細菌形態(tài)學檢查課件

第二章細菌形態(tài)學檢查第二章細菌形態(tài)學檢查2二細菌染色標本的檢查三顯微鏡概述一細菌不染色標本的檢查2二細菌染色標本的檢查三顯微鏡概述一細菌不染色標本的檢查3一、顯微鏡概述

顯微鏡（microscope）

顯微鏡是由一個透鏡或幾個透鏡的組合構(gòu)成的一種光學儀器，主要用于放大微小物體成為人的肉眼所能看到的儀器。3一、顯微鏡概述顯微鏡（microscope）4光學顯微鏡以自然光或燈光為光源，在最佳條件下最大分辨率為0.25μm，可以清楚的觀察到細菌、寄生蟲等個體。4光學顯微鏡以自然光或燈光為光源，在最佳條件下最大分5暗視野顯微鏡

用特制的暗視野集光器代替普通光學顯微鏡上的明視野集光器，故背景視野黑暗無光。常用于觀察活細菌、螺旋體、寄生蟲的運動現(xiàn)象。5暗視野顯微鏡6相差顯微鏡

根據(jù)標本中密度不同引起光相差異的原理觀察病原生物，主要用于檢查不染色病原生物的形態(tài)及某些內(nèi)部結(jié)構(gòu)。6相差顯微鏡7熒光顯微鏡

病原生物經(jīng)熒光染色后，置于熒光顯微鏡下可激發(fā)熒光，可以看到發(fā)射熒光的各種病原生物。7熒光顯微鏡8電子顯微鏡

是以電子流代替光源，能分辨1nm物體，又分為透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡。8電子顯微鏡9二、細菌不染色標本的檢查9二、細菌不染色標本的檢查101、懸滴法(a)在潔凈蓋玻片周圍涂少許凡士林。(b)在蓋玻片中央滴一小滴菌液。(c)將凹玻片反轉(zhuǎn)，使凹窩中心對準蓋玻片上的菌液滴，液滴不得與凹玻片接觸，輕壓使蓋玻片與凹玻片粘在一起，液滴處于封閉的小室中，防止液滴干燥和氣流的影響。101、懸滴法11(d)小心將凹玻片翻轉(zhuǎn)過來，使菌滴仍懸浮在蓋玻片下和凹窩中心。

(e)先用低倍鏡找到懸滴邊緣，再用高倍鏡觀察，觀察時光線要調(diào)得

暗一些。11(d)小心將凹玻片翻轉(zhuǎn)過來，使菌滴仍懸浮在蓋玻片下和凹窩122、壓滴法(a)制備菌懸液：取出1ml菌液稀釋至肉眼看不到混濁為止。(b)取2-3環(huán)稀釋菌液，放在載玻片中央。(c)用鑷子夾一潔凈的蓋玻片，使其一邊先接觸菌液，然后將整個蓋玻

片慢慢放下，注意不要產(chǎn)生氣泡。(d)先以低倍鏡找到標本，再用高倍鏡觀察，觀察時光線要調(diào)得暗些。122、壓滴法13三、細菌染色標本的檢查1、革蘭染色2、抗酸染色3、熒光染色13三、細菌染色標本的檢查1、革蘭染色141、革蘭染色

（Gram

stain）

染色原理：

通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染，在細胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭陽性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次多且致密，遇乙醇或丙酮脫色處理時，能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭陰性菌在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，通過脫色后呈無色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染，就使革陰性菌呈紅色。141、革蘭染色（Gramstain）15操作方法：1）涂片固定。2）草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘。3）用蒸餾水沖洗。4）加碘液覆蓋涂面媒染約1分鐘。

15操作方法：165）水洗，用吸水紙吸去水分。6）加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進行脫色，20秒后水洗，吸去水分。7）稀釋復(fù)紅或沙黃復(fù)染2分鐘后，水沖洗。干燥，鏡檢。

165）水洗，用吸水紙吸去水分。17鏡檢結(jié)果：革蘭染色陽性細菌（紫色）革蘭染色陰性細菌（紅色）17鏡檢結(jié)果：革蘭染色陽性細菌革蘭染色陰性細菌18臨床意義：1）細菌鑒定，分為革蘭染色陽性和陰性兩類。2）根據(jù)細菌染色性質(zhì)初步確定致病物質(zhì)。3）參考選擇抗菌藥物，合理指導臨床用藥。18臨床意義：192、抗酸染色（acid-faststain）

