實(shí)驗室細(xì)胞培養(yǎng)基本知識課件

細(xì)胞培養(yǎng)基本知識細(xì)胞培養(yǎng)基本知識細(xì)胞培養(yǎng)基本概念細(xì)胞培養(yǎng)：從動物或植物中取出細(xì)胞，使其在合適的人工環(huán)境中生長。細(xì)胞來源：細(xì)胞可直接從組織中取出并采用酶或機(jī)械方法進(jìn)行解離，也可來自已經(jīng)建立的細(xì)胞系或細(xì)胞株。原代培養(yǎng)：是指將細(xì)胞從組織中分離后，使其在合適的條件下增殖，直到占據(jù)所有可用基質(zhì)(即：匯合)的培養(yǎng)階段。傳代培養(yǎng)：在細(xì)胞生長至匯合，必須將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的容器中并更換新鮮培養(yǎng)基，為其提供更多繼續(xù)生長的空間。細(xì)胞系：首次傳代培養(yǎng)后，原代培養(yǎng)物即被稱為細(xì)胞系。細(xì)胞株：如果將細(xì)胞系的一個細(xì)胞通過克隆或者其他方法從培養(yǎng)物中明確地選擇出來，就成為一個細(xì)胞株。細(xì)胞培養(yǎng)基本概念細(xì)胞培養(yǎng)：從動物或植物中取出細(xì)胞，使其在合適有限細(xì)胞系與連續(xù)細(xì)胞系：正常細(xì)胞通常只能分裂有限的次數(shù)，隨后就會喪失增殖的能力，這是一個由遺傳決定的事件，被稱為衰老；這種只能分裂有限的次數(shù)的細(xì)胞系被稱為有限細(xì)胞系。但是，一些細(xì)胞系會通過“轉(zhuǎn)化”的過程變?yōu)橛郎约?xì)胞系，這一過程可自然發(fā)生，也可經(jīng)化學(xué)或病毒誘導(dǎo)發(fā)生。有限細(xì)胞系發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得無限分裂能力后，就成為連續(xù)細(xì)胞系。培養(yǎng)條件：細(xì)胞培養(yǎng)的人工環(huán)境必須包括合適的容器，容器中含有一定的基質(zhì)或介質(zhì)，為細(xì)胞提供必需的營養(yǎng)素(氨基酸、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì))、生長因子、激素和氣體(O2、CO2)，并可調(diào)節(jié)其物理化學(xué)環(huán)境(pH、滲透壓、溫度)。細(xì)胞培養(yǎng)基本概念有限細(xì)胞系與連續(xù)細(xì)胞系：正常細(xì)胞通常只能分裂有限的次數(shù)，隨后為什么要細(xì)胞培養(yǎng)？避開機(jī)體自身調(diào)節(jié)和實(shí)驗應(yīng)激的整體因素的影響；環(huán)境控制、均一性（可以使用一批同源細(xì)胞獲得穩(wěn)定、可重復(fù)的結(jié)果）、經(jīng)濟(jì)、規(guī)模和機(jī)械化；為什么要細(xì)胞培養(yǎng)？避開機(jī)體自身調(diào)節(jié)和實(shí)驗應(yīng)激的整體因素的影響細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞和分子生物學(xué)中最重要的一項技術(shù)，可為細(xì)胞正常生理和生化(例如：代謝研究、衰老研究)、藥物和毒性化合物對細(xì)胞的作用以及致突變和致癌研究提供上佳的模型系統(tǒng)。細(xì)胞培養(yǎng)還可用于藥物篩選和開發(fā)以及生物化合物(例如：疫苗、治療性蛋白)的大規(guī)模生產(chǎn)。細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞和分子生物學(xué)中最重要的一項技術(shù)，細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗室一更二更一間二間三間走廊隔間準(zhǔn)備室細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗室一更二更一間二間三間走廊隔間準(zhǔn)備室細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備基本設(shè)備：細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥(即：層流通風(fēng)櫥或生物安全柜)培養(yǎng)箱(推薦使用濕式二氧化碳培養(yǎng)箱)水浴鍋離心機(jī)冰箱和冰柜(–20°C)細(xì)胞計數(shù)器(例如：Countess?自動細(xì)胞計數(shù)器或血球計數(shù)器)倒置顯微鏡液氮(N2)冷凍柜或凍存容器滅菌器(即：高壓滅菌器)擴(kuò)增設(shè)備：抽吸泵(蠕動泵或真空泵)pH計共聚焦顯微鏡流式細(xì)胞儀其他用品：細(xì)胞培養(yǎng)容器(例如：培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、滾瓶、多孔板)吸管和移液器注射器和針頭廢物容器培養(yǎng)基、血清和試劑細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備基本設(shè)備：擴(kuò)增設(shè)備：細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥通過維持工作區(qū)域上方穩(wěn)定、單向的HEPA過濾空氣流動，保護(hù)工作環(huán)境免受灰塵及其他空氣污染物污染。氣流可以呈水平方向，與工作臺面平行吹過，或者也可呈垂直方向，從通風(fēng)櫥上方吹向工作臺面。細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥通過維持工作區(qū)域上方穩(wěn)定、單向的HEPA過濾空實(shí)驗室細(xì)胞培養(yǎng)基本知識課件實(shí)驗室細(xì)胞培養(yǎng)基本知識課件實(shí)驗室細(xì)胞培養(yǎng)基本知識課件實(shí)驗室細(xì)胞培養(yǎng)基本知識課件實(shí)驗室細(xì)胞培養(yǎng)基本知識課件實(shí)驗室細(xì)胞培養(yǎng)基本知識課件實(shí)驗室細(xì)胞培養(yǎng)基本知識課件實(shí)驗室細(xì)胞培養(yǎng)基本知識課件準(zhǔn)備與滅菌準(zhǔn)備與滅菌滅菌方式的選擇熱穩(wěn)定的物品（玻璃器皿、金屬）用干熱滅菌：160℃，1h；熱穩(wěn)定的液體：水、鹽溶液和適度熱穩(wěn)定的塑料制品：硅樹脂、尼龍、聚丙烯、聚碳酸酯用濕熱滅菌：121℃，20min；不耐熱液體：過濾除菌；不耐熱物品：射線滅菌30min，70%乙醇擦拭。滅菌方式的選擇熱穩(wěn)定的物品（玻璃器皿、金屬）用干熱滅菌：16滅菌方式的選擇項目消毒方式玻璃器皿干熱金屬制品干熱帶螺口蓋的玻璃品高壓滅菌，將蓋懸松玻璃移液管干熱槍頭高壓滅菌離心管(5ml，15ml，50ml)高壓滅菌，直立放置EP管(1.5ml，2ml，5ml，10ml)高壓滅菌試管干熱艾本德移液器（新）高壓滅菌，整支高壓滅菌過濾瓊脂氨基酸蛋白胨抗生素EDTA牛血清白蛋白甘油膠原酶HEPES藥物甲基纖維素谷氨酸鹽酚紅生長因子鹽溶液HCL水NaHCO3NaOH血清丙酮酸鈉胰蛋白酶滅菌方式的選擇項目消毒方式玻璃器皿干熱金屬制品干熱帶螺口蓋的玻璃器皿、金屬器皿的清洗和滅菌將玻璃和金屬器皿放入含有消毒劑（次氯酸鈉）和清潔劑（Decon）的洗液中，侵泡過夜或至少2h（鋁、銅制品不得浸泡）;試管刷清洗，自來水沖洗4次，去離子水沖洗3次；倒置于烘箱中烘干；鋁箔封口保存；使用前24~48h，放入干熱滅菌箱中，160℃滅菌1h，自然冷卻后使用；100目和600目的篩網(wǎng)需要超聲清洗。玻璃器皿、金屬器皿的清洗和滅菌將玻璃和金屬器皿放入含有消毒劑塑料制品的清洗和滅菌將塑料制品放入含有消毒劑（次氯酸鈉）和清潔劑（Decon）的洗液中浸泡30min，自來水沖洗干凈；置于超聲清洗器中清洗30min；用自來水充分清洗后用去離子水清洗（塑料制品要用專用的刷子或者將自來水連上膠管伸進(jìn)塑料管內(nèi)部沖洗）；將離心管的蓋子和管體分開用圖紙包起來，直立放入滅菌鍋中濕熱滅菌121℃，20min（高速離心管尤其注意滅菌時要直立放置）；自然冷卻后置于烘箱中烘干。塑料制品的清洗和滅菌將塑料制品放入含有消毒劑（次氯酸鈉）和清水的制備和滅菌細(xì)胞培養(yǎng)需要用超純水（UPW）；第一：反向滲透或蒸餾；第二：碳過濾去除有機(jī)或無機(jī)膠體（總有機(jī)碳TOC≤10ug/L）；第三：去離子（電阻≥10MΩ/cm）；高壓滅菌121℃，20min，自然冷卻。水的制備和滅菌細(xì)胞培養(yǎng)需要用超純水（UPW）；PBS的制備燒杯中加入1L滅菌超純水；放在磁力攪拌器上，設(shè)定轉(zhuǎn)速200r/min；打開PBS干粉（1L裝）加入燒杯中；攪拌至完全溶解；PH計檢測PH為7.4，變化＜0.1；分裝至滅菌的儲液瓶中，蓋子只輕旋一圈，放入滅菌鍋中濕熱滅菌；自然冷卻后蓋緊，4℃或室溫保存。PBS的制備燒杯中加入1L滅菌超純水；配置完全培養(yǎng)基燒杯中加入1L滅菌超純水，置于磁力攪拌器上，設(shè)定200r/min，邊攪拌邊加入1袋DMEM或DMEM/F12干粉（已含L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉）；用注射器吸取超純水，將包裝袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下；干粉溶解后加入2.438gNaHCO3，攪拌至完全溶解；用HCl和NaOH調(diào)節(jié)PH為7.2，過濾除菌后（PH接近7.4）4℃保存；商業(yè)胎牛血清一般是熱滅活的，可以直接使用，如果需要過濾，先用0.22μm濾器過濾后，再用0.1μm濾器低壓過濾才能保證無菌、無支原體。雙抗：稱取氨芐青霉素0.625g，鏈霉素1g，PBS定容至100ml，4℃過夜，過濾除菌分裝。使用時如需配置200ml完全培養(yǎng)基，需加入180mlDMEM/F12，加入20ml胎牛血清，再加入2ml雙抗即可。使用時再加入血清的好處是DMEM/F12培養(yǎng)基可以4℃保存6~9個月，而加入血清后只能保存2~3周。配置完全培養(yǎng)基燒杯中加入1L滅菌超純水，置于磁力攪拌器上，設(shè)無菌操作技術(shù)無菌操作技術(shù)無菌操作技術(shù)目的：在干凈的培養(yǎng)物和含有微生物的外環(huán)境之間建立一個屏障，防止微生物的污染，細(xì)菌、支原體、酵母菌、真菌孢子等。要求：與培養(yǎng)物直接接觸的所有材料必須無菌（物品無菌），培養(yǎng)物和它的非滅菌環(huán)境之間不能有直接接觸（環(huán)境無菌）。要素：無菌工作區(qū)域、良好的個人衛(wèi)生、無菌試劑和培養(yǎng)基以及無菌操作。無菌操作技術(shù)目的：在干凈的培養(yǎng)物和含有微生物的外環(huán)境之間建立無菌工作區(qū)域——潔凈臺的使用在一個十分干凈的工作臺上開始工作（什么都沒有）；用70%乙醇充分擦洗、紫外滅菌30min；只把需要的物品（確保充分滅菌或用70%酒精擦拭）放入工作臺內(nèi)，潔凈臺不可用做儲存區(qū)域；將工作區(qū)的物品整理好（中央寬敞、容易拿取、拿取時不跨越物品、不遮擋層流）；隨時移走不再需要的物品；要在視野范圍內(nèi)操作；如有任何溢出物需隨時擦去，并用70%乙醇擦洗；實(shí)驗完畢要移走潔凈臺里的所有物品（什么都沒有），并用70%乙醇徹底擦洗工作面，然后紫外滅菌30min；無菌工作區(qū)域——潔凈臺的使用在一個十分干凈的工作臺上開始工作在通風(fēng)櫥中部開闊區(qū)域放置細(xì)胞培養(yǎng)容器移液器置于右前方易于取用的地方試劑和培養(yǎng)基置于右后方，便于吸取試管架置于中后部，用于固定其他試劑小型容器置于左后部，用于盛放廢液在通風(fēng)櫥中部開闊區(qū)域放置細(xì)胞培養(yǎng)容器實(shí)驗室細(xì)胞培養(yǎng)基本知識課件良好的個人衛(wèi)生洗手、戴上PE手套；更換潔凈服（長款）；女生要將頭發(fā)扎在身后；戴上乳膠手套；操作中經(jīng)常進(jìn)行手消毒（自動手消毒機(jī)）；如進(jìn)行有生物危險的實(shí)驗時，需要P2實(shí)驗室、生物安全柜、保證無裸露的皮膚。良好的個人衛(wèi)生洗手、戴上PE手套；外來試劑、培養(yǎng)基和培養(yǎng)物的無菌商品化試劑和培養(yǎng)基經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制以確保其無菌性，但其瓶子的外表面不是無菌的，新采購的試劑瓶子以及從冰箱或水浴槽中拿出來后，要用70%酒精擦拭滅菌再放入潔凈臺內(nèi)。自己配置的所有試劑、培養(yǎng)基和溶液必須采用適當(dāng)?shù)臏缇椒?例如：高壓蒸汽、無菌過濾)進(jìn)行滅菌。引進(jìn)的培養(yǎng)物（如購買的細(xì)胞系）是高危污染源，要先經(jīng)過檢疫，并堅持用不含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)直至證明沒有污染。外來試劑、培養(yǎng)基和培養(yǎng)物的無菌商品化試劑和培養(yǎng)基經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)箱的無菌培養(yǎng)箱是主要的污染源，應(yīng)每學(xué)期做徹底清潔（箱體、架子、隔板、托盤），可用70%酒精充分擦拭，并完全揮發(fā)晾干。培養(yǎng)箱使用時底部濕盤要加入1%硫酸銅。培養(yǎng)細(xì)胞時，盡可能選購帶滲透蓋的培養(yǎng)瓶，不僅可以在CO2環(huán)境中迅速達(dá)到平衡，而且不會有污染的危險。細(xì)胞培養(yǎng)箱的無菌培養(yǎng)箱是主要的污染源，應(yīng)每學(xué)期做徹底清潔（箱細(xì)胞培養(yǎng)中的無菌操作紫外滅菌：潔凈臺使用前、使用中的間隙、使用后都要用紫外滅菌，但光束的有效性有限，因為它不能達(dá)到縫隙中。70%酒精擦拭：潔凈臺使用前、使用中有溢出物、使用后都要擦拭，各種試劑瓶、儲液瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿，放入潔凈臺之前，必須用70%乙醇擦拭其外部，注意要選用抗乙醇的記號筆。移液：使用無菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液體；每支吸管只能使用一次，以免交叉污染。使用時方可打開無菌吸管的包裝。吸管應(yīng)始終位于工作區(qū)域內(nèi)。一般移液操作用移液管和電動移液器，微量移液操作（1ml及以下）用移液器，一次為多個器皿分裝液體用注射器，只有滅菌的部分（移液管、槍頭、注射器）可以伸進(jìn)無菌容器內(nèi)（儲液瓶、細(xì)胞培養(yǎng)瓶），移液時避免使吸管尖端觸碰到任何非滅菌物品包括瓶口螺紋的外緣。細(xì)胞培養(yǎng)中的無菌操作紫外滅菌：潔凈臺使用前、使用中的間隙、使細(xì)胞培養(yǎng)中的無菌操作加蓋：所有試劑瓶子要用深螺旋的聚丙烯蓋子，使用時要將蓋子口朝下放置在工作區(qū)域，不用時要及時蓋好，但可以不用旋緊。灼燒：開放工作臺才需要灼燒，細(xì)胞培養(yǎng)用的潔凈臺中不需要也不建議灼燒、明火既破壞了層流又難以除去生物危害物質(zhì)，還帶來了火災(zāi)隱患，明火帶來的高溫還會影響HEPA過濾的壽命。試劑瓶和培養(yǎng)瓶的操作：在潔凈臺內(nèi)可以使試劑瓶口敞開直立，但不能讓手或其他物品在開口的容器或無菌吸管的上方往來。倒出液體：任何時候都不要從試劑瓶或培養(yǎng)瓶中直接傾倒培養(yǎng)基和試劑。細(xì)胞培養(yǎng)中的無菌操作加蓋：所有試劑瓶子要用深螺旋的聚丙烯蓋子小結(jié)保持一個干凈有調(diào)理的工作空間，并僅在需要的時候才在其中工作。盡可能的預(yù)先準(zhǔn)備好再開始操作，使培養(yǎng)物在培養(yǎng)箱外停留最短的時間，而且要做到各種操作快速、簡便和順利。保持能看到操作面上的每樣?xùn)|西，時時警惕無菌面和非無菌面的偶然接觸。實(shí)驗完畢后，保持工作區(qū)的干凈整潔。小結(jié)保持一個干凈有調(diào)理的工作空間，并僅在需要的時候才在其中工污染化學(xué)污染：培養(yǎng)基、血清和水中的雜質(zhì)、內(nèi)毒素、增塑劑和去污劑；生物污染：細(xì)菌、霉菌、酵母、病毒、支原體以及其他細(xì)胞系的交叉污染。細(xì)菌：通常被細(xì)菌污染的培養(yǎng)物呈云霧狀(即：渾濁狀)，有時表面會覆蓋一層薄膜。另外，經(jīng)常還會發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的pH值突然降低。在低倍顯微鏡下可見，細(xì)菌為細(xì)胞之間移動的微小顆粒，在高倍顯微鏡下觀察可以分辨出各個細(xì)菌的形狀，有球狀、桿狀和螺旋狀等。圖為被大腸桿菌污染的293細(xì)胞污染化學(xué)污染：培養(yǎng)基、血清和水中的雜質(zhì)、內(nèi)毒素、增塑劑和去污酵母：培養(yǎng)物被酵母污染后也會變得渾濁，

