乙肝核心抗原的檢測與應(yīng)用

HBcAg的檢測與應(yīng)用

第1頁，共42頁。摘要

HBcAg存在于Dane顆粒的核心，是HBV的結(jié)構(gòu)蛋白即病毒核殼蛋白，具有重要的生物學特性和臨床病理意義，HBcAg由HBV基因組的C開放讀碼區(qū)（ORF）編碼，具有高度免疫原性，對HBcAg的免疫應(yīng)答在病毒清除中有重要作用。血清HBcAg陽性可提供肝內(nèi)HBV合成的信息，是病毒存在的直接標志，HBcAg感染的肝細胞是細胞免疫效應(yīng)攻擊的靶細胞，肝細胞溶解后HBcAg可直接釋放入血，故能直接反映肝細胞損害和病情進展的程度。檢測肝組織HBcAg有助于確定乙型肝炎病原學診斷和評估肝細胞壞死炎性活動的程度及病變發(fā)展的趨向，推測慢性乙型肝炎的預(yù)后。血清和肝組織HBcAg檢測具有多種實用價值，值得推薦。

第2頁，共42頁。0引言

乙型肝炎病毒（HBV）是嗜肝DNA病毒，完整的HBV顆粒又稱Dane顆粒，球形，直徑約42urn。HBV核心抗原（HepatitisBCoreAntigen，HBcAg）存在于Dane顆粒的核心，是HBV的結(jié)構(gòu)蛋白即病毒核殼蛋白，主要存在于受感染的肝細胞核內(nèi)，它反映血清中Dane顆粒的存在及肝內(nèi)HBV的復(fù)制。存在于乙型肝炎患者血液和肝組織內(nèi)的HBcAg具有重要的生物學特性和臨床病理意義。

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1生物學特性1.1一般特性

HBcAg由HBV基因組的C開放讀碼區(qū)（ORF）編碼，從第二個ATG（1901nt）起始翻譯（終止密碼子在2458nt）。HBcAg有保守的三維結(jié)構(gòu)，可因血清型不同而有183-185個氨基酸殘基（aa），相對分子質(zhì)量Mr21,000，180個HBcAg形成27nrn的正20面體以構(gòu)成核心顆粒。HBV核心部分含有環(huán)狀雙股DNA、DNA聚合酶、HBcAg和e抗原（HBeAg），是病毒復(fù)制的主體。HBcAg包裝HBVDNA，在病毒成熟過程中起重要作用。HBcAg己被證明含有HBV特異性DNA聚合酶，是HBV復(fù)制的標志。

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1.1一般特性

HBcAg可在受染的肝細胞核中查到，但它主要在胞質(zhì)中產(chǎn)生，由胞核定位序列（nuclearlocalizationsequences，NLS）介導(dǎo)HBcAg進人細胞核中。胞核定位序列位于HBcAg的羧基末端區(qū)（C端區(qū)）第145-156位和第172-183位的氨基酸序列，具有與細胞核特異性結(jié)合，并將與之相連的蛋白或DNA轉(zhuǎn)運到細胞核中的功能。

第5頁，共42頁。1.2免疫反應(yīng)

HBcAg具有高度免疫原性，在T細胞和B細胞水平上，HBcAg的抗原性較HBeAg強100倍，幾乎所有HBV感染者都產(chǎn)生抗-HBc，同時有T細胞免疫應(yīng)答。對HBcAg的免疫應(yīng)答在病毒清除中可能有重要作用。這對HBcAgDNA的疫苗研究有重要的指導(dǎo)意義。

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1.2免疫反應(yīng)

Th細胞根據(jù)其的分泌細胞因子不同可分為Th1和Th2亞群。Th1細胞主要產(chǎn)生白介素-2（IL-2），干擾素γ（IFNγ）和腫瘤壞死因子α（TNFα）等促進細胞免疫反應(yīng)；Th2細胞主要產(chǎn)生白介素-6（IL-6）、白介素-4（IL-4）、白介素-10（IL-10）等促進體液免疫反應(yīng)。Th1和Th2細胞通過分泌的細胞因子相互下調(diào)對方的生長分化，刺激自身的增生。