染色原理：

分枝桿菌的細胞壁內(nèi)含有大量的脂質(zhì)，包圍在肽聚糖的外面，所以分枝桿菌一般不易著色，要經(jīng)過加熱和延長染色時間來促使其著色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結(jié)合后，就很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色。192、抗酸染色（acid-faststain）染色原理20操作方法：1）初染：滴加石炭酸復(fù)紅2-3滴，在火焰高處徐徐加熱，出現(xiàn)蒸汽即暫時離開，避免干涸，加熱3-5分鐘，冷卻后用水沖洗。2）脫色：3%鹽酸酒精脫色30秒-1分鐘；用水沖洗。3）復(fù)染：用堿性美蘭溶液復(fù)染1分鐘，水洗，用吸水紙吸干后用油鏡觀察。20操作方法：21鏡檢結(jié)果：結(jié)核分枝桿菌21鏡檢結(jié)果：結(jié)核分枝桿菌22

臨床意義：

用于鑒定分枝桿菌屬細菌，如結(jié)核分枝桿菌、麻風分枝桿菌。22臨床意義：233、熒光染色

原理：

采用熒光素標記的已知抗體與細菌結(jié)合，含有該抗體的目的細菌在顯微鏡下發(fā)出熒光，非目的細菌則不發(fā)出熒光。233、熒光染色原理：24

臨床意義：

主要應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、白喉棒狀桿菌、痢疾志賀菌、病毒以及寄生蟲等的檢測與鑒別。24細菌形態(tài)學檢查法細菌形態(tài)學檢查法重點提示不染色標本的形態(tài)學檢查染色標本的形態(tài)學檢查革蘭染色抗酸染色重點提示不染色標本的形態(tài)學檢查一、顯微鏡1.普通光學顯微鏡（lightmicroscope）光源：可見光2.暗視野顯微鏡（darkfieldmicroscope）暗背景，菌體發(fā)光用于檢查不染色的活細菌和螺旋體的形態(tài)及運動觀察3.熒光顯微鏡（fluorescencemicroscope）光源：100W~200W的高壓汞燈一、顯微鏡1.普通光學顯微鏡（lightmicroscop一、顯微鏡4.相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope）檢查不染色活細菌的形態(tài)及某些內(nèi)部結(jié)構(gòu)5.電子顯微鏡（electronmicroscope)光源：電子流透射電鏡：觀察細菌內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)掃描電鏡：對細菌表面結(jié)構(gòu)及附件觀察一、顯微鏡4.相差顯微鏡（phasecontrastmi二、不染色標本的細菌學檢查常用方法壓滴法懸滴法用途動力試驗：檢查細菌有無動力及運動狀況制動試驗：初步鑒別病原菌；鑒定血清型二、不染色標本的細菌學檢查常用方法三、細菌染色標本的檢查（一）常用染料1.堿性染料：解離后色基帶正電荷，如美藍、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等。2.酸性染料：解離后色基帶負電荷，如伊紅、酸性復(fù)紅、剛果紅等。3.中性染料：堿性染料與酸性染料的復(fù)合物，如瑞氏染料、姬姆薩染料等。三、細菌染色標本的檢查（一）常用染料三、細菌染色標本的檢查(二)常用染色方法單染色法只用一種染料，如呂氏美藍。用于觀察細菌的形態(tài)、大小、排列。復(fù)染色法（鑒別染色法）用兩種或兩種以上不同顏色的染料，以區(qū)別細菌的著色性。三、細菌染色標本的檢查(二)常用染色方法三、細菌染色標本的檢查1.革蘭染色（Gramstaining）（1）原理細胞壁學說：兩種細菌細胞壁結(jié)構(gòu)不同-G+菌肽聚糖層厚、致密，脂質(zhì)含量少；G-菌薄而疏松，脂質(zhì)含量多。等電點學說：G+菌pI2～3；G-菌pI4～5化學學說：G+菌含有核糖核酸鎂鹽多，G-菌含量少。三、細菌染色標本的檢查1.革蘭染色（Gramstainin三、細菌染色標本的檢查-革蘭染色（2）結(jié)果細菌分為革蘭陽性（G+）菌和革蘭陰性（G-）菌紫色為革蘭陽性菌，紅色為革蘭陰性菌三、細菌染色標本的檢查-革蘭染色（2）結(jié)果紫色為革蘭陽性菌，革蘭染色方法革蘭染色方法三、細菌染色標本的檢查2.抗酸染色（1）原理：分枝桿菌細胞壁含脂質(zhì)較多，其中主要成分為分枝菌酸，此物具有抗酸性，染色時與石炭酸復(fù)紅結(jié)合牢固，能抵抗酸性乙醇的脫色作用，因此抗酸菌能保持復(fù)紅的顏色，達到初步鑒別細菌的目的。（2）結(jié)果：抗酸性細菌和非抗酸性細菌三、細菌染色標本的檢查2.抗酸染色未脫色細菌呈紅色為抗酸性細菌脫色經(jīng)復(fù)染呈藍色為非抗酸性細菌未脫色細菌呈紅色為抗酸性細菌3.其他染色方法（1）鞭毛染色（2）莢膜染色3.其他染色方法第三章細菌的分離培養(yǎng)第三章細菌的分離培養(yǎng)39二細菌的培養(yǎng)方法三培養(yǎng)基一細菌的接種方法39二細菌的培養(yǎng)方法三培養(yǎng)基一細菌的接種方法40一、培養(yǎng)基1、概念