但pH值變化極小，污染嚴(yán)重時pH值才會升高。在顯微鏡下，酵母呈單個卵圓形或球形顆粒，有些會芽生出較小的顆粒。圖為293細(xì)胞被酵母污染。霉菌：是真菌界的一種真核微生物，以被稱為菌絲的多細(xì)胞絲狀體形式生長。在顯微鏡下，菌絲體通常呈細(xì)束狀纖維，有時呈較為密集的孢子團(tuán)塊。病毒：是一種微觀感染性物質(zhì)，利用宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行復(fù)制。病毒體積極小，因而要檢測培養(yǎng)物中有無病毒以及將其從細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗室所用試劑中去除都十分困難。使用病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物時卻會對實(shí)驗室工作人員造成嚴(yán)重的健康威脅，特別是當(dāng)實(shí)驗室培養(yǎng)的是人或靈長類動物細(xì)胞時。酵母：培養(yǎng)物被酵母污染后也會變得渾濁，但pH值變化極小，支原體：是一種沒有細(xì)胞壁的簡單細(xì)菌，被認(rèn)為是能夠自我復(fù)制的最小的生物。由于體積極小(一般小于1微米)，支原體的檢測十分困難。可在培養(yǎng)物中持續(xù)存在造成慢性支原體感染，而不會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，表現(xiàn)為：細(xì)胞增殖速度降低、飽和密度下降以及懸浮培養(yǎng)物凝集；MycoFluor支原體檢測試劑盒：A固定細(xì)胞無污染，B固定細(xì)胞支原體污染，C活細(xì)胞支原體污染。支原體：是一種沒有細(xì)胞壁的簡單細(xì)菌，被認(rèn)為是能夠自我復(fù)制的最抗生素的使用細(xì)胞培養(yǎng)時不應(yīng)常規(guī)使用抗生素，因為連續(xù)使用抗生素會促進(jìn)抗生素耐藥性細(xì)胞株的產(chǎn)生，導(dǎo)致輕度污染持續(xù)存在。一旦將抗生素從培養(yǎng)基中去除，這種輕度污染最終將發(fā)展成大規(guī)模污染，而且連續(xù)使用抗生素還會掩蓋支原體感染及其他隱性污染。另外，有些抗生素會與細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)，干擾您研究的細(xì)胞過程?？股刂荒茏鳛閷Ω段廴镜淖詈笫侄味抑荒芏唐谑褂?，并應(yīng)盡快撤除。如果長期使用抗生素，則應(yīng)同時進(jìn)行無抗生素培養(yǎng)，以便作為鑒別隱性感染的對照?？股氐氖褂眉?xì)胞培養(yǎng)時不應(yīng)常規(guī)使用抗生素，因為連續(xù)使用抗生素細(xì)胞培養(yǎng)基本知識—獲取細(xì)胞您可以通過原代細(xì)胞建立自己的培養(yǎng)系，或者也可選擇從商業(yè)供應(yīng)商或者非盈利性供應(yīng)單位(即細(xì)胞庫)處購買已經(jīng)建立的細(xì)胞系。聲譽(yù)良好的供應(yīng)單位可提供優(yōu)質(zhì)的細(xì)胞系，而且會認(rèn)真地對細(xì)胞系進(jìn)行檢測，以確保其完好性，并且未被污染。不建議從其他實(shí)驗室借用細(xì)胞，因為這會帶來很高的污染風(fēng)險。無論來源如何，使用細(xì)胞之前都應(yīng)確保所有新到細(xì)胞系已經(jīng)過支原體污染檢測。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識—獲取細(xì)胞您可以通過原代細(xì)胞建立自己的培養(yǎng)系培養(yǎng)環(huán)境物理化學(xué)環(huán)境：溫度、pH值、滲透壓、O2和CO2；生理環(huán)境：激素和營養(yǎng)素濃度；培養(yǎng)方式：一種是使細(xì)胞在人工基質(zhì)上單層生長(即：貼壁培養(yǎng))，另一種是使細(xì)胞在培養(yǎng)基中自由漂浮生長(懸浮培養(yǎng))。除造血細(xì)胞系和其他一些細(xì)胞外，大多數(shù)脊椎動物細(xì)胞均具有貼壁依賴性，必須在合適的基質(zhì)上培養(yǎng)，且該基質(zhì)必須經(jīng)過特殊處理，以便細(xì)胞粘附和伸展。培養(yǎng)基：培養(yǎng)基是培養(yǎng)環(huán)境中最重要的成分，因為它可提供細(xì)胞生長所必需的營養(yǎng)素、生長因子和激素，并能調(diào)節(jié)培養(yǎng)體系的pH值和滲透壓。培養(yǎng)基可分為三類：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、減血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基，三者對血清添加量的要求不同。培養(yǎng)環(huán)境物理化學(xué)環(huán)境：溫度、pH值、滲透壓、O2和CO血清：是基礎(chǔ)培養(yǎng)基中極為重要的細(xì)胞生長和粘附因子、激素、脂質(zhì)和礦物質(zhì)來源。此外，血清還可調(diào)節(jié)細(xì)胞膜通透性，并可作為向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)送脂質(zhì)、酶、微量營養(yǎng)素和微量元素的載體。但是，在培養(yǎng)基中添加血清也有一些缺點(diǎn)，包括：成本高，存在標(biāo)準(zhǔn)化、特異性和變異性問題，具有一些不良效應(yīng)，如：可促進(jìn)或抑制某些細(xì)胞的生長或功能。pH值：大多數(shù)正常的哺乳動物細(xì)胞系都能在pH值為7.4的環(huán)境中生長良好，而且不同細(xì)胞株間差異極小。但是，目前發(fā)現(xiàn)有些轉(zhuǎn)化細(xì)胞系在輕度偏酸性的環(huán)境(pH7.0–7.4)中生長較好，而有些正常的成纖維細(xì)胞系更適合輕度偏堿性的環(huán)境(pH7.4–7.7)。可通過添加有機(jī)緩沖鹽(例如：HEPES)或者二氧化碳-碳酸氫鹽緩沖鹽來緩沖細(xì)胞培養(yǎng)中的pH值變化。二氧化碳：通常使用濃度為5%的二氧化碳來控制培養(yǎng)體系的pH值，大多數(shù)細(xì)胞二氧化碳濃度在4–10%之間。溫度：大多數(shù)人和哺乳動物細(xì)胞系在36℃至37℃下具有最佳生長狀態(tài)。禽類細(xì)胞系在38.5°C時具有最佳生長狀態(tài)。雖然此類細(xì)胞也可在37°C下培養(yǎng)，但其生長速度會變慢。血清：是基礎(chǔ)培養(yǎng)基中極為重要的細(xì)胞生長和粘附因子、激素、脂質(zhì)補(bǔ)充：CO2使用中的問題CO2鋼瓶漏氣問題；鋼瓶的閥門關(guān)到最小和開到最大均不會漏氣，只有開到中間大小才會漏氣；CO2氣壓過大吹壞培養(yǎng)箱濾器問題；上海減壓閥門廠樊瑞YT12X-0.1L￥380補(bǔ)充：CO2使用中的問題CO2鋼瓶漏氣問題；鋼瓶的閥門關(guān)到最培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)定期檢查培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)(即：形狀和外觀)，確認(rèn)細(xì)胞健康狀態(tài)，還要仔細(xì)觀察培養(yǎng)的細(xì)胞以確定無污染；細(xì)胞變質(zhì)的征象包括：核周顆粒、胞質(zhì)空泡、細(xì)胞隆起變圓或與基質(zhì)分離等，這些變質(zhì)征象可能為多種原因所致，例如：培養(yǎng)物污染、細(xì)胞系衰老或培養(yǎng)基中存在毒性物質(zhì)，或者這些征象僅表明培養(yǎng)物需要更換培養(yǎng)基。變質(zhì)嚴(yán)重時將會成為不可逆的變化（啟動了細(xì)胞凋亡），因此換液和傳代的頻率要避免發(fā)生這些變化，因為這些變化很難逆轉(zhuǎn)；新加入工作的培養(yǎng)員要先看一下細(xì)胞系留存的細(xì)胞參考圖片（以不同密度下拍攝），并且在以后的培養(yǎng)中經(jīng)常比較，及時發(fā)現(xiàn)問題。培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)定期檢查培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)(即：形狀和外觀)，確培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)根據(jù)形狀和外觀(即：形態(tài))可將培養(yǎng)的細(xì)胞分為三大類。成纖維樣細(xì)胞：為雙極或多極細(xì)胞，呈細(xì)長形，貼附在基質(zhì)上生長。上皮樣細(xì)胞：呈多角形，尺寸更為規(guī)則，貼附在基質(zhì)上呈散在斑片狀生長。淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞：呈球形，通常懸浮生長，不貼附在基質(zhì)表面。神經(jīng)元細(xì)胞：有多種形狀和大小，I型(有很長的軸突)，II型(沒有軸突)。成纖維樣細(xì)胞上皮樣細(xì)胞淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)根據(jù)形狀和外觀(即：形態(tài))可將培養(yǎng)的細(xì)胞分換液一旦培養(yǎng)開始就要定期為細(xì)胞更換培養(yǎng)基，即使不增殖的細(xì)胞也要更換；換液的依據(jù)：1.PH降低，PH降低通常表示乳酸蓄積，乳酸是細(xì)胞代謝的副產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性，是細(xì)胞生長的不利因素。培養(yǎng)基變橙色時需要換液，如果培養(yǎng)基變成黃色，此時PH已達(dá)到6.0，細(xì)胞將會失去活性；2.細(xì)胞的密度和類型，每種細(xì)胞都有其適合的接種密度，且生長速度也不相同，有的細(xì)胞系甚至需要每天換液和傳代，培養(yǎng)前一定要了解清楚；3.形態(tài)發(fā)生衰退，要做到對細(xì)胞形態(tài)很熟悉并且定期觀察，細(xì)胞形態(tài)衰退不可逆，要避免發(fā)生。換液一旦培養(yǎng)開始就要定期為細(xì)胞更換培養(yǎng)基，即使不增殖的細(xì)胞也換液步驟觀察培養(yǎng)基顏色，鏡檢觀察細(xì)胞的密度以及是否有污染和衰退，決定是否換液；以70%酒精擦拭培養(yǎng)瓶底；打開培養(yǎng)瓶蓋，用5ml移液器或蠕動泵吸出培養(yǎng)基；加入預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)基，如果是不易貼壁的細(xì)胞（293），可以將培養(yǎng)瓶立起，將培養(yǎng)基加在細(xì)胞培養(yǎng)面的對側(cè)，防止將細(xì)胞吹散；蓋好蓋子，放回培養(yǎng)箱。換液步驟觀察培養(yǎng)基顏色，鏡檢觀察細(xì)胞的密度以及是否有污染和衰傳代細(xì)胞生長：延遲期、對數(shù)生長期、停滯期；細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長晚期、接近匯合而未達(dá)到匯合狀態(tài)時即應(yīng)進(jìn)行傳代。正常細(xì)胞達(dá)到匯合狀態(tài)時會脫離細(xì)胞周期并停止生長，進(jìn)入停滯期(接觸抑制)，重新接種后需要較長時間才能恢復(fù)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞即使達(dá)到匯合狀態(tài)也能繼續(xù)增殖，但如不及時傳代會開始衰退，并且增殖效率逐漸降低，最后逐漸死亡；若細(xì)胞處于延滯期不要傳代，脫離細(xì)胞周期的細(xì)胞需傳代后繼續(xù)培養(yǎng)恢復(fù)；傳代要注意接種密度，若到了適合的時間還沒有匯合要增加接種密度，若很快彼此匯合要降低密度。原代前脂肪傳代比率是1:2傳代細(xì)胞生長：延遲期、對數(shù)生長期、停滯期；傳代步驟傳代準(zhǔn)備：裝有貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)容器；新的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿；一次性無菌吸管、槍頭等；完全生長培養(yǎng)基，預(yù)熱至37℃；磷酸鹽緩沖液（PBS），不含鈣、鎂和酚紅，預(yù)熱至37℃；胰蛋白酶，預(yù)熱至37℃；細(xì)胞計數(shù)器；傳代步驟吸出舊的培養(yǎng)基并丟棄；用PBS沖洗細(xì)胞(每10cm2培養(yǎng)表面積需要2mL溶液，25cm2瓶加5mlPBS)。從貼壁細(xì)胞層的對側(cè)輕輕加入沖洗液，以避免攪動細(xì)胞層，輕搖容器；吸出PBS并丟棄；傳代步驟傳代準(zhǔn)備：傳代步驟加入預(yù)熱的胰蛋白酶，試劑量應(yīng)足以覆蓋細(xì)胞層(每10cm2大約0.5mL)，輕輕搖晃容器，使胰蛋白酶完全覆蓋細(xì)胞層；將多余的胰酶吸出，將培養(yǎng)容器在37℃下孵育約2~10分鐘，不同細(xì)胞系孵育時間有所差異；在顯微鏡下觀察細(xì)胞解離情況。如果解離程度未達(dá)90%，可將孵育時間延長幾分鐘，每30秒鐘檢查一次解離情況。也可輕輕拍打培養(yǎng)容器以加快細(xì)胞解離；加入預(yù)定體積的新鮮培養(yǎng)基。吹打細(xì)胞層表面數(shù)次，使培養(yǎng)基分散。細(xì)胞計數(shù)，將細(xì)胞懸液稀釋到該細(xì)胞系推薦的接種密度；將細(xì)胞重進(jìn)接種到新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放回培養(yǎng)箱。傳代步驟加入預(yù)熱的胰蛋白酶，試劑量應(yīng)足以覆蓋細(xì)胞層(每10細(xì)胞的凍存原理：緩慢冷凍，親水的低溫保護(hù)劑（DMSO、甘油）可使細(xì)胞內(nèi)的水分離開細(xì)胞，在極低的溫度下（液氮-196℃）保存細(xì)胞，快速復(fù)蘇，減少細(xì)胞內(nèi)晶體的形成;DMSO：濃度范圍5%~15%，最佳7.5%~10%;細(xì)胞密度較高似乎有利于提高存活率（106~107）；以1℃/min的速度冷凍存活率最高，程序降溫盒；細(xì)胞的凍存原理：緩慢冷凍，親水的低溫保護(hù)劑（DMSO、甘油）凍存步驟鏡檢細(xì)胞：外觀健康、形態(tài)學(xué)特征、處于平臺期前的對數(shù)生長晚期、沒有污染；用胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)基終止消化后離心，棄去培養(yǎng)基；加入含有10%DMSO的凍存液，使細(xì)胞濃度為106~107；將細(xì)胞懸液分裝至標(biāo)記好的凍存管中，擰緊蓋子；將凍存管放入程序降溫盒中，置于-80℃過夜；次日，將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮中保存并填寫凍存記錄，一周后從液氮中取出一只驗證凍存效果，再次記錄。凍存步驟鏡檢細(xì)胞：外觀健康、形態(tài)學(xué)特征、處于平臺期前的對數(shù)生凍存細(xì)胞使用管理新獲得的細(xì)胞系應(yīng)盡快凍存幾只，稱為原始凍存；當(dāng)細(xì)胞系大量繁殖成功應(yīng)進(jìn)行凍存，作為種子儲備；應(yīng)保護(hù)好原始凍存和種子儲備，絕不可分發(fā)使用；若使用或分發(fā)該細(xì)胞系，需要連續(xù)培養(yǎng)該細(xì)胞系并分次凍存，分次凍存可分發(fā)給其他使用者，使用者需要按需自己凍存，當(dāng)使用者不在需要該細(xì)胞系時，應(yīng)予以丟棄而不可傳給他人使用；當(dāng)分次凍存將要用盡時，可從種子儲備細(xì)胞進(jìn)行補(bǔ)充，當(dāng)種子儲備低于5只時，可用原始凍存進(jìn)行補(bǔ)充，要根據(jù)細(xì)胞使用的情況盡可能多的預(yù)留分次凍存細(xì)胞。凍存細(xì)胞使用管理新獲得的細(xì)胞系應(yīng)盡快凍存幾只，稱為原始凍存；細(xì)胞轉(zhuǎn)染基本知識細(xì)胞轉(zhuǎn)染基本知識什么是轉(zhuǎn)染？為什么要做轉(zhuǎn)染實(shí)驗？細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細(xì)胞基因功能的常規(guī)工具。在研究基因功能、基因表達(dá)與調(diào)控、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)試驗中，其應(yīng)用越來越廣泛。