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1.2免疫反應(yīng)

機體的Th1型免疫反應(yīng)可促進病原體的清除，而Th2型免疫反應(yīng)則可加重機體的病理損害，在HBcAg誘導(dǎo)下，外周血單個核細胞（PBMC）產(chǎn)生Th1類細胞因子量明顯增高；在HBeAg誘導(dǎo)下，Th2類細胞因子量明顯增高。慢性HBV感染進行免疫調(diào)節(jié)治療的一個目標就是使HBeAg特異性T細胞由Th2細胞主導(dǎo)型轉(zhuǎn)化為Th1細胞型，HBcAg有望打破HBeAg誘導(dǎo)的免疫耐受狀態(tài)而增強Th1細胞優(yōu)勢表達達到治療的目的。慢性乙型肝炎患者和HBV慢性攜帶者體內(nèi)針對HBV的特異性CTL應(yīng)答明顯低下，糾正這種CTL低反應(yīng)狀態(tài)，對于機體有效地清除HBV至關(guān)重要。

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1.2免疫反應(yīng)

DNA疫苗（基因疫苗）是近幾年免疫學和分子生物學研究的新興領(lǐng)域，它作為一種全新的高效免疫方法，己在許多難治性感染性疾病、自身免疫性疾病、過敏性疾病和腫瘤性疾病的預(yù)防及治療領(lǐng)域顯示出較好的應(yīng)用前景。DNA疫苗可刺激機體特異性CTL功能的特性給HBV慢性持續(xù)感染的治療帶來新的希望。

第9頁，共42頁。1.2免疫反應(yīng)

采用治療性疫苗打破宿主對HBV的免疫耐受狀態(tài)來治療慢性乙型肝炎和慢性乙型肝炎病毒攜帶者是一新的有效途徑。HBV核心抗原區(qū)AA1-AA151段含有多個不連續(xù)的抗原表位，對刺激機體產(chǎn)生特異性的體液免疫和細胞免疫均具有重要作用。Kuhober和Geissieretal作了HBcAgDNA疫苗肌內(nèi)注射法免疫小鼠的初步觀察。該DNA疫苗具有良好的細胞免疫原性，確可刺激宿主產(chǎn)生較強的CTL反應(yīng)。這一結(jié)果為我們進一步探索該DNA疫苗在治療主要因機體CTL功能低下所致HBV慢性持續(xù)感染方面的應(yīng)用前景奠定了初步的實驗研究基礎(chǔ)。

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2臨床應(yīng)用

2.1血清HBcAg

HBsAg、HBeAg、抗-HBc等免疫學指標都是體內(nèi)存在乙型肝炎病毒顆粒的間接標志，而HBcAg則是HBV存在的直接標志。所以，HBcAg測定更能反映HBV的存在及其復(fù)制程度，比其他各種免疫學指標更靈敏、更特異。HBcAg是乙型肝炎病毒（HBV）的核心成分，若在血清中檢出HBcAg則說明有HBV復(fù)制。

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血中的HBcAg是作為Dane顆粒內(nèi)部成分存在，極少有游離的HBcAg，故用常規(guī)方法不易檢出，在血清中不能直接檢出HBcAg，需加用開殼劑，使HBcAg釋放于溶液中然后進行測定。檢測HBcAg，目前多采用間接的方法，即首先在試管內(nèi)將Dane顆粒沉淀，再用裂解劑裂解Dane顆粒外殼，使HBcAg暴露游離，并經(jīng)過多次洗滌處理后，用放免或酶免方法檢測。如用EIA微板法檢測血清HBcAg，被檢標本不須任何處理，直接在微孔板內(nèi)進行檢測，應(yīng)用于臨床，可與乙型肝炎病毒標志物同步檢測。