將細菌生長繁殖所需的各類營養(yǎng)物質(zhì)按照一定比例配制而成的營養(yǎng)基質(zhì)，主要用于分離純種細菌、傳代保存細菌、鑒別細菌、研究細菌的生理生化特性和研制疫苗等。40一、培養(yǎng)基1、概念412、種類1）根據(jù)組成分類：①合成培養(yǎng)基：用已知化學成分的物質(zhì)配制而成。

特點：組成成分精確、重復(fù)性好，但價格較昂貴。

用途：適用于實驗室研究。②天然培養(yǎng)基：用化學成分尚不清楚或不恒定的天然有機物質(zhì)制成。（如肉浸汁、蛋白胨）

特點：經(jīng)濟。

用途：適用于大規(guī)模培養(yǎng)和生產(chǎn)及實驗室。412、種類422）根據(jù)物理性狀分類①液體培養(yǎng)基：把供細菌生長所需要的成分溶于水中，調(diào)適當pH，滅菌后即為液體培養(yǎng)基。②固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中加入1.5％-2％瓊脂。③半固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中加入0.2％-0.5％瓊脂。422）根據(jù)物理性狀分類43液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基43液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基443）根據(jù)用途分類：①基礎(chǔ)培養(yǎng)基②營養(yǎng)培養(yǎng)基③鑒別培養(yǎng)基④選擇培養(yǎng)基⑤厭氧培養(yǎng)基⑥L型培養(yǎng)基443）根據(jù)用途分類：453、基本成分（1）營養(yǎng)成分1）水分：水是細菌生長不可缺少的物質(zhì)，不僅是細菌細胞的組成成

分，也是良好的溶劑。培養(yǎng)基最好使用蒸餾水。2）蛋白胨：是細菌氮、碳的來源。3）血液和血清：血液中含有多種營養(yǎng)成分，是營養(yǎng)培養(yǎng)基的主要原

料之一，適用于對營養(yǎng)要求高的細菌的培養(yǎng)。453、基本成分464）糖類：通常用糖發(fā)酵試驗檢測細菌的生化性狀。5）肉浸膏：用?；蝰R的肉浸液濃縮而成，是豐富的營養(yǎng)液，適用于多數(shù)細菌的培養(yǎng)。6）酵母浸膏：將面包酵母細胞用自融方法破壞、沉淀后進行濃縮、干燥而成。7）雞卵和卵黃：凝固后可作為固體培養(yǎng)基，如培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌的羅氏培養(yǎng)基。8）膽汁和膽鹽：可用于制備鑒別培養(yǎng)基和增菌培養(yǎng)基。464）糖類：通常用糖發(fā)酵試驗檢測細菌的生化性狀。47（2）凝固劑1）瓊脂：主要化學成分是多糖，在98℃以上溶于水，至45℃以下凝固。2）明膠：主要成分是蛋白質(zhì)，但是營養(yǎng)價值不高，在24℃以上溶解，故不能在37℃孵育。47（2）凝固劑48（3）抑菌劑

抑制雜菌的生長，常用的有膽鹽、孔雀綠、亞硫酸鈉、苯乙醇等。（4）指示劑

指示劑是為了檢測培養(yǎng)基中pH的變化，常用的有酚紅、溴甲酚紫、甲基紅、酸性復(fù)紅等。48（3）抑菌劑494、培養(yǎng)基的制備1）調(diào)配與溶化：用電子天平稱量一定的原料，并加蒸餾水至所配置的體積，若加有瓊脂粉，則需加熱溶解。2）調(diào)整pH：一般培養(yǎng)基的pH為7.2-7.6左右，經(jīng)高壓鍋滅菌后其PH可發(fā)生0.1-0.2的變動。494、培養(yǎng)基的制備503）過濾澄清：液體或半固體培養(yǎng)基常采用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基在融化后趁熱用紗布或雙層紗布加脫脂棉過濾。4）分裝503）過濾澄清：液體或半固體培養(yǎng)基常采用濾紙過濾，固體培養(yǎng)515）滅菌：高壓滅菌，103.4kPa，121.3℃，15-30min。6）檢測與質(zhì)控7）保存：注明名稱、日期。一般放在4℃冰箱保存，不宜超過一周。515）滅菌：高壓滅菌，103.4kPa，121.3℃，15525、細菌常用培養(yǎng)基