什么是轉(zhuǎn)染？為什么要做轉(zhuǎn)染實(shí)驗？細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如DN轉(zhuǎn)染技術(shù)的分類常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)分為兩大類，一類是瞬時轉(zhuǎn)染(transienttransfection)，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(stabletransfection)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細(xì)胞中可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動子和其它調(diào)控元件的分析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72小時內(nèi)分析結(jié)果，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測。后者也稱永久轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/10000的轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過一些選擇性標(biāo)記，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。

轉(zhuǎn)染技術(shù)的分類常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)分為兩大類，一類是瞬時瞬時轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染方法原理特點(diǎn)磷酸鈣-DNA共沉淀法磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞操作簡便但重復(fù)性差，不適用于原代細(xì)胞DEAE-葡聚糖法帶正電的DEAE-葡聚糖與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞相對簡便、結(jié)果可重復(fù)，但對細(xì)胞有一定的毒副作用，轉(zhuǎn)染時需除血清電穿孔法高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導(dǎo)入細(xì)胞適用性廣但細(xì)胞致死率高，DNA和細(xì)胞用量大，需根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗條件陽離子脂質(zhì)體法（常用）帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞適用性廣，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好，但轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化較大Biolistic顆粒傳遞法將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細(xì)胞，DNA在胞內(nèi)逐步釋放并表達(dá)可用于表皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等瞬時轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染方法原理特點(diǎn)磷酸鈣-DNA共沉淀法磷酸鈣D穩(wěn)定轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染方法原理特點(diǎn)腺病毒法通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因?qū)搿３寺鸭?xì)胞以外，不會整合到宿主染色體中；除了抗腺病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞，能感染幾乎所有的細(xì)胞類型。慢病毒法隨機(jī)整合到宿主染色體，可能導(dǎo)致基因失活或激活癌基因，攜帶基因不能太大。逆轉(zhuǎn)錄病毒法隨機(jī)整合到宿主染色體，可能導(dǎo)致基因失活或激活癌基因，攜帶基因不能太大，細(xì)胞需處于分裂期。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染方法原理特點(diǎn)腺病毒法除了卵細(xì)胞以外，不會整慢病毒表達(dá)系統(tǒng)腺病毒表達(dá)系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)病毒基因組RNADNARNA病毒原型人免疫缺陷I型病毒(HIV)

人5型腺病毒(Ad5)白血病病毒(MMLV)

載體系統(tǒng)1個表達(dá)質(zhì)粒和3個包裝質(zhì)粒1個穿梭質(zhì)粒和1個輔助質(zhì)粒1個表達(dá)質(zhì)粒宿主細(xì)胞分裂和非分裂的動物細(xì)胞分裂和非分裂的動物細(xì)胞分裂的動物細(xì)胞是否整合整合型非整合型整合型表達(dá)豐度高水平表達(dá)高水平表達(dá)高水平表達(dá)表達(dá)時間慢(2~4天)快(1~2天)快(1~2天)克隆容量不超過6kb的外源片段高達(dá)8kb的外源片段不超過6kb的外源片段免疫原性低高低過表達(dá)microRNA特別適合適合不適合RNAi特別適合適合適合慢病毒表達(dá)系統(tǒng)腺病毒表達(dá)系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)病毒基因組RN病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建感染目的細(xì)胞抗生素篩選建立單克隆細(xì)胞株擴(kuò)增單克隆細(xì)胞株Westernblot檢測擴(kuò)大培養(yǎng)2-3株Westernblot檢測病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建感染目的細(xì)胞抗生素篩選建立單克隆細(xì)胞影響轉(zhuǎn)染效率的因素有很多，細(xì)胞株本身的特性和活性，細(xì)胞培養(yǎng)條件，轉(zhuǎn)染的DNA或RNA的質(zhì)量，轉(zhuǎn)染方法，轉(zhuǎn)染試劑的選擇等。我們在實(shí)驗中最常用的方法是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法最重要的就是減小脂質(zhì)體的毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染時間的長短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要因素，通過實(shí)驗摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對于轉(zhuǎn)染效率的提高有巨大的作用。

根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的轉(zhuǎn)染方法影響轉(zhuǎn)染效率的因素有很多，細(xì)胞株本身的特性和活性，細(xì)胞培養(yǎng)條影響轉(zhuǎn)染效率的因素

1、轉(zhuǎn)染試劑2、細(xì)胞狀態(tài)3、細(xì)胞密度4、血清5、抗生素6、DNA質(zhì)量7、載體構(gòu)建影響轉(zhuǎn)染效率的因素1、轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染試劑不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同，但細(xì)胞系的選擇通常是根據(jù)實(shí)驗的需要，因此在轉(zhuǎn)染實(shí)驗前應(yīng)根據(jù)實(shí)驗要求和細(xì)胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑。每種轉(zhuǎn)染試劑都會提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株列表和文獻(xiàn)，通過這些資料可選擇最適合實(shí)驗設(shè)計的轉(zhuǎn)染試劑。當(dāng)然，最適合的是高效、低毒、方便、廉價的轉(zhuǎn)染試劑。需要注意的是脂質(zhì)體（如Lipo2000）最怕劇烈吹打，更不能震蕩，那樣脂質(zhì)體會全部失效。

轉(zhuǎn)染試劑不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同，但細(xì)胞系的選擇通常細(xì)胞狀態(tài)一般低的細(xì)胞代數(shù)（<50）能確?；蛐筒蛔?。最適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過幾次傳代后達(dá)到指數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞生長旺盛，最容易轉(zhuǎn)染。細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，這會導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為發(fā)生變化，也就是說同一種系的細(xì)胞株，在各實(shí)驗室不同培養(yǎng)條件下，其生物學(xué)性狀發(fā)生不同程度的改變，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)染特性也發(fā)生變化。因此，如果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率降低，可以嘗試轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)最佳結(jié)果。

細(xì)胞狀態(tài)一般低的細(xì)胞代數(shù)（<50）能確保基因型不變。最細(xì)胞密度不同的轉(zhuǎn)染試劑，要求轉(zhuǎn)染時的最適細(xì)胞密度各不相同，即使同一種試劑，也會因不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。轉(zhuǎn)染時過高或者過低的細(xì)胞密度會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低，以至表達(dá)水平偏低。因此，如果選用新的細(xì)胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑，最好能夠進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗并為以后的實(shí)驗建立一個穩(wěn)定方法，包括適當(dāng)?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時間等。陽離子脂質(zhì)體具有微量的細(xì)胞毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細(xì)胞數(shù)，有的要求細(xì)胞90%匯合（Lipo2000）；而有些非脂質(zhì)體的配方則要求在40%-80%之間（FugeneHD），總之是盡量在細(xì)胞最適的生理狀態(tài)下轉(zhuǎn)染，以求最佳的轉(zhuǎn)染效果。不同的實(shí)驗?zāi)康囊矔绊戅D(zhuǎn)染時的鋪板密度，比如研究細(xì)胞周期相關(guān)基因等表達(dá)周期長的基因，就需要較低的鋪板密度，所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進(jìn)行轉(zhuǎn)染的試劑。

