全細(xì)胞催化課件

微生物全細(xì)胞催化技術(shù)在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用1.定義：全細(xì)胞催化是指利用完整的生物有機(jī)體(即全細(xì)胞、組織甚至個(gè)體)作為催化劑進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化，其本質(zhì)是利用細(xì)胞內(nèi)的酶進(jìn)行催化。該法是介于發(fā)酵法和提取酶催化法之間的一種生物催化技術(shù)。2.優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞內(nèi)完整的多酶體系可以實(shí)現(xiàn)酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而彌補(bǔ)酶法催化中級(jí)聯(lián)催化過(guò)程不易實(shí)現(xiàn)的不足，提高了催化效率，同時(shí)，又省去了繁瑣的酶純化過(guò)程，制備更加簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本更低。生命科學(xué)的飛速發(fā)展也大大增加了全細(xì)胞催化的可行性，如利用DNA重組技術(shù)，可使目標(biāo)酶在不同宿主細(xì)胞中大量表達(dá)。利用這種分子生物學(xué)技術(shù)甚至可以修飾宿主細(xì)胞的代謝途徑，合成復(fù)雜的代謝產(chǎn)物。目前，部分已成功運(yùn)用全細(xì)胞催化技術(shù)的實(shí)例見(jiàn)下表。1.生物柴油的開(kāi)發(fā)

2.手性醇的生產(chǎn)

3.生物轉(zhuǎn)化法合成核苷酸1.生物柴油的開(kāi)發(fā)定義：生物柴油是由動(dòng)物、植物、或微生物油脂與小分子醇類經(jīng)過(guò)酯交換反應(yīng)而得到的脂肪酸脂類物質(zhì)，可以替代柴油作為柴油發(fā)動(dòng)機(jī)的燃料。全細(xì)胞酶催化合成生物柴油具有效率高，生產(chǎn)成本低，酶對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性強(qiáng)，條件溫和、酶用量少、無(wú)污染排放，反應(yīng)后產(chǎn)物易分離，而且具有環(huán)境友好性等特點(diǎn)。

日本的YujiShimada等利用Novozym435(Candidaantarctica)脂肪酶在分段反應(yīng)器中通過(guò)流加甲醇生產(chǎn)生物柴油，產(chǎn)品中脂肪酸甲酯的體積分?jǐn)?shù)可以達(dá)到93%以上，并且經(jīng)過(guò)100天的反應(yīng)，酶不會(huì)失活。2008年Hama等首次采用重組真菌作全細(xì)胞催化劑生產(chǎn)生物柴油。將異孢鐮刀菌的脂肪酶基因轉(zhuǎn)化到米根霉進(jìn)行異源表達(dá)，用多孔生物量支架顆粒固定重組米根霉細(xì)胞，用于催化甲醇解反應(yīng)。結(jié)果表明，當(dāng)向反應(yīng)體系中添加5%水時(shí)，不但可以有效阻止甲醇對(duì)脂肪酶的失活效應(yīng)，而且還使部分甘油酯的酰基轉(zhuǎn)移更容易，使用10次后甲酯的產(chǎn)率仍可達(dá)94%。表明重組米根霉全細(xì)胞催化劑與野生米根霉全細(xì)胞催化劑相比，具有更高的甲酯得率且脂肪酶更加穩(wěn)定。

目前我國(guó)酶法生產(chǎn)生物柴油的工作也有重要進(jìn)展，其中北京化工大學(xué)采用自己開(kāi)發(fā)的酵母脂肪酶進(jìn)行酶法合成生物柴油研究，其生物柴油轉(zhuǎn)化率已達(dá)到96%，固定化半衰期達(dá)200h以上。用生物酶法制備生物柴油目前存在著一些問(wèn)題：反應(yīng)物甲醇容易導(dǎo)致酶失活副產(chǎn)物甘油影響酶反應(yīng)活性及穩(wěn)定性酶的使用壽命過(guò)短等生物催化合成法是利用生物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酶，選擇性的催化底物反應(yīng)，從而獲得高純度的手性單體。該反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫和、催化效率高、立體區(qū)域選擇性好，而且可以完成一些普通化學(xué)無(wú)法進(jìn)行的反應(yīng)等特點(diǎn)，受到有機(jī)化學(xué)家、生物學(xué)家及藥物學(xué)家的極大重視。該酶庫(kù)中一個(gè)成功的例子就是用能同時(shí)表達(dá)假絲酵母的4-氯-3-羥基丁酸乙酯還原酶基因和巨大芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因的重組大腸桿菌催化4-氯代乙酰乙酸乙酯生成S-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。在適當(dāng)?shù)臈l件下300g/L的4-氯代乙酰乙酸乙酯轉(zhuǎn)化為S-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，其摩爾產(chǎn)率96%，而NADP+的酶變率為21600mol/mol。S-4-氯-3-羥基丁酸乙酯是抑制羥甲基戊二酰輔酶A還原酶的重要起始原料，在Kaneka公司已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)。這種共表達(dá)系統(tǒng)也適合于其他NAD(P)H依賴型反應(yīng)。3.生物轉(zhuǎn)化法合成核苷酸核苷酸是一類在代謝上極為重要的生化物質(zhì)，除作為DNA、RNA的前體外，還參與細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝、能量的儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)化、免疫反應(yīng)及信號(hào)傳導(dǎo)。近年來(lái)隨著核酸工業(yè)的發(fā)展，嘧啶核苷酸作為藥物中間體、保健品和食品添加劑的重要性越來(lái)越突出。全細(xì)胞生物催化法不但能縮短生產(chǎn)周期并簡(jiǎn)化后提取過(guò)程，而且可以通過(guò)偶聯(lián)不同的基因工程菌株，生產(chǎn)多種復(fù)雜的核苷酸、核苷糖和寡聚糖。尿嘧啶核苷酸(UMP)是嘧啶核苷酸生物合成中處于結(jié)點(diǎn)位置的重要核苷酸，在寡聚糖合成和抗癌藥物生產(chǎn)中都是重要的前體物質(zhì)。在工業(yè)上，生物催化法合成UMP通常以乳清酸為底物，利用菌體自身產(chǎn)生的5-磷酸核糖焦磷酸(PRPP)經(jīng)過(guò)乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和乳清苷酸脫羧酶的催化作用合成。日本協(xié)和發(fā)酵公司的研究者把具有德夸菌素抗性、核苷酸酶弱化和溫度敏感性的產(chǎn)氨短桿菌KY13505突變菌株用表面活性劑NymeenS-215和甲苯處理使之獲得高通透性，在乳清酸用量為20g/L的體系中反應(yīng)26h，產(chǎn)物UMP達(dá)286g/L，這是到目前為止報(bào)道的UMP的最高產(chǎn)量。近幾年，國(guó)內(nèi)也開(kāi)展了全細(xì)胞生物催化合成UMP的研究。李慧采用鏈霉素抗性、卡那霉素抗性和產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物抗性作為篩選手段，對(duì)產(chǎn)氨棒桿菌進(jìn)行離子束和紫外誘變，選育出一株UMP生成能力比出發(fā)菌株R248提高7倍的突變株M14，其UMP的轉(zhuǎn)化能力達(dá)21g/L。研究表明，采用產(chǎn)氨棒桿菌模式菌株ATCC6872，確立催化反應(yīng)液的最佳組成為乳清酸、葡萄糖、磷酸根離子、MgCl2和T