血平板、巧克力平板、

中國藍平板或伊紅亞甲藍平板、

麥康凱平板、SS瓊脂、堿性瓊脂

或TCBS瓊脂、血液增菌培養(yǎng)基、

營養(yǎng)肉湯血培養(yǎng)瓶真菌培養(yǎng)管麥康凱瓊脂平板血瓊脂平板525、細菌常用培養(yǎng)基血培養(yǎng)瓶真菌培養(yǎng)管麥康凱瓊脂平板血瓊脂53

二、細菌的接種方法1）平板劃線法：分區(qū)劃線法：含菌量較多的標本（如膿汁等）。連續(xù)劃線法：含菌量較少的標本。2）斜面接種法：

挑取單個菌落，接種針從斜面底部自下而上劃一直線，再從底

部向上做S型劃線接種。53二、細菌的接種方法54分區(qū)劃線法54分區(qū)劃線法553）傾注平板法：用無菌吸管吸取原標本或經(jīng)適當稀釋的標本1ml，置于無菌平皿內(nèi)，傾入已融化并冷至50℃左右的培養(yǎng)基，立即混勻待凝固后倒置于35±1℃培養(yǎng)。4）穿刺接種法：由培養(yǎng)基中央刺到距管底約半厘米處，然后沿穿刺線退出接種針。553）傾注平板法：用無菌吸管吸取原標本或經(jīng)適當稀釋的標本15）液體接種法：將試管傾斜30度角，接種環(huán)觸到試管的內(nèi)壁研磨數(shù)次，然后讓試管回復(fù)到原來的直立位置淹沒接種部位。6）涂布接種法：加定量的菌液于瓊脂平板表面，用滅菌L型玻璃棒反復(fù)涂布幾次，使菌液均勻的分布在瓊脂表面。565）液體接種法：將試管傾斜30度角，接種環(huán)觸到試管的內(nèi)壁研磨57三、細菌的培養(yǎng)1）需氧培養(yǎng)：指需氧菌或兼性厭氧菌在有氧條件下的培養(yǎng)。2）二氧化碳培養(yǎng)：某些細菌在培養(yǎng)時，特別是初次分離時需要5%-10%的CO2環(huán)境。3）微需氧培養(yǎng)：即在5%-6%

O2，6%-10%

CO2的環(huán)境生長。4）厭氧培養(yǎng)：細菌對氧敏感，培養(yǎng)過程中需造成無氧環(huán)境。57三、細菌的培養(yǎng)58四、細菌的生長性狀1）液體培養(yǎng)基：大多數(shù)菌呈均勻混濁狀態(tài)，少數(shù)鏈狀的細菌（如鏈球菌）則呈沉淀生長，專性需氧菌（如分枝結(jié)核桿菌）呈表面生長，形成菌膜。58四、細菌的生長性狀59

