重點腸道傳染病實課件

重點腸道傳染病實驗室檢測方法概述襄陽市疾控中心趙耀儒2014/11/21霍亂弧菌培養(yǎng)、分型操作方法。傷寒、副傷寒培養(yǎng)操作方法。細菌性痢疾（阿米巴痢疾）培養(yǎng)實驗操作方法。、手足口病實驗操作方法。細菌藥敏試驗微生物標本的采集

通常有血液、腦脊液、尿液、傷口的膿液、胸水腹水、糞便、痰液及泌尿生殖系統(tǒng)的分泌物。

1采集的一般原則：a早期采集b

無菌采集注意對局部及周圍皮膚的消毒。寄生部位采集的標本應(yīng)明確目的菌，采用選擇培養(yǎng)基。C

不同菌不同采集方法D

采集適量標本，量不應(yīng)過少，注意采集不同時間不同部位標本，要全面。E

安全采集霍亂檢驗程序標本的采集和送檢分離培養(yǎng)鑒定一、標本的采集和送檢

1.標本的采集：標本采集的好壞，對整個檢驗工作的質(zhì)量影響很大。糞便標本的采集應(yīng)爭取在發(fā)病早期，服用抗菌藥物之前并盡快送到檢驗室。標本以病人糞便為主。采便方法可用棉拭采取自然排出的新鮮大便，亦可用直腸棉拭或采便管由肛門插入直腸內(nèi)3～5cm處采取。采用后者應(yīng)注意棉拭大小適宜，避免采便量過少。一般要求水樣便采取1～3ml，成形便采取指甲大小的糞量。在某些情況下，病人的嘔吐物、沾染糞便的衣物和尸體的腸內(nèi)容物亦可作為檢材。

2.標本的送檢：采得的標本應(yīng)立即接種于培養(yǎng)基。劇烈腹瀉病人的水樣便含有大量病菌（106～109/ml），直接分離培養(yǎng)不難檢出陽性。不能立即檢查的，要接種于保存培養(yǎng)基內(nèi)，盡快送往檢驗室。送檢標本可放入堿性蛋白胨水、文—臘二氏保存液或插入Cary－Blair二氏半固體保存培養(yǎng)基中。后者不僅對霍亂弧菌，而且對其它腸道致病菌也有保存作用。標本與保存液的比例要適當，8～10ml保存液可加入1～3ml液體便或指甲大小的成形便，過多的大便量可降低保存液的pH值。二、分離培養(yǎng)方法