檢測

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血HBcAg與HBsAg的關(guān)系

HBcAg出現(xiàn)的陽性率與HBsAg的出現(xiàn)密切相關(guān)，往往HBcAg（＋）與HBsAg（＋）同時存在，而HBsAg（＋）時不一定會出現(xiàn)HBcAg（＋）?？?HBs的出現(xiàn)并不標志著HBV復(fù)制的中止，而是復(fù)制水平減低。不能以HBsAg陰性就排除HBV感染，臨床上HBsAg陰性的患者，只要HBcAg檢出陽性，說明仍有乙型肝炎病毒復(fù)制。以往認為血清中僅HBsAg陽性者，病毒為非復(fù)制相，無傳染性，但這種患者中，也有檢測出HBcAg、HBVDNA陽性者，故判斷單項血清HBsAg陽性者的傳染性時應(yīng)慎重。

第13頁，共42頁。血HBcAg與e系統(tǒng)的關(guān)系

HBeAg陽性是HBV持續(xù)高水平復(fù)制和傳染性強的標志，其與HBcAg、HBVDNA密切相關(guān)，并具有明顯的平行關(guān)系。多年來，一直認為e抗原是復(fù)制標記物，由于HBeAg是HBcAg的降解產(chǎn)物，以可溶性蛋白形式存在，在結(jié)構(gòu)上不及HBcAg與病毒顆粒關(guān)系密切，對判斷病毒復(fù)制、評估傳染性不及HBcAg敏感可靠。

第14頁，共42頁。血HBcAg與e系統(tǒng)的關(guān)系

一般認為，當HBeAg/抗-HBe轉(zhuǎn)換后，HBV復(fù)制趨于減少，沒有傳染性或傳染性很小。HBeAg被公認為是HBV復(fù)制的標志物。但部分陰性者HBeAg的血清中仍可檢出HBcAg和（或）HBVDNA，說明HBeAg的表達可能不是HBV復(fù)制的必然結(jié)果，對HBeAg陰性感染者的帶毒狀態(tài)及抗-HBe表達的臨床意義必須重新認識，不能忽視其具有傳染性的可能。

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血HBcAg與HBVDNA、HBVDNA-P的關(guān)系

在慢性乙型肝炎患者中，血HBcAg與血HBVDNA有很好的相關(guān)性；而在急性期，尤其是在肝損害極期時，往往血HBcAg陽性，而血HBVDNA陰性，考慮為HBcAg從受免疫損傷的被感染的肝細胞內(nèi)釋放入血，這種情況甚至在病毒已終止復(fù)制后也可出現(xiàn)。對HBsAg慢性攜帶狀態(tài)患者，判斷HBV復(fù)制及傳染性，HBcAg的敏感性最高，HBVDNA和HBVDNA-P次之，HBeAg敏感性低。

第16頁，共42頁。不同肝病的檢出率

慢性活動性肝炎中血HBcAg陽性率明顯高于ASC（無癥狀病毒攜帶者），說明血HBcAg陽性較多見于病變活動較重的慢性肝炎而較少見于病變較靜止的ASC。血清中的HBcAg陽性與肝臟病變活動程度有關(guān)，且對估計預(yù)后有很好價值。HBcAg檢出結(jié)果是：肝硬化＞慢性乙型肝炎中型＞慢性乙型肝炎輕型。

第17頁，共42頁。檢測血HBcAg的臨床意義（1）對血液內(nèi)HBV的開殼處理，能直接檢測HBcAg，能比HBeAg更客觀地反映血HBV的存在，以及作出數(shù)量多少的判斷，可替代HBeAg而作為病毒復(fù)制和傳染性的敏感指標，是病毒存在的直接標志。它與HBV復(fù)制標志呈正相關(guān)，可以反映HBV活動的復(fù)制程度。HBcAg與乙型肝炎病毒其他五項標志物相比更是反映HBV復(fù)制的直接證據(jù)。它可與其他的HBV血清學標志物起到相互配合和相互補充的作用。