3）固體培養(yǎng)基（1）菌落：單個細菌分裂繁殖成一堆肉眼可見的細菌集團，稱為菌落。

（2）菌落分為三型：①光滑型（S型菌落）：表面光滑、濕潤、邊緣整齊。②粗糙型菌落（R型菌落）：表面粗糙，干燥、呈皺紋或顆粒狀，邊緣不整齊。③黏液型菌落（M型菌落）：粘稠、有光澤、似水珠樣。593）固體培養(yǎng)基602）半固體培養(yǎng)基（1）有鞭毛的細菌，沿穿刺線呈羽毛狀或云霧狀渾濁生長。（2）無鞭毛的細菌：只能沿穿刺線呈明顯的線狀生長。602）半固體培養(yǎng)基細菌的培養(yǎng)與分離技術(shù)細菌的培養(yǎng)與分離技術(shù)重點提示培養(yǎng)基的主要成分及作用培養(yǎng)基的種類培養(yǎng)基制備的基本程序細菌接種與培養(yǎng)方法細菌在培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象重點提示培養(yǎng)基的主要成分及作用一、培養(yǎng)基概念：人工配制的、適合細菌生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。要求：培養(yǎng)基必須含有細菌生長繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)和適宜的pH值。一、培養(yǎng)基概念：人工配制的、適合細菌生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。一、培養(yǎng)基（一）培養(yǎng)基的組成1.營養(yǎng)物質(zhì)：氮源、碳源、無機鹽、生長因子蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖（醇）類、血液、雞蛋和動物血清、無機鹽類、生長因子2.水：蒸餾水或去離子水3.凝固物質(zhì)：即賦形劑，常用瓊脂、明膠一、培養(yǎng)基（一）培養(yǎng)基的組成一、培養(yǎng)基4.抑制劑抑制非檢出菌的生長或使其少生長，以利于檢出菌的生長。膽鹽、煌綠、亞硫酸鈉、某些染料及抗生素等。5.指示劑常用的指示劑：酚紅、中性紅、中國藍、溴甲酚紫、酸性復(fù)紅等。一、培養(yǎng)基4.抑制劑一、培養(yǎng)基1.按用途分類基礎(chǔ)培養(yǎng)基：只有基本營養(yǎng)成分營養(yǎng)培養(yǎng)基：加有血液、血清等鑒別培養(yǎng)基：含有特定底物和指示劑選擇培養(yǎng)基：含有抑制劑特殊培養(yǎng)基：厭氧、細菌L型（二）培養(yǎng)基分類一、培養(yǎng)基1.按用途分類（二）培養(yǎng)基分類一、培養(yǎng)基2.按物理性狀分類液體培養(yǎng)基：增菌固體培養(yǎng)基：分離培養(yǎng)、純化、增菌半固體培養(yǎng)基：動力檢測、保存菌種一、培養(yǎng)基2.按物理性狀分類一、培養(yǎng)基（三）培養(yǎng)基的制備1.調(diào)配：根據(jù)培養(yǎng)基組成，準確稱取各組分，先加一部分蒸餾水，再加培養(yǎng)基干粉，最后補足水量。2.溶解：液體培養(yǎng)基不需加熱3.校正pH：一般7.2~7.64.過濾澄清：液體培養(yǎng)基用濾紙；固體培養(yǎng)基用紗布（若培養(yǎng)基澄清，此步可省略）一、培養(yǎng)基（三）培養(yǎng)基的制備一、培養(yǎng)基5.分裝平板：滅菌后冷卻至50~60℃時傾倒

90mm內(nèi)徑傾注25~30ml（4mm厚）：藥敏用

90mm內(nèi)徑傾注13~15ml（3mm厚）：培養(yǎng)用瓊脂斜面：分裝量為試管的1/4~1/3，滅菌后趁熱擺成斜面，斜面長度約為試管的2/3。高層、半固體、液體：分裝量為試管長度的1/3。一、培養(yǎng)基5.分裝一、培養(yǎng)基6.滅菌高壓蒸汽滅菌無糖：103.4kPa121.3℃維持15~20min有糖：68.95kPa115℃維持15min間歇蒸汽滅菌法：血清、牛乳、雞蛋血清凝固器滅菌一、培養(yǎng)基6.滅菌一、培養(yǎng)基7.質(zhì)量檢驗無菌試驗：將制好的培養(yǎng)基在35℃孵育過夜，判定是否滅菌合格。效果檢查：按不同的培養(yǎng)要求，接種相應(yīng)菌種，觀察細菌的生長狀況，判斷培養(yǎng)基是否符合要求。8.保存