1.直接分離培養(yǎng)：急性期病人水樣大便標本在增菌培養(yǎng)的同時，可取其粘液絮片或用棉拭標本直接作分離培養(yǎng)。這不僅能縮短檢出時間，還可避免標本中其他雜菌特別是非O1群霍亂弧菌經(jīng)增菌后大量繁殖而影響O1群霍亂弧菌的分離分離培養(yǎng)基有選擇性強、弱之不同。選擇性強的培養(yǎng)基常用的慶大霉素瓊脂和4號瓊脂等；選擇性弱的有堿性瓊脂和堿性膽鹽瓊脂等。培養(yǎng)基的使用，可根據(jù)當?shù)鼐唧w情況和各檢驗室的實踐經(jīng)驗來選擇。近年的趨勢是使用堿性蛋白胨水增菌，再用強選擇性培養(yǎng)基進行分離。瓊脂平皿應(yīng)新鮮配置，接種前培養(yǎng)基表面適當烘干。劃線培養(yǎng)應(yīng)掌握能分離出盡量多的單個菌落。一般每個標本接種一個平皿，必要時一個標本接種強和弱選擇性培養(yǎng)基各一個。在慶大霉素瓊脂平皿上，腸內(nèi)細菌和革蘭氏陽性菌的生長受到顯著抑制?；【L快、菌落大，培養(yǎng)4～5小時，原劃線處有菌臺生長，8～10小時可長出小菌落，16小時菌落直徑可達2mm。菌落弱帶灰色、半透明、扁平、稍隆起、光滑濕潤，培養(yǎng)時間延長或室溫放置后，菌落略帶黃色，中心厚而周圍透明，培養(yǎng)基含亞碲酸鉀時菌落呈灰色，中心形成黑色金屬碲沉淀。在堿性瓊脂平皿上弧菌生長也較快，菌落較透明。在這些平皿上挑取菌落做玻片凝集容易形成懸液，凝集狀態(tài)良好。三、鑒定鑒定標準以血清學性狀為主，結(jié)合形態(tài)學和生化學性狀作出判定。血清學性狀以玻片凝集實驗為主，可疑菌落先用O1群或/和O139群霍亂弧菌診斷血清作檢查。有的標本可能同時存在非O1群/非O139群霍亂弧菌，因此，可疑菌落較多時，應(yīng)挑選5個以上的菌落逐個進行玻片凝集檢查。必要時，取原劃線菌苔邊緣透明部分再做玻片凝集。這對一次流行的首批病人進行檢查時尤應(yīng)注意。此外，平皿分離未獲分散的單個菌落，而在密集部位仍有可疑菌落時，應(yīng)將該部分再做或經(jīng)增菌后再做分離。有時從恢復期病人分離出菌落典型但不凝集的弧菌，這時應(yīng)以霍亂粗糙型血清作玻片凝集，檢查是否為本菌的粗糙型。二、分離培養(yǎng)1、血標本取病人靜脈血5毫升加入約10倍量的葡萄糖膽鹽肉湯中，37℃培養(yǎng)，逐日觀察結(jié)果。如出現(xiàn)混濁即可用血瓊脂或SS、麥康凱瓊脂進行分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)18一24小時，挑取疑菌落作進一步鑒定。一般增菌1一2天陽性率高，如至第7天培養(yǎng)物仍清澈透明，經(jīng)接種培養(yǎng)仍無菌生長，則可判為陰性。2、糞便標本（1）直接分離培養(yǎng)將標本接種到SS和麥康凱瓊脂上，37℃培養(yǎng)18一24小時，挑取可疑菌落進行鑒定。（2）增菌培養(yǎng)將標本乳化后接種在改良的亞硒酸氫鈉甘露醇（SFM）增菌培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)15一18小時后，再接種到SS和麥康凱瓊脂上，37℃培養(yǎng)18一24小時后，挑取可疑菌落。3、尿、膽汁、骨髓標本取患者尿或膽汁經(jīng)離心后的沉淀物或骨髓液，作直接分離或增菌分離培養(yǎng)，方法與糞便標本分離培養(yǎng)方法相同。三、鑒定

1、初步生化鑒定

挑取上述分離培養(yǎng)基上無色、透明或半透明的可疑菌落2一3個，分別接種雙糖鐵斜面（KIA）和動力靛基質(zhì)尿素半固體（MIU）各一支，37℃培養(yǎng)18一24小時，觀察生化反應(yīng)。若符傷寒或副傷寒桿菌生化反時，則取KIA斜面上菌苔進行血清學鑒定。2、血清學分型

（1）0血清群別判定初步生化反應(yīng)符合傷寒或甲、乙、丙型副傷寒桿菌時，先用A－F群沙門氏“0”多價血清作玻片凝集，以判定其群別。

（2）H抗原判定0抗原判定后，依次用相應(yīng)的H因子血清檢查第一相和第二相抗原與Hd因子血清凝集。

（3）Vi抗原檢查新分離的傷寒桿菌有Vi抗原，能與Vi血清凝集。一、標本采集、運送、包裝、保存、接收可采用便盒留便、肛拭或采便管采便。便盒留便：留取糞便時應(yīng)采集新鮮糞便的膿血部分、粘液部分、水樣便或稀便。便量1～5g。

集體腹瀉或食源性暴發(fā)患者糞便采集的數(shù)額，應(yīng)根據(jù)患者人數(shù)的多少，決定采取標本的數(shù)量。當懷疑患者為菌血癥時，應(yīng)以無菌操作，從靜脈血管采取10～15mL血液，放入加有EDTA抗凝劑瓶中送檢。所采取的糞便標本應(yīng)盡快送檢，不得超過2h送到化驗室，否則標本應(yīng)放入Cary-Blair運送培養(yǎng)基中，運送時間超過2h者，應(yīng)在冰浴條件下送檢。送交分型分析菌株的接收要求：1)經(jīng)過分純的沒有污染的菌株;2)分離菌株應(yīng)該用甘油半固體保存；3)與分離菌株相對應(yīng)的患者的臨床癥狀和流行病學資料；4)經(jīng)血清和生化證實為志賀菌。痢疾檢驗程序二、糞便標本志賀菌的分離方法1、分離方法