第18頁，共42頁。檢測血HBcAg的臨床意義

（2）有助于對乙型肝炎病情和預(yù)后的判斷，HBcAg感染的肝細胞是細胞免疫效應(yīng)攻擊的靶細胞，肝細胞溶解后HBcAg可直接釋放入血，故能直接反映肝細胞損害和病情進展的程度。在急性乙型肝炎早期HBcAg亦達高峰值，而且病情嚴重者的HBcAg水平也相應(yīng)提高。慢性乙型肝炎患者，血HBcAg陰性者比陽性者有明顯的臨床及生化指標的改善。HBcAg含量與肝臟損害的情況有關(guān)，有助于抗病毒藥物及免疫治療的療效評價。

第19頁，共42頁。檢測血HBcAg的臨床意義

（3）從理論上講，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測法比固相放射免疫法靈敏度高，但實際上可出現(xiàn)HBcAg陽性而HBVDNA陰性的結(jié)果。因此，兩種檢測方法可以互補使用，以減少漏檢。在不具備PCR檢測條件的單位，以酶聯(lián)（ELISA）法試劑盒在檢測血清HBV五項標志的同時，檢測HBcAg不僅能進一步了解病毒的復(fù)制情況，還可了解肝細胞損害和病情進展的程度，且檢測費用低廉，有臨床實用價值。

第20頁，共42頁。檢測血HBcAg的臨床意義（4）在對獻血員的篩選中，單憑HBsAg的測定來判斷是否受HBV感染也是不夠的，會漏診HBsAg陰性而HBcAg和抗-HBc陽性的乙型肝炎患者，只有三者同時檢測，才能更好地診斷乙型肝炎并防止在輸血中傳播，降低輸血后肝炎的發(fā)生率。第21頁，共42頁。2.2肝組織HBcAg分布

HBcAg主要存在于HBV顆粒和受染的肝細胞中，HBV復(fù)制時HBcAg表達于肝細胞內(nèi)，分胞核型、胞質(zhì)型和胞膜型。Delladetsimaetal發(fā)現(xiàn)膽管上皮細胞也是HBV的適合宿主，HBV能夠在其中復(fù)制并表達HBcAg和HBsAg抗原。

第22頁，共42頁。肝內(nèi)HBcAg與HBVDNA關(guān)系

肝內(nèi)HBcAg與HBVDNA的分布區(qū)域常較一致，有的肝細胞可同時檢出HBcAg和HBVDNA，但多數(shù)HBVDNA（＋）肝細胞并不同時含有HBcAg。HBV高復(fù)制期HBcAg以胞核表達為主，無或很少在胞質(zhì)內(nèi)表達；而低復(fù)制期時相反，HBcAg在肝細胞核內(nèi)而不是細胞質(zhì)內(nèi)的表達程度能夠精確地反映慢性乙型肝炎患者的病毒復(fù)制水平。肝HBcAg與血清HBVDNA水平呈正相關(guān)。經(jīng)干擾素α治療后的慢性活動性乙型肝炎患者，HBcAg發(fā)生從核內(nèi)向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)換。第23頁，共42頁。肝內(nèi)HBcAg與HBeAg關(guān)系

HBcAg與HBeAg常同時表達在肝細胞內(nèi)，但在亞細胞水平有重要差異。在病毒活躍復(fù)制的ASC，常有較強的HBcAg胞核表達和HBeAg胞質(zhì)表達；活動性慢性乙型肝炎時常有HBcAg的胞質(zhì)表達，因免疫清除而病毒減少，難以檢出HBeAg。作為免疫攻擊的靶抗原，HBeAg不及HBcAg重要。