4℃冰箱保存1周左右一、培養(yǎng)基7.質(zhì)量檢驗二、細菌的人工培養(yǎng)（一）無菌技術(shù)無菌技術(shù)是指防止微生物進入物品或機體，同時防止待檢物中可能存在的病原微生物污染周圍環(huán)境及工作人員的規(guī)范化操作技術(shù)無菌技術(shù)是保證細菌檢驗質(zhì)量，防止污染和病原菌擴散的基礎(chǔ)二、細菌的人工培養(yǎng)（一）無菌技術(shù)二、細菌的人工培養(yǎng)（二）細菌的接種與分離方法1.平板劃線法：分離單個菌落2.瓊脂斜面接種法：純培養(yǎng)3.液體培養(yǎng)基接種法：增菌4.穿刺接種法：觀察細菌動力5.涂布平板法：計數(shù)細菌數(shù)量6.傾注接種法：紙片法藥敏試驗二、細菌的人工培養(yǎng)（二）細菌的接種與分離方法分區(qū)劃線分離法分區(qū)劃線分離法連續(xù)劃線分離法培養(yǎng)后菌落分布連續(xù)劃線分離法瓊脂斜面培養(yǎng)基接種瓊脂斜面培養(yǎng)基接種液體培養(yǎng)基接種半固體培養(yǎng)基接種液體培養(yǎng)基接種半固體培養(yǎng)基接種二、細菌的人工培養(yǎng)（三）細菌的培養(yǎng)方法1.需氧培養(yǎng)法普通培養(yǎng)2.二氧化碳培養(yǎng)（1）二氧化碳培養(yǎng)箱（2）燭缸法3.微需氧培養(yǎng)法4.厭氧培養(yǎng)法二、細菌的人工培養(yǎng)（三）細菌的培養(yǎng)方法二、細菌的人工培養(yǎng)（四）細菌的生長現(xiàn)象1.固體培養(yǎng)基上的生長現(xiàn)象菌落：單個細菌在培養(yǎng)基上分裂繁殖成一堆肉眼可見的細菌集團CFU：菌落形成單位，活菌計數(shù)用細菌菌落的描述：大小、形狀、突起或扁平、邊緣、顏色、表面、透明度等二、細菌的人工培養(yǎng)（四）細菌的生長現(xiàn)象二、細菌的人工培養(yǎng)2.在液體培養(yǎng)基中均勻混濁：大多數(shù)細菌沉淀生長：呈鏈狀排列的細菌表面生長：專性需氧菌3.在半固體培養(yǎng)基有鞭毛菌：羽毛狀或云霧狀擴散生長無鞭毛菌：沿穿刺線生長二、細菌的人工培養(yǎng)2.在液體培養(yǎng)基中（五）培養(yǎng)基的選擇1.血瓊脂平板巧克力色瓊脂平板腸道選擇培養(yǎng)基血液增菌培養(yǎng)基堿性瓊脂或TCBS瓊脂二、細菌的人工培養(yǎng)（五）培養(yǎng)基的選擇二、細菌的人工培養(yǎng)ThankYou!ThankYou!第二章細菌形態(tài)學檢查第二章細菌形態(tài)學檢查84二細菌染色標本的檢查三顯微鏡概述一細菌不染色標本的檢查2二細菌染色標本的檢查三顯微鏡概述一細菌不染色標本的檢查85一、顯微鏡概述

顯微鏡（microscope）

顯微鏡是由一個透鏡或幾個透鏡的組合構(gòu)成的一種光學儀器，主要用于放大微小物體成為人的肉眼所能看到的儀器。3一、顯微鏡概述顯微鏡（microscope）86光學顯微鏡以自然光或燈光為光源，在最佳條件下最大分辨率為0.25μm，可以清楚的觀察到細菌、寄生蟲等個體。4光學顯微鏡以自然光或燈光為光源，在最佳條件下最大分87暗視野顯微鏡

用特制的暗視野集光器代替普通光學顯微鏡上的明視野集光器，故背景視野黑暗無光。常用于觀察活細菌、螺旋體、寄生蟲的運動現(xiàn)象。5暗視野顯微鏡88相差顯微鏡

根據(jù)標本中密度不同引起光相差異的原理觀察病原生物，主要用于檢查不染色病原生物的形態(tài)及某些內(nèi)部結(jié)構(gòu)。6相差顯微鏡89熒光顯微鏡

病原生物經(jīng)熒光染色后，置于熒光顯微鏡下可激發(fā)熒光，可以看到發(fā)射熒光的各種病原生物。7熒光顯微鏡90電子顯微鏡

是以電子流代替光源，能分辨1nm物體，又分為透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡。8電子顯微鏡91二、細菌不染色標本的檢查9二、細菌不染色標本的檢查921、懸滴法(a)在潔凈蓋玻片周圍涂少許凡士林。(b)在蓋玻片中央滴一小滴菌液。(c)將凹玻片反轉(zhuǎn)，使凹窩中心對準蓋玻片上的菌液滴，液滴不得與凹玻片接觸，輕壓使蓋玻片與凹玻片粘在一起，液滴處于封閉的小室中，防止液滴干燥和氣流的影響。101、懸滴法93(d)小心將凹玻片翻轉(zhuǎn)過來，使菌滴仍懸浮在蓋玻片下和凹窩中心。