細(xì)胞密度不同的轉(zhuǎn)染試劑，要求轉(zhuǎn)染時的最適細(xì)胞密度各不相血清血清一度曾被認(rèn)為會降低轉(zhuǎn)染效率，老一代的轉(zhuǎn)染方法往往要求轉(zhuǎn)染前后洗細(xì)胞或者在無血清培養(yǎng)基條件下轉(zhuǎn)染，但有些對此敏感的細(xì)胞如原代細(xì)胞會受到損傷，甚至死亡導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率極低。不過轉(zhuǎn)染產(chǎn)品配方幾經(jīng)革新后，對于主流的轉(zhuǎn)染試劑來說，血清的存在已經(jīng)不會影響轉(zhuǎn)染效率，甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率，如陽離子聚合物等，血清的存在會影響DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成，但只要在DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成時用無血清培養(yǎng)基來稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑就可以了，在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的，不過要特別注意：對于RNA轉(zhuǎn)染，如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關(guān)注的。通常的，血清是一種包含生長因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物，對不同細(xì)胞的生長作用有很大的差別。血清質(zhì)量的變化直接影響細(xì)胞生長，因此也會影響轉(zhuǎn)染效率。新加培養(yǎng)基的預(yù)熱對細(xì)胞轉(zhuǎn)染也很有幫助。

血清血清一度曾被認(rèn)為會降低轉(zhuǎn)染效率，老一代的轉(zhuǎn)染方法往抗生素細(xì)胞培養(yǎng)過程中往往會添加抗生素來防止污染，但是這些添加劑可能對轉(zhuǎn)染造成麻煩。比如青霉素和鏈霉素，就是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細(xì)胞無毒，但有些轉(zhuǎn)染試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這可能間接導(dǎo)致細(xì)胞死亡，造成轉(zhuǎn)染效率低。目前主流的轉(zhuǎn)染試劑全程都可以用含血清和抗生素等添加劑的完全培養(yǎng)基來操作，非常方便，省去了污染的麻煩。

抗生素細(xì)胞培養(yǎng)過程中往往會添加抗生素來防止污染，但是這些DNA質(zhì)量DNA質(zhì)量對轉(zhuǎn)染效率影響非常大。一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)（如脂質(zhì)體等）基于電荷吸引原理，如果DNA不純，帶少量的鹽離子、蛋白、代謝物污染都會顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進(jìn)行，但對GenEscort系列轉(zhuǎn)染試劑影響不大。核酸純化世界第一品牌德國QIAGEN公司提供的超純質(zhì)粒抽提試劑盒，能達(dá)到兩倍2×CsCl梯度離心以上的純度效果，使我們不必為DNA質(zhì)量操心。此外，對一些內(nèi)毒素敏感的細(xì)胞（如原代細(xì)胞，懸浮細(xì)胞和造血細(xì)胞），QIAGEN還提供可去除內(nèi)毒素污染的質(zhì)粒抽提試劑盒，在質(zhì)粒抽提過程中有效去除脂多糖分子，保證理想的轉(zhuǎn)染效果。但如果使用GenEscort轉(zhuǎn)染試劑，一般不需要這么高的DNA質(zhì)量要求。當(dāng)使用GenEscort轉(zhuǎn)染試劑時，即使采用傳統(tǒng)的酚-氯仿沉淀方法純化質(zhì)粒，仍然可達(dá)到非常好的轉(zhuǎn)染效果，但所用的質(zhì)粒量比試劑盒純化方法的DNA用量大一些。

DNA質(zhì)量DNA質(zhì)量對轉(zhuǎn)染效率影響非常大。一般的轉(zhuǎn)染載體構(gòu)建轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建（病毒載體，質(zhì)粒DNA，RNA，PCR產(chǎn)物，寡核苷酸等）也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。病毒載體對特定宿主細(xì)胞感染效率較高，但不同病毒載體有其特定的宿主，有的還要求特定的細(xì)胞周期，如逆轉(zhuǎn)錄病毒需侵染分裂期的宿主細(xì)胞，此外還需考慮一些安全問題（如基因污染）。除載體構(gòu)建外，載體的形態(tài)（超螺旋或線性DNA）及大小對轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響。如果基因產(chǎn)物對細(xì)胞有毒性作用，轉(zhuǎn)染也很難進(jìn)行。因此，選擇組成型或可調(diào)控強(qiáng)度合適的啟動子對轉(zhuǎn)染的順利進(jìn)行也很重要。

