用鹽酸濃度由0.1mol/L0.01mol/L,可用微量滴定管。3、蒸餾裝置第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定二、 微量凱氏定氮法1、原理及適用范圍同前第二節(jié)蛋白質(zhì)的68第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定69三、 自動凱氏定氮法1、原理及適用范圍同前2、特點(diǎn)：（1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時消化8個樣品，30分鐘可消化完畢。（3）自動：自動加堿蒸餾，自動吸收和滴定，自動數(shù)字顯示裝置?？捎?jì)算總氮百分含量并記錄，12分鐘完成1個樣。第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定三、 自動凱氏定氮法1、原理及適用范圍同前第二節(jié)蛋白質(zhì)的70第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定71四、雙縮脲法傳統(tǒng)的凱氏定氮法應(yīng)用范圍廣，靈敏度高、準(zhǔn)確，不要大儀器，但費(fèi)時間，有環(huán)境污染。新開發(fā)的：雙縮脲法、紫外分光光度法、染料結(jié)合法、水楊酸比色法等。都是快速測定蛋白質(zhì)的方法第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定四、雙縮脲法傳統(tǒng)的凱氏定氮法應(yīng)用范圍廣，靈敏度高、準(zhǔn)確，不要721、原理當(dāng)脲（尿素NH2—CO—NH2）加熱至150～160℃時，可由兩個分子間脫去一個氨分子而生成二縮脲（也叫雙縮脲），反應(yīng)式如下：第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定1、原理第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定73雙縮脲與堿及少量硫酸銅溶液作用生成紫紅色的配合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定雙縮脲與堿及少量硫酸銅溶液作用生成紫紅色的配合物，此反應(yīng)稱為74蛋白質(zhì)分子含有肽鍵,

與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，故也能呈現(xiàn)此反應(yīng)而生成紫紅色配合物在一定條件下其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，據(jù)此可用吸收光度法來測定蛋白質(zhì)含量，該配合物的最大吸收波長為560nm。第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定蛋白質(zhì)分子含有肽鍵,第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定752.方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍本法靈敏度較低，但操作簡單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測定蛋白質(zhì)含量時常用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測定3.主要儀器：分光光度計(jì)，離心機(jī)（4000r/min）4.試劑：(1)堿性硫酸銅溶液(2)四氯化碳第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定2.方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定765．操作方法：

①

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用凱氏法測出的蛋白質(zhì)樣品為標(biāo)準(zhǔn)樣繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。顯色（加入試劑靜置1小時）比色（取上清離心）

②

樣品的測定顯色比色查標(biāo)準(zhǔn)曲線第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定5．操作方法：第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定776、結(jié)果計(jì)算蛋白質(zhì)（mg/100g）=式中：c—由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)mg數(shù)；m—樣品質(zhì)量，g第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定6、結(jié)果計(jì)算第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定787、說明及注意事項(xiàng)①蛋白質(zhì)的種類不同，對發(fā)色程度的影響不大，有大量脂肪存在時，會出現(xiàn)混濁可以先脫脂②標(biāo)準(zhǔn)曲線作完整后，無需每次再作標(biāo)準(zhǔn)曲線③樣品含有脯氨酸且有大量糖類存在時，顯色不好還會出現(xiàn)結(jié)果偏低。第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定7、說明及注意事項(xiàng)第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定79五、紫外吸收法1．原理：利用蛋白質(zhì)的特有基團(tuán)，對紫外光有吸收作用在280nm下，吸光度與蛋白質(zhì)濃度成直線關(guān)系，求含量。│R（—NH—CH—CO）第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定五、紫外吸收法1．原理：利用蛋白質(zhì)的特有基團(tuán)，對紫外光有吸收802．適用范圍：常用于生物化學(xué)工作，因?yàn)楦蓴_因素多，故在食品分析領(lǐng)域應(yīng)用不廣泛。3．主要儀器：①紫外分光光度計(jì)②離心機(jī)（3000—5000r/min）4．操作：用凱氏法測定作標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線第二節(jié)蛋白質(zhì)的測定2．適用范圍：常用于生物化學(xué)工作，因?yàn)楦蓴_因素多，故在食品分81第三節(jié)揮發(fā)性鹽基氮的測定揮發(fā)性鹽基氮是指動物性食品由于酶和細(xì)菌的作用，在腐敗過程中，使蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì)。此類物質(zhì)具有揮發(fā)性，在堿性溶液中蒸出后，用標(biāo)準(zhǔn)酸滴定計(jì)算含量。1.原理

揮發(fā)性鹽基氮遇到弱堿氧化鎂游離蒸餾出來，蒸餾出來的氨，被硼酸吸收后生成硼酸銨，使吸收液變?yōu)閴A性，混合指示劑由紫色變?yōu)榫G色。再由標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定至紫色。第三節(jié)揮發(fā)性鹽基氮的測定揮發(fā)性鹽基氮是指動物性食品由于酶822、試劑

2.1氧化鎂混懸液（10g/L）：稱取1.0g氧化鎂，加100mL水，振搖成混懸液。

2.2硼酸吸收液（20g/L）。

2.3鹽酸[c(HCL)=0.01mol/L]或硫酸[c(1/2H2SO4)=0.01mol/L]的標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液。

2.4甲基紅乙醇指示劑（2g/L）。

2.5次甲基藍(lán)指示劑（1g/L）。2、試劑

2.1氧化鎂混懸液（10g/L）：稱取833.分析步驟

樣品處理：精確取10g試樣（粉碎好的樣品）于200mL磨口三角瓶中，加100.0mL(V總)蒸餾水于振蕩器上振蕩30分鐘，4000轉(zhuǎn)離心。

蒸餾滴定：將盛有20.0mL吸收液及5-6滴混合指示液的錐形瓶置于冷凝管下端，并使其下端插入吸收液的液面下，準(zhǔn)確吸取10.0mL（V分取）上述樣品上清液于蒸餾器反應(yīng)室內(nèi)，加10mL氧化鎂混懸液（10g/L），迅速蓋塞，并加水以防漏氣，通入蒸汽，進(jìn)行蒸餾，蒸餾5min即停止，吸收滴定：吸收液用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液0.01mol/L）或硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，終點(diǎn)至藍(lán)紫色。同時做試劑空白試驗(yàn)。3.分析步驟

樣品處理：精確取10g試樣（粉碎好的樣品844.計(jì)算式及結(jié)果表述：

(V1-V0)×c×14X=×100m×（5/100）4.計(jì)算式及結(jié)果表述：

(V1-V085第四節(jié)氨基酸定量測定一、甲醛滴定法1、原理

氨基酸具有酸性的-COOH基和堿性的-NH2基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當(dāng)加入甲醛溶液時，-NH2基與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消失。這樣就可以用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液來滴定-COOH基，并用間接的方法測定氨基酸總量。第四節(jié)氨基酸定量測定一、甲醛滴定法862、方法特點(diǎn)及應(yīng)用此法簡單易行、快速方便。在發(fā)酵工業(yè)中常用此法測定發(fā)酵液中氨基氮含量的變化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情況，并以此作為控制發(fā)酵生產(chǎn)的指標(biāo)之一。2、方法特點(diǎn)及應(yīng)用873、試劑40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用氫氧化鈉將40%甲醛中和至淡藍(lán)色。0.1%百里酚酞乙醇溶液0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液3、試劑40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用氫氧化鈉將884、操作方法樣品溶液（氨基酸約20-30mg），+50ml蒸餾水加入3滴百里酚酞指示劑+中性甲醛20ml，搖勻，靜置1分鐘，0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)