(e)先用低倍鏡找到懸滴邊緣，再用高倍鏡觀察，觀察時光線要調(diào)得

暗一些。11(d)小心將凹玻片翻轉(zhuǎn)過來，使菌滴仍懸浮在蓋玻片下和凹窩942、壓滴法(a)制備菌懸液：取出1ml菌液稀釋至肉眼看不到混濁為止。(b)取2-3環(huán)稀釋菌液，放在載玻片中央。(c)用鑷子夾一潔凈的蓋玻片，使其一邊先接觸菌液，然后將整個蓋玻

片慢慢放下，注意不要產(chǎn)生氣泡。(d)先以低倍鏡找到標本，再用高倍鏡觀察，觀察時光線要調(diào)得暗些。122、壓滴法95三、細菌染色標本的檢查1、革蘭染色2、抗酸染色3、熒光染色13三、細菌染色標本的檢查1、革蘭染色961、革蘭染色

（Gram

stain）

染色原理：

通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染，在細胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭陽性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次多且致密，遇乙醇或丙酮脫色處理時，能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭陰性菌在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，通過脫色后呈無色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染，就使革陰性菌呈紅色。141、革蘭染色（Gramstain）97操作方法：1）涂片固定。2）草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘。3）用蒸餾水沖洗。4）加碘液覆蓋涂面媒染約1分鐘。

15操作方法：985）水洗，用吸水紙吸去水分。6）加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進行脫色，20秒后水洗，吸去水分。7）稀釋復(fù)紅或沙黃復(fù)染2分鐘后，水沖洗。干燥，鏡檢。

165）水洗，用吸水紙吸去水分。99鏡檢結(jié)果：革蘭染色陽性細菌（紫色）革蘭染色陰性細菌（紅色）17鏡檢結(jié)果：革蘭染色陽性細菌革蘭染色陰性細菌100臨床意義：1）細菌鑒定，分為革蘭染色陽性和陰性兩類。2）根據(jù)細菌染色性質(zhì)初步確定致病物質(zhì)。3）參考選擇抗菌藥物，合理指導臨床用藥。18臨床意義：1012、抗酸染色（acid-faststain）

染色原理：

分枝桿菌的細胞壁內(nèi)含有大量的脂質(zhì)，包圍在肽聚糖的外面，所以分枝桿菌一般不易著色，要經(jīng)過加熱和延長染色時間來促使其著色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結(jié)合后，就很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色。192、抗酸染色（acid-faststain）染色原理102操作方法：1）初染：滴加石炭酸復(fù)紅2-3滴，在火焰高處徐徐加熱，出現(xiàn)蒸汽即暫時離開，避免干涸，加熱3-5分鐘，冷卻后用水沖洗。2）脫色：3%鹽酸酒精脫色30秒-1分鐘；用水沖洗。3）復(fù)染：用堿性美蘭溶液復(fù)染1分鐘，水洗，用吸水紙吸干后用油鏡觀察。20操作方法：103鏡檢結(jié)果：結(jié)核分枝桿菌21鏡檢結(jié)果：結(jié)核分枝桿菌104