第24頁，共42頁。肝內(nèi)HBcAg與肝組織炎癥活動關(guān)系

血清HBVDNA、HBeAg和定位于核內(nèi)的HBcAg都與肝組織的損害程度無關(guān)。慢性HBV感染者肝組織中漿膜型HBcAg的表達強度隨肝組織病變活性積分（HAI）評分值的增高而增強，HAI評分值低者核型HBcAg的表達增強。HBcAg在核內(nèi)或胞質(zhì)內(nèi)同時表達的其“炎癥活動指數(shù)”高于HBcAg在胞質(zhì)內(nèi)和膜內(nèi)表達。

第25頁，共42頁。肝內(nèi)HBcAg與肝組織炎癥活動關(guān)系

光鏡下發(fā)現(xiàn)漿膜型HBcAg多分布于碎屑樣壞死及灶性壞死區(qū)，漿膜型HBcAg陽性肝細胞常有各種變化，或明顯萎縮，或腫脹變形。增生胞核抗原（PCNA））是再生肝細胞的標志，代表肝組織的炎癥活性，PCNA與胞質(zhì)HBcAg表達程度正相關(guān)，但不是胞核型HBcAg的獨立影響因素。發(fā)生前-C區(qū)突變的HBV與未發(fā)生突變的野生株相比HBcAg在胞質(zhì)內(nèi)表達顯著增高，并伴有較明顯的肝組織炎癥活動。HBcAg在胞質(zhì)內(nèi)表達預(yù)示預(yù)后不良。

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肝內(nèi)HBcAg與肝組織炎癥活動關(guān)系乙型肝炎引起的肝硬化肝組織中HBcAg、HBVDNA的陽性率較高。HBcAg顆粒在肝組織中主要呈彌漫的漿膜型分布，HBcAg和HBVDNA呈漿、膜型分布者，其肝組織中HBVDNA表達程度、炎癥活動度和纖維組織增生程度，明顯較呈核型分布者高。HBcAg及HBVDNA陽性的肝組織，炎癥活動明顯，界面呈碎屑壞死，灶性壞死。

第27頁，共42頁。肝內(nèi)HBcAg與肝組織炎癥活動關(guān)系

觀察肝內(nèi)顆HBcAg粒的分布類型，有助于判斷HBV在肝組織中的復(fù)制狀況；肝組織病變的活動程度。這可能是由于機體對呈漿、膜型分布的HBcAg和HBVDNA具有更加強烈的免疫反應(yīng)，將肝內(nèi)含活躍復(fù)制的HBVDNA和靶抗原HBcAg表達的肝細胞溶解破壞，以清除病毒所致。

第28頁，共42頁。合并丁型肝炎時，肝內(nèi)HBcAg表達特點

HBV合并HDV感染者的肝組織中，HBcAg和HDAg陽性細胞分布關(guān)系不密切，HBcAg陽性細胞明顯少于HDAg陽性細胞，HBcAg主要呈核型表達，胞質(zhì)中陽性顆粒較少見到，表達強度也較弱，表明HDV感染者HBV是低水平復(fù)制，HDV可能有抑制HBV基因復(fù)制或病毒抗原表達的作用，特別是在HDV復(fù)制活躍的階段，即HDAg大量表達時，HBV復(fù)制受到的抑制最為明顯。

第29頁，共42頁。兒童肝內(nèi)HBcAg表達特點

兒童肝內(nèi)HBcAg主要表達于核內(nèi)。肝內(nèi)HBcAg呈彌漫性分布者，多見于10歲以內(nèi)的較小兒童；而呈局灶性分布者，多見于10歲以上的較大兒童，HBcAg呈局灶性分布比彌漫性分布者，ALT水平較高并伴有較明顯的肝臟炎癥活動。在兒童慢性乙型肝炎患者中，肝內(nèi)HBcAg呈彌漫性分布者為病毒感染早期，HBcAg呈局灶性分布并伴隨HBeAg陽性者為疾病短期內(nèi)進展的標志。