載體構(gòu)建轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建（病毒載體，質(zhì)粒DNA，RNA，主流轉(zhuǎn)染試劑推薦轉(zhuǎn)染試劑特點(diǎn)Lipo2000（Invitrogen）轉(zhuǎn)染效率高但毒性高X-tremeGENE9（Roche）轉(zhuǎn)染效率低但毒性低ExfectTransfection（Vazyme）轉(zhuǎn)染效率適中且毒性低AttracteneTransfection（Qiagen）轉(zhuǎn)染效率適中且毒性低GenEscortⅡ（南京慧基）轉(zhuǎn)染效率適中且毒性低主流轉(zhuǎn)染試劑推薦轉(zhuǎn)染試劑特點(diǎn)Lipo2000（細(xì)胞培養(yǎng)基本知識細(xì)胞培養(yǎng)基本知識細(xì)胞培養(yǎng)基本概念細(xì)胞培養(yǎng)：從動物或植物中取出細(xì)胞，使其在合適的人工環(huán)境中生長。細(xì)胞來源：細(xì)胞可直接從組織中取出并采用酶或機(jī)械方法進(jìn)行解離，也可來自已經(jīng)建立的細(xì)胞系或細(xì)胞株。原代培養(yǎng)：是指將細(xì)胞從組織中分離后，使其在合適的條件下增殖，直到占據(jù)所有可用基質(zhì)(即：匯合)的培養(yǎng)階段。傳代培養(yǎng)：在細(xì)胞生長至匯合，必須將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的容器中并更換新鮮培養(yǎng)基，為其提供更多繼續(xù)生長的空間。細(xì)胞系：首次傳代培養(yǎng)后，原代培養(yǎng)物即被稱為細(xì)胞系。細(xì)胞株：如果將細(xì)胞系的一個細(xì)胞通過克隆或者其他方法從培養(yǎng)物中明確地選擇出來，就成為一個細(xì)胞株。細(xì)胞培養(yǎng)基本概念細(xì)胞培養(yǎng)：從動物或植物中取出細(xì)胞，使其在合適有限細(xì)胞系與連續(xù)細(xì)胞系：正常細(xì)胞通常只能分裂有限的次數(shù)，隨后就會喪失增殖的能力，這是一個由遺傳決定的事件，被稱為衰老；這種只能分裂有限的次數(shù)的細(xì)胞系被稱為有限細(xì)胞系。但是，一些細(xì)胞系會通過“轉(zhuǎn)化”的過程變?yōu)橛郎约?xì)胞系，這一過程可自然發(fā)生，也可經(jīng)化學(xué)或病毒誘導(dǎo)發(fā)生。有限細(xì)胞系發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得無限分裂能力后，就成為連續(xù)細(xì)胞系。培養(yǎng)條件：細(xì)胞培養(yǎng)的人工環(huán)境必須包括合適的容器，容器中含有一定的基質(zhì)或介質(zhì)，為細(xì)胞提供必需的營養(yǎng)素(氨基酸、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì))、生長因子、激素和氣體(O2、CO2)，并可調(diào)節(jié)其物理化學(xué)環(huán)境(pH、滲透壓、溫度)。細(xì)胞培養(yǎng)基本概念有限細(xì)胞系與連續(xù)細(xì)胞系：正常細(xì)胞通常只能分裂有限的次數(shù)，隨后為什么要細(xì)胞培養(yǎng)？避開機(jī)體自身調(diào)節(jié)和實(shí)驗應(yīng)激的整體因素的影響；環(huán)境控制、均一性（可以使用一批同源細(xì)胞獲得穩(wěn)定、可重復(fù)的結(jié)果）、經(jīng)濟(jì)、規(guī)模和機(jī)械化；為什么要細(xì)胞培養(yǎng)？避開機(jī)體自身調(diào)節(jié)和實(shí)驗應(yīng)激的整體因素的影響細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞和分子生物學(xué)中最重要的一項技術(shù)，可為細(xì)胞正常生理和生化(例如：代謝研究、衰老研究)、藥物和毒性化合物對細(xì)胞的作用以及致突變和致癌研究提供上佳的模型系統(tǒng)。細(xì)胞培養(yǎng)還可用于藥物篩選和開發(fā)以及生物化合物(例如：疫苗、治療性蛋白)的大規(guī)模生產(chǎn)。細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞和分子生物學(xué)中最重要的一項技術(shù)，細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗室一更二更一間二間三間走廊隔間準(zhǔn)備室細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗室一更二更一間二間三間走廊隔間準(zhǔn)備室細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備基本設(shè)備：細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥(即：層流通風(fēng)櫥或生物安全柜)培養(yǎng)箱(推薦使用濕式二氧化碳培養(yǎng)箱)水浴鍋離心機(jī)冰箱和冰柜(–20°C)細(xì)胞計數(shù)器(例如：Countess?自動細(xì)胞計數(shù)器或血球計數(shù)器)倒置顯微鏡液氮(N2)冷凍柜或凍存容器滅菌器(即：高壓滅菌器)擴(kuò)增設(shè)備：抽吸泵(蠕動泵或真空泵)pH計共聚焦顯微鏡流式細(xì)胞儀其他用品：細(xì)胞培養(yǎng)容器(例如：培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、滾瓶、多孔板)吸管和移液器注射器和針頭廢物容器培養(yǎng)基、血清和試劑細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備基本設(shè)備：擴(kuò)增設(shè)備：細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥通過維持工作區(qū)域上方穩(wěn)定、單向的HEPA過濾空氣流動，保護(hù)工作環(huán)境免受灰塵及其他空氣污染物污染。氣流可以呈水平方向，與工作臺面平行吹過，或者也可呈垂直方向，從通風(fēng)櫥上方吹向工作臺面。細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥通過維持工作區(qū)域上方穩(wěn)定、單向的HEPA過濾空實(shí)驗室細(xì)胞培養(yǎng)基本知識課件實(shí)驗室細(xì)胞培養(yǎng)基本知識課件實(shí)驗室細(xì)胞培養(yǎng)基本知識課件實(shí)驗室細(xì)胞培養(yǎng)基本知識課件實(shí)驗室細(xì)胞培養(yǎng)基本知識課件實(shí)驗室細(xì)胞培養(yǎng)基本知識課件實(shí)驗室細(xì)胞培養(yǎng)基本知識課件實(shí)驗室細(xì)胞培養(yǎng)基本知識課件準(zhǔn)備與滅菌準(zhǔn)備與滅菌滅菌方式的選擇熱穩(wěn)定的物品（玻璃器皿、金屬）用干熱滅菌：160℃，1h；熱穩(wěn)定的液體：水、鹽溶液和適度熱穩(wěn)定的塑料制品：硅樹脂、尼龍、聚丙烯、聚碳酸酯用濕熱滅菌：121℃，20min；不耐熱液體：過濾除菌；不耐熱物品：射線滅菌30min，70%乙醇擦拭。滅菌方式的選擇熱穩(wěn)定的物品（玻璃器皿、金屬）用干熱滅菌：16滅菌方式的選擇項目消毒方式玻璃器皿干熱金屬制品干熱帶螺口蓋的玻璃品高壓滅菌，將蓋懸松玻璃移液管干熱槍頭高壓滅菌離心管(5ml，15ml，50ml)高壓滅菌，直立放置EP管(1.5ml，2ml，5ml，10ml)高壓滅菌試管干熱艾本德移液器（新）高壓滅菌，整支高壓滅菌過濾瓊脂氨基酸蛋白胨抗生素EDTA牛血清白蛋白甘油膠原酶HEPES藥物甲基纖維素谷氨酸鹽酚紅生長因子鹽溶液HCL水NaHCO3NaOH血清丙酮酸鈉胰蛋白酶滅菌方式的選擇項目消毒方式玻璃器皿干熱金屬制品干熱帶螺口蓋的玻璃器皿、金屬器皿的清洗和滅菌將玻璃和金屬器皿放入含有消毒劑（次氯酸鈉）和清潔劑（Decon）的洗液中，侵泡過夜或至少2h（鋁、銅制品不得浸泡）;試管刷清洗，自來水沖洗4次，去離子水沖洗3次；倒置于烘箱中烘干；鋁箔封口保存；使用前24~48h，放入干熱滅菌箱中，160℃滅菌1h，自然冷卻后使用；100目和600目的篩網(wǎng)需要超聲清洗。玻璃器皿、金屬器皿的清洗和滅菌將玻璃和金屬器皿放入含有消毒劑塑料制品的清洗和滅菌將塑料制品放入含有消毒劑（次氯酸鈉）和清潔劑（Decon）的洗液中浸泡30min，自來水沖洗干凈；置于超聲清洗器中清洗30min；用自來水充分清洗后用去離子水清洗（塑料制品要用專用的刷子或者將自來水連上膠管伸進(jìn)塑料管內(nèi)部沖洗）；將離心管的蓋子和管體分開用圖紙包起來，直立放入滅菌鍋中濕熱滅菌121℃，20min（高速離心管尤其注意滅菌時要直立放置）；自然冷卻后置于烘箱中烘干。