（1）用接種環(huán)多點沾取標本病變部分，直接劃線分離于SS、EMB（或HE、麥康凱）瓊脂平板。37℃培養(yǎng)24h。

（2）血液培養(yǎng)

將采取的抗凝血液標本，放入葡萄糖肉湯，37℃培養(yǎng)，逐日觀察結(jié)果。一般1～3d內(nèi)陽性較高。為提高陽性檢出率，可以在標本中加入0.5mLOP乳化劑（聚乙二醇辛基苯基醚），使血球溶解，以提高陽性檢出率。

（3）挑選可疑菌落

從37℃培養(yǎng)16～24h的分離培養(yǎng)基上，觀察挑選可疑菌落，其形態(tài)為無色，半透明，圓形，濕潤、光滑、突起，大小為1～2mm；挑選可疑菌落，接種TSI和葡萄糖半固體或綜合培養(yǎng)基，先劃線后穿刺，做好標記，放37℃培養(yǎng)16h以上，觀察結(jié)果

腸出血性大腸桿菌O157：H7的檢驗程序糞便或其它標本

增菌6小時左右

磁珠濃縮

山梨醇—麥康凱培養(yǎng)基培養(yǎng)18-24小時

可疑菌落

革蘭氏生化血清學毒力因子染色反應(yīng)鑒定鑒定*根據(jù)結(jié)果判定*有條件的單位可進行如用PCR檢測SLT1、SLT2、Hly、EAE的基因【注】1、培養(yǎng)及增菌均在37℃進行；2、山梨醇-麥康凱培養(yǎng)基中應(yīng)加入適當?shù)囊志鷦?、“科瑪嘉”培養(yǎng)基加入亞碲酸鉀后選擇效果更好；4、在SMAC中加入下列抑制劑的一種均可增加培養(yǎng)基的選擇性；1）亞碲酸鉀2.5mg/l和先鋒霉素類抗生素Cefixime0.05mg/l；2）新生霉素10mg/l；3）萬古霉素40mg/l；5、在科瑪嘉或S--MAC平板上挑選可疑菌落與O157診斷血清、H7血清或O157單克隆抗體作試探性凝集試驗，若不凝集，但臨床表現(xiàn)疑為EHEC感染，則應(yīng)做如下處理。因為個別腸出血性大腸桿菌O157：H7具有K抗原，應(yīng)在生化反應(yīng)確定為大腸桿菌后用生理鹽水制備菌懸液，并100℃水浴加熱10-15分鐘再與O157診斷血清或O157單克隆抗體做凝集試驗。6、當生化反應(yīng)和血清學反應(yīng)結(jié)果均與腸出血性大腸桿菌O157：H7符合時，才能確認為腸出血性大腸桿菌O157：H7。7、目前許多國家使用的O157和H7特異性抗體與及少數(shù)細菌具有不同程度的交叉反應(yīng)，如美國、法國還有我國自己生產(chǎn)的試劑都與弗勞地枸櫞酸桿菌有交叉反應(yīng)，因此，用生化試驗確定為大腸桿菌是必須的,最為重要的是硫化氫試驗。絕大多數(shù)腸出血性大腸桿菌菌株在24小時內(nèi)不的發(fā)酵D-山梨醇。但是，也報道了一些能夠快速發(fā)酵D-山梨醇的菌株。8、典型大腸桿菌的主要生化反應(yīng)結(jié)果如下：1）動力試驗葡萄糖麥芽糖甘露醇蔗糖硫化氫尿素試驗＋＋＋＋+/－－－2）靛基質(zhì)甲基紅V-P試驗枸櫞酸鹽苯丙氨酸脫氨酶＋＋－－－3）賴氨酸脫羧酶鳥氨酸脫羧酶氧化酶氰化鉀+/－+/－－－手足口病的實驗室檢測方法

病毒分離采集的樣本經(jīng)過相應(yīng)處理后接種于相應(yīng)細胞，進行腸道病毒的培養(yǎng)，通過觀察細胞毒性變化來判斷是否感染腸道病毒。

測定人雙份血清標本的中和抗體滴度用急性期血清與恢復期血清滴度進行比