第30頁，共42頁。肝組織HBcAg檢測的應(yīng)用價值

（1）檢測肝組織HBcAg有助于確定乙型肝炎病原學診斷，尤其是對于血清乙型肝炎病毒標志物陰性病例，在病原學診斷中彌補血清學診斷乙型肝炎的不足。

第31頁，共42頁。肝組織HBcAg檢測的應(yīng)用價值

（2）有助于評估肝細胞壞死炎性活動的程度及病變發(fā)展的趨向，推測慢性乙型肝炎的預(yù)后。肝細胞內(nèi)HBcAg轉(zhuǎn)陰和肝細胞壞死病變減輕具有一致性。HBcAg漿膜型者顯示此種一致性，而核型則否，可能由于肝細胞質(zhì)、膜上的HBcAg作為靶抗原易受到殺傷性了淋巴細胞的攻擊，導(dǎo)致肝細胞損害，而核型HBcAg則不具有此種作用。

第32頁，共42頁。肝組織HBcAg檢測的應(yīng)用價值

（3）HBcAg檢測也是判斷HBV復(fù)制狀態(tài)的一項重要指標，肝組織HBcAg與HBVDNA兩種病毒復(fù)制標志物相關(guān)。研究結(jié)果證實肝組織HBcAg檢測具有多種實用價值，值得推薦。

第33頁，共42頁。2.3其他組織的HBcAg表達

國內(nèi)學者對乙型肝炎孕婦所分娩的死胎進行研究，發(fā)現(xiàn)HBcAg在多種臟器內(nèi)均可表達，其中以肺、肝、腎臟、臍帶為最高，胸腺、心臟、脾、胎盤次之，大腦最低。說明HBV有可能在多種組織內(nèi)復(fù)制并表達抗原。這可能是HBV通過產(chǎn)婦傳播，導(dǎo)致新生兒乙型肝炎的高發(fā)病率、新生兒發(fā)育不良和死亡的重要因素。

第34頁，共42頁。3小結(jié)總之，充分認識HBcAg的生物學特點和其在血液、肝組織內(nèi)表達的規(guī)律，有助于我們通過對HBcAg的檢測而正確判斷是否有HBV的復(fù)制以及復(fù)制的強度，正確評估肝病活動及肝組織損害的程度，從而指導(dǎo)制定有效的治療方案。對HBcAg的強免疫原特性的認識，可以指導(dǎo)我們研制更有效的預(yù)防或治療乙型病毒性肝炎的疫苗。

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4HBcAg的ELISA法檢測4.1試劑

HBcAgELISA試劑由北京美迪科生物技術(shù)有限公司提供，試劑主要包括HBsAb包被板、HBcAg包被板、開殼劑、HBcAb-HRP結(jié)合物、底物液TMB等。第36頁，共42頁。

4.2步驟（1）標本處理：取血清檢測。（2）乙肝病毒Dane顆粒的分離。將HBsAb包被板用蒸餾水洗2次并拍干，每孔加樣本、陰陽性對照血清各100ul（空白對照孔不加），用封片紙封好，45℃溫育30分鐘，棄去孔內(nèi)液體并用蒸餾水洗7次并拍干。（3）加開殼劑釋放出HBcAg。將上述的HBsAb包被板每孔加入100ul開殼劑（空白對照孔不加），置45℃溫育30分鐘。

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4.2步驟（4）中和抑制法檢測HBcAg。將上述的HBsAb包被板每孔中的開殼液轉(zhuǎn)移50ul至相應(yīng)的已用蒸餾水洗2次并拍干的HBcAg包被板中（注意每份樣品要更換一個吸頭，以防交叉污染），然后每孔加入HBcAb-酶結(jié)合物50ul（空白對照孔不加），混勻并封板，置45℃溫育30分鐘，棄去孔內(nèi)液體并用蒸餾水洗7次并拍干。

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4.2步驟（5）顯色。將上述的