塑料制品的清洗和滅菌將塑料制品放入含有消毒劑（次氯酸鈉）和清水的制備和滅菌細(xì)胞培養(yǎng)需要用超純水（UPW）；第一：反向滲透或蒸餾；第二：碳過濾去除有機(jī)或無機(jī)膠體（總有機(jī)碳TOC≤10ug/L）；第三：去離子（電阻≥10MΩ/cm）；高壓滅菌121℃，20min，自然冷卻。水的制備和滅菌細(xì)胞培養(yǎng)需要用超純水（UPW）；PBS的制備燒杯中加入1L滅菌超純水；放在磁力攪拌器上，設(shè)定轉(zhuǎn)速200r/min；打開PBS干粉（1L裝）加入燒杯中；攪拌至完全溶解；PH計檢測PH為7.4，變化＜0.1；分裝至滅菌的儲液瓶中，蓋子只輕旋一圈，放入滅菌鍋中濕熱滅菌；自然冷卻后蓋緊，4℃或室溫保存。PBS的制備燒杯中加入1L滅菌超純水；配置完全培養(yǎng)基燒杯中加入1L滅菌超純水，置于磁力攪拌器上，設(shè)定200r/min，邊攪拌邊加入1袋DMEM或DMEM/F12干粉（已含L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉）；用注射器吸取超純水，將包裝袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下；干粉溶解后加入2.438gNaHCO3，攪拌至完全溶解；用HCl和NaOH調(diào)節(jié)PH為7.2，過濾除菌后（PH接近7.4）4℃保存；商業(yè)胎牛血清一般是熱滅活的，可以直接使用，如果需要過濾，先用0.22μm濾器過濾后，再用0.1μm濾器低壓過濾才能保證無菌、無支原體。雙抗：稱取氨芐青霉素0.625g，鏈霉素1g，PBS定容至100ml，4℃過夜，過濾除菌分裝。使用時如需配置200ml完全培養(yǎng)基，需加入180mlDMEM/F12，加入20ml胎牛血清，再加入2ml雙抗即可。使用時再加入血清的好處是DMEM/F12培養(yǎng)基可以4℃保存6~9個月，而加入血清后只能保存2~3周。配置完全培養(yǎng)基燒杯中加入1L滅菌超純水，置于磁力攪拌器上，設(shè)無菌操作技術(shù)無菌操作技術(shù)無菌操作技術(shù)目的：在干凈的培養(yǎng)物和含有微生物的外環(huán)境之間建立一個屏障，防止微生物的污染，細(xì)菌、支原體、酵母菌、真菌孢子等。要求：與培養(yǎng)物直接接觸的所有材料必須無菌（物品無菌），培養(yǎng)物和它的非滅菌環(huán)境之間不能有直接接觸（環(huán)境無菌）。要素：無菌工作區(qū)域、良好的個人衛(wèi)生、無菌試劑和培養(yǎng)基以及無菌操作。無菌操作技術(shù)目的：在干凈的培養(yǎng)物和含有微生物的外環(huán)境之間建立無菌工作區(qū)域——潔凈臺的使用在一個十分干凈的工作臺上開始工作（什么都沒有）；用70%乙醇充分擦洗、紫外滅菌30min；只把需要的物品（確保充分滅菌或用70%酒精擦拭）放入工作臺內(nèi)，潔凈臺不可用做儲存區(qū)域；將工作區(qū)的物品整理好（中央寬敞、容易拿取、拿取時不跨越物品、不遮擋層流）；隨時移走不再需要的物品；要在視野范圍內(nèi)操作；如有任何溢出物需隨時擦去，并用70%乙醇擦洗；實(shí)驗完畢要移走潔凈臺里的所有物品（什么都沒有），并用70%乙醇徹底擦洗工作面，然后紫外滅菌30min；無菌工作區(qū)域——潔凈臺的使用在一個十分干凈的工作臺上開始工作在通風(fēng)櫥中部開闊區(qū)域放置細(xì)胞培養(yǎng)容器移液器置于右前方易于取用的地方試劑和培養(yǎng)基置于右后方，便于吸取試管架置于中后部，用于固定其他試劑小型容器置于左后部，用于盛放廢液在通風(fēng)櫥中部開闊區(qū)域放置細(xì)胞培養(yǎng)容器實(shí)驗室細(xì)胞培養(yǎng)基本知識課件良好的個人衛(wèi)生洗手、戴上PE手套；更換潔凈服（長款）；女生要將頭發(fā)扎在身后；戴上乳膠手套；操作中經(jīng)常進(jìn)行手消毒（自動手消毒機(jī)）；如進(jìn)行有生物危險的實(shí)驗時，需要P2實(shí)驗室、生物安全柜、保證無裸露的皮膚。良好的個人衛(wèi)生洗手、戴上PE手套；外來試劑、培養(yǎng)基和培養(yǎng)物的無菌商品化試劑和培養(yǎng)基經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制以確保其無菌性，但其瓶子的外表面不是無菌的，新采購的試劑瓶子以及從冰箱或水浴槽中拿出來后，要用70%酒精擦拭滅菌再放入潔凈臺內(nèi)。自己配置的所有試劑、培養(yǎng)基和溶液必須采用適當(dāng)?shù)臏缇椒?例如：高壓蒸汽、無菌過濾)進(jìn)行滅菌。引進(jìn)的培養(yǎng)物（如購買的細(xì)胞系）是高危污染源，要先經(jīng)過檢疫，并堅持用不含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)直至證明沒有污染。外來試劑、培養(yǎng)基和培養(yǎng)物的無菌商品化試劑和培養(yǎng)基經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)箱的無菌培養(yǎng)箱是主要的污染源，應(yīng)每學(xué)期做徹底清潔（箱體、架子、隔板、托盤），可用70%酒精充分擦拭，并完全揮發(fā)晾干。培養(yǎng)箱使用時底部濕盤要加入1%硫酸銅。培養(yǎng)細(xì)胞時，盡可能選購帶滲透蓋的培養(yǎng)瓶，不僅可以在CO2環(huán)境中迅速達(dá)到平衡，而且不會有污染的危險。細(xì)胞培養(yǎng)箱的無菌培養(yǎng)箱是主要的污染源，應(yīng)每學(xué)期做徹底清潔（箱細(xì)胞培養(yǎng)中的無菌操作紫外滅菌：潔凈臺使用前、使用中的間隙、使用后都要用紫外滅菌，但光束的有效性有限，因為它不能達(dá)到縫隙中。70%酒精擦拭：潔凈臺使用前、使用中有溢出物、使用后都要擦拭，各種試劑瓶、儲液瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿，放入潔凈臺之前，必須用70%乙醇擦拭其外部，注意要選用抗乙醇的記號筆。移液：使用無菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液體；每支吸管只能使用一次，以免交叉污染。使用時方可打開無菌吸管的包裝。吸管應(yīng)始終位于工作區(qū)域內(nèi)。一般移液操作用移液管和電動移液器，微量移液操作（1ml及以下）用移液器，一次為多個器皿分裝液體用注射器，只有滅菌的部分（移液管、槍頭、注射器）可以伸進(jìn)無菌容器內(nèi)（儲液瓶、細(xì)胞培養(yǎng)瓶），移液時避免使吸管尖端觸碰到任何非滅菌物品包括瓶口螺紋的外緣。細(xì)胞培養(yǎng)中的無菌操作紫外滅菌：潔凈臺使用前、使用中的間隙、使細(xì)胞培養(yǎng)中的無菌操作加蓋：所有試劑瓶子要用深螺旋的聚丙烯蓋子，使用時要將蓋子口朝下放置在工作區(qū)域，不用時要及時蓋好，但可以不用旋緊。灼燒：開放工作臺才需要灼燒，細(xì)胞培養(yǎng)用的潔凈臺中不需要也不建議灼燒、明火既破壞了層流又難以除去生物危害物質(zhì)，還帶來了火災(zāi)隱患，明火帶來的高溫還會影響HEPA過濾的壽命。試劑瓶和培養(yǎng)瓶的操作：在潔凈臺內(nèi)可以使試劑瓶口敞開直立，但不能讓手或其他物品在開口的容器或無菌吸管的上方往來。倒出液體：任何時候都不要從試劑瓶或培養(yǎng)瓶中直接傾倒培養(yǎng)基和試劑。細(xì)胞培養(yǎng)中的無菌操作加蓋：所有試劑瓶子要用深螺旋的聚丙烯蓋子小結(jié)保持一個干凈有調(diào)理的工作空間，并僅在需要的時候才在其中工作。盡可能的預(yù)先準(zhǔn)備好再開始操作，使培養(yǎng)物在培養(yǎng)箱外停留最短的時間，而且要做到各種操作快速、簡便和順利。保持能看到操作面上的每樣?xùn)|西，時時警惕無菌面和非無菌面的偶然接觸。實(shí)驗完畢后，保持工作區(qū)的干凈整潔。小結(jié)保持一個干凈有調(diào)理的工作空間，并僅在需要的時候才在其中工污染化學(xué)污染：培養(yǎng)基、血清和水中的雜質(zhì)、內(nèi)毒素、增塑劑和去污劑；生物污染：細(xì)菌、霉菌、酵母、病毒、支原體以及其他細(xì)胞系的交叉污染。細(xì)菌：通常被細(xì)菌污染的培養(yǎng)物呈云霧狀(即：渾濁狀)，有時表面會覆蓋一層薄膜。另外，經(jīng)常還會發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的pH值突然降低。在低倍顯微鏡下可見，細(xì)菌為細(xì)胞之間移動的微小顆粒，在高倍顯微鏡下觀察可以分辨出各個細(xì)菌的形狀，有球狀、桿狀和螺旋狀等。圖為被大腸桿菌污染的293細(xì)胞污染化學(xué)污染：培養(yǎng)基、血清和水中的雜質(zhì)、內(nèi)毒素、增塑劑和去污酵母：培養(yǎng)物被酵母污染后也會變得渾濁，

但pH值變化極小，污染嚴(yán)重時pH值才會升高。在顯微鏡下，酵母呈單個卵圓形或球形顆粒，有些會芽生出較小的顆粒。圖為293細(xì)胞被酵母污染。霉菌：是真菌界的一種真核微生物，以被稱為菌絲的多細(xì)胞絲狀體形式生長。在顯微鏡下，菌絲體通常呈細(xì)束狀纖維，有時呈較為密集的孢子團(tuán)塊。病毒：是一種微觀感染性物質(zhì)，利用宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行復(fù)制。病毒體積極小，因而要檢測培養(yǎng)物中有無病毒以及將其從細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗室所用試劑中去除都十分困難。使用病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物時卻會對實(shí)驗室工作人員造成嚴(yán)重的健康威脅，特別是當(dāng)實(shí)驗室培養(yǎng)的是人或靈長類動物細(xì)胞時。酵母：培養(yǎng)物被酵母污染后也會變得渾濁，但pH值變化極小，支原體：是一種沒有細(xì)胞壁的簡單細(xì)菌，被認(rèn)為是能夠自我復(fù)制的最小的生物。由于體積極小(一般小于1微米)，支原體的檢測十分困難?？稍谂囵B(yǎng)物中持續(xù)存在造成慢性支原體感染，而不會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，表現(xiàn)為：細(xì)胞增殖速度降低、飽和密度下降以及懸浮培養(yǎng)物凝集；MycoFluor支原體檢測試劑盒：A固定細(xì)胞無污染，B固定細(xì)胞支原體污染，C活細(xì)胞支原體污染。支原體：是一種沒有細(xì)胞壁的簡單細(xì)菌，被認(rèn)為是能夠自我復(fù)制的最抗生素的使用細(xì)胞培養(yǎng)時不應(yīng)常規(guī)使用抗生素，因為連續(xù)使用抗生素會促進(jìn)抗生素耐藥性細(xì)胞株的產(chǎn)生，導(dǎo)致輕度污染持續(xù)存在。一旦將抗生素從培養(yǎng)基中去除，這種輕度污染最終將發(fā)展成大規(guī)模污染，而且連續(xù)使用抗生素還會掩蓋支原體感染及其他隱性污染。另外，有些抗生素會與細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)，干擾您研究的細(xì)胞過程?？股刂荒茏鳛閷Ω段廴镜淖詈笫侄味抑荒芏唐谑褂茫?yīng)盡快撤除。如果長期使用抗生素，則應(yīng)同時進(jìn)行無抗生素培養(yǎng)，以便作為鑒別隱性感染的對照?？股氐氖褂眉?xì)胞培養(yǎng)時不應(yīng)常規(guī)使用抗生素，因為連續(xù)使用抗生素細(xì)胞培養(yǎng)基本知識—獲取細(xì)胞您可以通過原代細(xì)胞建立自己的培養(yǎng)系，或者也可選擇從商業(yè)供應(yīng)商或者非盈利性供應(yīng)單位(即細(xì)胞庫)處購買已經(jīng)建立的細(xì)胞系。聲譽(yù)良好的供應(yīng)單位可提供優(yōu)質(zhì)的細(xì)胞系，而且會認(rèn)真地對細(xì)胞系進(jìn)行檢測，以確保其完好性，并且未被污染。不建議從其他實(shí)驗室借用細(xì)胞，因為這會帶來很高的污染風(fēng)險。無論來源如何，使用細(xì)胞之前都應(yīng)確保所有新到細(xì)胞系已經(jīng)過支原體污染檢測。細(xì)胞培養(yǎng)基本知識—獲取細(xì)胞您可以通過原代細(xì)胞建立自己的培養(yǎng)系培養(yǎng)環(huán)境物理化學(xué)環(huán)境：溫度、pH值、滲透壓、O2和CO2；生理環(huán)境：激素和營養(yǎng)素濃度；培養(yǎng)方式：一種是使細(xì)胞在人工基質(zhì)上單層生長(即：貼壁培養(yǎng))，另一種是使細(xì)胞在培養(yǎng)基中自由漂浮生長(懸浮培養(yǎng))。除造血細(xì)胞系和其他一些細(xì)胞外，大多數(shù)脊椎動物細(xì)胞均具有貼壁依賴性，必須在合適的基質(zhì)上培養(yǎng)，且該基質(zhì)必須經(jīng)過特殊處理，以便細(xì)胞粘附和伸展。培養(yǎng)基：培養(yǎng)基是培養(yǎng)環(huán)境中最重要的成分，因為它可提供細(xì)胞生長所必需的營養(yǎng)素、生長因子和激素，并能調(diào)節(jié)培養(yǎng)體系的pH值和滲透壓。培養(yǎng)基可分為三類：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、減血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基，三者對血清添加量的要求不同。培養(yǎng)環(huán)境物理化學(xué)環(huán)境：溫度、pH值、滲透壓、O2和CO血清：是基礎(chǔ)培養(yǎng)基中極為重要的細(xì)胞生長和粘附因子、激素、脂質(zhì)和礦物質(zhì)來源。此外，血清還可調(diào)節(jié)細(xì)胞膜通透性，并可作為向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)送脂質(zhì)、酶、微量營養(yǎng)素和微量元素的載體。但是，在培養(yǎng)基中添加血清也有一些缺點(diǎn)，包括：成本高，存在標(biāo)準(zhǔn)化、特異性和變異性問題，具有一些不良效應(yīng)，如：可促進(jìn)或抑制某些細(xì)胞的生長或功能。pH值：大多數(shù)正常的哺乳動物細(xì)胞系都能在pH值為7.4的環(huán)境中生長良好，而且不同細(xì)胞株間差異極小。但是，目前發(fā)現(xiàn)有些轉(zhuǎn)化細(xì)胞系在輕度偏酸性的環(huán)境(pH7.0–7.4)中生長較好，而有些正常的成纖維細(xì)胞系更適合輕度偏堿性的環(huán)境(pH7.4–7.7)。可通過添加有機(jī)緩沖鹽(例如：HEPES)或者二氧化碳-碳酸氫鹽緩沖鹽來緩沖細(xì)胞培養(yǎng)中的pH值變化。二氧化碳：通常使用濃度為5%的二氧化碳來控制培養(yǎng)體系的pH值，大多數(shù)細(xì)胞二氧化碳濃度在4–10%之間。溫度：大多數(shù)人和哺乳動物細(xì)胞系在36℃至37℃下具有最佳生長狀態(tài)。禽類細(xì)胞系在38.5°C時具有最佳生長狀態(tài)。雖然此類細(xì)胞也可在37°C下培養(yǎng)，但其生長速度會變慢。血清：是基礎(chǔ)培養(yǎng)基中極為重要的細(xì)胞生長和粘附因子、激素、脂質(zhì)補(bǔ)充：CO2使用中的問題CO2鋼瓶漏氣問題；鋼瓶的閥門關(guān)到最小和開到最大均不會漏氣，只有開到中間大小才會漏氣；CO2氣壓過大吹壞培養(yǎng)箱濾器問題；上海減壓閥門廠樊瑞YT12X-0.1L￥380補(bǔ)充：CO2使用中的問題CO2鋼瓶漏氣問題；鋼瓶的閥門關(guān)到最培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)定期檢查培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)(即：形狀和外觀)，確認(rèn)細(xì)胞健康狀態(tài)，還要仔細(xì)觀察培養(yǎng)的細(xì)胞以確定無污染；細(xì)胞變質(zhì)的征象包括：核周顆粒、胞質(zhì)空泡、細(xì)胞隆起變圓或與基質(zhì)分離等，這些變質(zhì)征象可能為多種原因所致，例如：培養(yǎng)物污染、細(xì)胞系衰老或培養(yǎng)基中存在毒性物質(zhì)，或者這些征象僅表明培養(yǎng)物需要更換培養(yǎng)基。變質(zhì)嚴(yán)重時將會成為不可逆的變化（啟動了細(xì)胞凋亡），因此換液和傳代的頻率要避免發(fā)生這些變化，因為這些變化很難逆轉(zhuǎn)；新加入工作的培養(yǎng)員要先看一下細(xì)胞系留存的細(xì)胞參考圖片（以不同密度下拍攝），并且在以后的培養(yǎng)中經(jīng)常比較，及時發(fā)現(xiàn)問題。培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)定期檢查培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)(即：形狀和外觀)，確培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)根據(jù)形狀和外觀(即：形態(tài))可將培養(yǎng)的細(xì)胞分為三大類。成纖維樣細(xì)胞：為雙極或多極細(xì)胞，呈細(xì)長形，貼附在基質(zhì)上生長。上皮樣細(xì)胞：呈多角形，尺寸更為規(guī)則，貼附在基質(zhì)上呈散在斑片狀生長。淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞：呈球形，通常懸浮生長，不貼附在基質(zhì)表面。神經(jīng)元細(xì)胞：有多種形狀和大小，I型(有很長的軸突)，II型(沒有軸突)。成纖維樣細(xì)胞上皮樣細(xì)胞淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)根據(jù)形狀和外觀(即：形態(tài))可將培養(yǎng)的細(xì)胞分換液一旦培養(yǎng)開始就要定期為細(xì)胞更換培養(yǎng)基，即使不增殖的細(xì)胞也要更換；換液的依據(jù)：1.PH降低，PH降低通常表示乳酸蓄積，乳酸是細(xì)胞代謝的副產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性，是細(xì)胞生長的不利因素。培養(yǎng)基變橙色時需要換液，如果培養(yǎng)基變成黃色，此時PH已達(dá)到6.0，細(xì)胞將會失去活性；2.細(xì)胞的密度和類型，每種細(xì)胞都有其適合的接種密度，且生長速度也不相同，有的細(xì)胞系甚至需要每天換液和傳代，培養(yǎng)前一定要了解清楚；3.形態(tài)發(fā)生衰退，要做到對細(xì)胞形態(tài)很熟悉并且定期觀察，細(xì)胞形態(tài)衰退不可逆，要避免發(fā)生。換液一旦培養(yǎng)開始就要定期為細(xì)胞更換培養(yǎng)基，即使不增殖的細(xì)胞也換液步驟觀察培養(yǎng)基顏色，鏡檢觀察細(xì)胞的密度以及是否有污染和衰退，決定是否換液；以70%酒精擦拭培養(yǎng)瓶底；打開培養(yǎng)瓶蓋，用5ml移液器或蠕動泵吸出培養(yǎng)基；加入預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)基，如果是不易貼壁的細(xì)胞（293），可以將培養(yǎng)瓶立起，將培養(yǎng)基加在細(xì)胞培養(yǎng)面的對側(cè)，防止將細(xì)胞吹散；蓋好蓋子，放回培養(yǎng)箱。換液步驟觀察培養(yǎng)基顏色，鏡檢觀察細(xì)胞的密度以及是否有污染和衰傳代細(xì)胞生長：延遲期、對數(shù)生長期、停滯期；細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長晚期、接近匯合而未達(dá)到匯合狀態(tài)時即應(yīng)進(jìn)行傳代。正常細(xì)胞達(dá)到匯合狀態(tài)時會脫離細(xì)胞周期并停止生長，進(jìn)入停滯期(接觸抑制)，重新接種后需要較長時間才能恢復(fù)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞即使達(dá)到匯合狀態(tài)也能繼續(xù)增殖，但如不及時傳代會開始衰退，并且增殖效率逐漸降低，最后逐漸死亡；若細(xì)胞處于延滯期不要傳代，脫離細(xì)胞周期的細(xì)胞需傳代后繼續(xù)培養(yǎng)恢復(fù)；傳代要注意接種密度，若到了適合的時間還沒有匯合要增加接種密度，若很快彼此匯合要降低密度。原代前脂肪傳代比率是1:2傳代細(xì)胞生長：延遲期、對數(shù)生長期、停滯期；傳代步驟傳代準(zhǔn)備：裝有貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)容器；新的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿；一次性無菌吸管、槍頭等；完全生長培養(yǎng)基，預(yù)熱至37℃；磷酸鹽緩沖液（PBS），不含鈣、鎂和酚紅，預(yù)熱至37℃；胰蛋白酶，預(yù)熱至37℃；細(xì)胞計數(shù)器；傳代步驟吸出舊的培養(yǎng)基并丟棄；用PBS沖洗細(xì)胞(每10cm2培養(yǎng)表面積需要2mL溶液，25cm2瓶加5mlPBS)。從貼壁細(xì)胞層的對側(cè)輕輕加入沖洗液，以避免攪動細(xì)胞層，輕搖容器；吸出PBS并丟棄；傳代步驟傳代準(zhǔn)備：傳代步驟加入預(yù)熱的胰蛋白酶，試劑量應(yīng)足以覆蓋細(xì)胞層(每10cm2大約0.5mL)，輕輕搖晃容器，使胰蛋白酶完全覆蓋細(xì)胞層；將多余的胰酶吸出，將培養(yǎng)容器在37℃下孵育約2~10分鐘，不同細(xì)胞系孵育時間有所差異；在顯微鏡下觀察細(xì)胞解離情況。如果解離程度未達(dá)90%，可將孵育時間延長幾分鐘，每30秒鐘檢查一次解離情況。也可輕輕拍打培養(yǎng)容器以加快細(xì)胞解離；加入預(yù)定體積的新鮮培養(yǎng)基。吹打細(xì)胞層表面數(shù)次，使培養(yǎng)基分散。細(xì)胞計數(shù)，將細(xì)胞懸液稀釋到該細(xì)胞系推薦的接種密度；將細(xì)胞重進(jìn)接種到新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放回培養(yǎng)箱。傳代步驟加入預(yù)熱的胰蛋白酶，試劑量應(yīng)足以覆蓋細(xì)胞層(每10細(xì)胞的凍存原理：緩慢冷凍，親水的低溫保護(hù)劑（DMSO、甘油）可使細(xì)胞內(nèi)的水分離開細(xì)胞，在極低的溫度下（液氮-196℃）保存細(xì)胞，快速復(fù)蘇，減少細(xì)胞內(nèi)晶體的形成;DMSO：濃度范圍5%~15%，最佳7.5%~10%;細(xì)胞密度較高似乎有利于提高存活率（106~107）；以1℃/min的速度冷凍存活率最高，程序降溫盒；細(xì)胞的凍存原理：緩慢冷凍，親水的低溫保護(hù)劑（DMSO、甘油）凍存步驟鏡檢細(xì)胞：外觀健康、形態(tài)學(xué)特征、處于平臺期前的對數(shù)生長晚期、沒有污染；用胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)基終止消化后離心，棄去培養(yǎng)基；加入含有10%DMSO的凍存液，使細(xì)胞濃度為106~107；將細(xì)胞懸液分裝至標(biāo)記好的凍存管中，擰緊蓋子；將凍存管放入程序降溫盒中，置于-80℃過夜；次日，將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮中保存并填寫凍存記錄，一周后從液氮中取出一只驗證凍存效果，再次記錄。凍存步驟鏡檢細(xì)胞：外觀健康、形態(tài)學(xué)特征、處于平臺期前的對數(shù)生凍存細(xì)胞使用管理新獲得的細(xì)胞系應(yīng)盡快凍存幾只，稱為原始凍存；當(dāng)細(xì)胞系大量繁殖成功應(yīng)進(jìn)行凍存，作為種子儲備；應(yīng)保護(hù)好原始凍存和種子儲備，絕不可分發(fā)使用；若使用或分發(fā)該細(xì)胞系，需要連續(xù)培養(yǎng)該細(xì)胞系并分次凍存，分次凍存可分發(fā)給其他使用者，使用者需要按需自己凍存，當(dāng)使用者不在需要該細(xì)胞系時，應(yīng)予以丟棄而不可傳給他人使用；當(dāng)分次凍存將要用盡時，可從種子儲備細(xì)胞進(jìn)行補(bǔ)充，當(dāng)種子儲備低于5只時，可用原始凍存進(jìn)行補(bǔ)充，要根據(jù)細(xì)胞使用的情況盡可能多的預(yù)留分次凍存細(xì)胞。凍存細(xì)胞使用管理新獲得的細(xì)胞系應(yīng)盡快凍存幾只，稱為原始凍存；細(xì)胞轉(zhuǎn)染基本知識細(xì)胞轉(zhuǎn)染基本知識什么是轉(zhuǎn)染？為什么要做轉(zhuǎn)染實(shí)驗？細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細(xì)胞基因功能的常規(guī)工具。在研究基因功能、基因表達(dá)與調(diào)控、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)試驗中，其應(yīng)用越來越廣泛。

什么是轉(zhuǎn)染？為什么要做轉(zhuǎn)染實(shí)驗？細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如DN轉(zhuǎn)染技術(shù)的分類常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)分為兩大類，一類是瞬時轉(zhuǎn)染(transienttransfection)，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(stabletransfection)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細(xì)胞中可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動子和其它調(diào)控元件的分析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72小時內(nèi)分析結(jié)果，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測。后者也稱永久轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/10000的轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過一些選擇性標(biāo)記，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。

轉(zhuǎn)染技術(shù)的分類常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)分為兩大類，一類是瞬時瞬時轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染方法原理特點(diǎn)磷酸鈣-DNA共沉淀法磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞操作簡便但重復(fù)性差，不適用于原代細(xì)胞DEAE-葡聚糖法帶正電的DEAE-葡聚糖與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞相對簡便、結(jié)果可重復(fù)，但對細(xì)胞有一定的毒副作用，轉(zhuǎn)染時需除血清電穿孔法高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導(dǎo)入細(xì)胞適用性廣但細(xì)胞致死率高，DNA和細(xì)胞用量大，需根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗條件陽離子脂質(zhì)體法（常用）帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞適用性廣，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好，但轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化較大Biolistic顆粒傳遞法將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細(xì)胞，DNA在胞內(nèi)逐步釋放并表達(dá)可用于表皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等瞬時轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染方法原理特點(diǎn)磷酸鈣-DNA共沉淀法磷酸鈣D穩(wěn)定轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染方法原理特點(diǎn)腺病毒法通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因?qū)?。除了卵?xì)胞以外，不會整合到宿主染色體中；除了抗腺病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞，能感染幾乎所有的細(xì)胞類型。慢病毒法隨機(jī)整合到宿主染色體，可能導(dǎo)致基因失活或激活癌基因，攜帶基因不能太大。逆轉(zhuǎn)錄病毒法隨機(jī)整合到宿主染色體，可能導(dǎo)致基因失活或激活癌基因，攜帶基因不能太大，細(xì)胞需處于分裂期。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染方法原理特點(diǎn)腺病毒法除了卵細(xì)胞以外，不會整慢病毒表達(dá)系統(tǒng)腺病毒表達(dá)系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)病毒基因組RNADNARNA病毒原型人免疫缺陷I型病毒(HIV)

人5型腺病毒(Ad5)白血病病毒(MMLV)

載體系統(tǒng)1個表達(dá)質(zhì)粒和3個包裝質(zhì)粒1個穿梭質(zhì)粒和1個輔助質(zhì)粒1個表達(dá)質(zhì)粒宿主細(xì)胞分裂和非分裂的動物細(xì)胞分裂和非分裂的動物細(xì)胞分裂的動物細(xì)胞是否整合整合型非整合型整合型表達(dá)豐度高水平表達(dá)高水平表達(dá)高水平表達(dá)表達(dá)時間慢(2~4天)快(1~2天)快(1~2天)克隆容量不超過6kb的外源片段高達(dá)8kb的外源片段不超過6kb的外源片段免疫原性低高低過表達(dá)microRNA特別適合適合不適合RNAi特別適合