臨床意義：

用于鑒定分枝桿菌屬細菌，如結(jié)核分枝桿菌、麻風分枝桿菌。22臨床意義：1053、熒光染色

原理：

采用熒光素標記的已知抗體與細菌結(jié)合，含有該抗體的目的細菌在顯微鏡下發(fā)出熒光，非目的細菌則不發(fā)出熒光。233、熒光染色原理：106

臨床意義：

主要應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、白喉棒狀桿菌、痢疾志賀菌、病毒以及寄生蟲等的檢測與鑒別。24細菌形態(tài)學檢查法細菌形態(tài)學檢查法重點提示不染色標本的形態(tài)學檢查染色標本的形態(tài)學檢查革蘭染色抗酸染色重點提示不染色標本的形態(tài)學檢查一、顯微鏡1.普通光學顯微鏡（lightmicroscope）光源：可見光2.暗視野顯微鏡（darkfieldmicroscope）暗背景，菌體發(fā)光用于檢查不染色的活細菌和螺旋體的形態(tài)及運動觀察3.熒光顯微鏡（fluorescencemicroscope）光源：100W~200W的高壓汞燈一、顯微鏡1.普通光學顯微鏡（lightmicroscop一、顯微鏡4.相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope）檢查不染色活細菌的形態(tài)及某些內(nèi)部結(jié)構(gòu)5.電子顯微鏡（electronmicroscope)光源：電子流透射電鏡：觀察細菌內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)掃描電鏡：對細菌表面結(jié)構(gòu)及附件觀察一、顯微鏡4.相差顯微鏡（phasecontrastmi二、不染色標本的細菌學檢查常用方法壓滴法懸滴法用途動力試驗：檢查細菌有無動力及運動狀況制動試驗：初步鑒別病原菌；鑒定血清型二、不染色標本的細菌學檢查常用方法三、細菌染色標本的檢查（一）常用染料1.堿性染料：解離后色基帶正電荷，如美藍、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等。2.酸性染料：解離后色基帶負電荷，如伊紅、酸性復(fù)紅、剛果紅等。3.中性染料：堿性染料與酸性染料的復(fù)合物，如瑞氏染料、姬姆薩染料等。三、細菌染色標本的檢查（一）常用染料三、細菌染色標本的檢查(二)常用染色方法單染色法只用一種染料，如呂氏美藍。用于觀察細菌的形態(tài)、大小、排列。復(fù)染色法（鑒別染色法）用兩種或兩種以上不同顏色的染料，以區(qū)別細菌的著色性。三、細菌染色標本的檢查(二)常用染色方法三、細菌染色標本的檢查1.革蘭染色（Gramstaining）（1）原理細胞壁學說：兩種細菌細胞壁結(jié)構(gòu)不同-G+菌肽聚糖層厚、致密，脂質(zhì)含量少；G-菌薄而疏松，脂質(zhì)含量多。等電點學說：G+菌pI2～3；G-菌pI4～5化學學說：G+菌含有核糖核酸鎂鹽多，G-菌含量少。三、細菌染色標本的檢查1.革蘭染色（Gramstainin三、細菌染色標本的檢查-革蘭染色（2）結(jié)果細菌分為革蘭陽性（G+）菌和革蘭陰性（G-）菌紫色為革蘭陽性菌，紅色為革蘭陰性菌三、細菌染色標本的檢查-革蘭染色（2）結(jié)果紫色為革蘭陽性菌，革蘭染色方法革蘭染色方法三、細菌染色標本的檢查2.抗酸染色（1）原理：分枝桿菌細胞壁含脂質(zhì)較多，其中主要成分為分枝菌酸，此物具有抗酸性，染色時與石炭酸復(fù)紅結(jié)合牢固，能抵抗酸性乙醇的脫色作用，因此抗酸菌能保持復(fù)紅的顏色，達到初步鑒別細菌的目的。（2）結(jié)果：抗酸性細菌和非抗酸性細菌三、細菌染色標本的檢查2.抗酸染色未脫色細菌呈紅色為抗酸性細菌脫色經(jīng)復(fù)染呈藍色為非抗酸性細菌未脫色細菌呈紅色為抗酸性細菌3.其他染色方法（1）鞭毛染色（2）莢膜染色3.其他染色方法第三章細菌的分離培養(yǎng)第三章細菌的分離培養(yǎng)121二細菌的培養(yǎng)方法三培養(yǎng)基一細菌的接種方法39二細菌的培養(yǎng)方法三培養(yǎng)基一細菌的接種方法122一、培養(yǎng)基1、概念

將細菌生長繁殖所需的各類營養(yǎng)物質(zhì)按照一定比例配制而成的營養(yǎng)基質(zhì)，主要用于分離純種細菌、傳代保存細菌、鑒別細菌、研究細菌的生理生化特性和研制疫苗等。40一、培養(yǎng)基1、概念1232、種類1）根據(jù)組成分類：①合成培養(yǎng)基：用已知化學成分的物質(zhì)配制而成。

特點：組成成分精確、重復(fù)性好，但價格較昂貴。

用途：適用于實驗室研究。②天然培養(yǎng)基：用化學成分尚不清楚或不恒定的天然有機物質(zhì)制成。（如肉浸汁、蛋白胨）

特點：經(jīng)濟。

用途：適用于大規(guī)模培養(yǎng)和生產(chǎn)及實驗室。412、種類1242）根據(jù)物理性狀分類①液體培養(yǎng)基：把供細菌生長所需要的成分溶于水中，調(diào)適當pH，滅菌后即為液體培養(yǎng)基。②固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中加入1.5％-2％瓊脂。③半固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中加入0.2％-0.5％瓊脂。422）根據(jù)物理性狀分類125液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基43液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基1263）根據(jù)用途分類：①基礎(chǔ)培養(yǎng)基②營養(yǎng)培養(yǎng)基③鑒別培養(yǎng)基④選擇培養(yǎng)基⑤厭氧培養(yǎng)基⑥L型培養(yǎng)基443）根據(jù)用途分類：1273、基本成分（1）營養(yǎng)成分1）水分：水是細菌生長不可缺少的物質(zhì)，不僅是細菌細胞的組成成

分，也是良好的溶劑。培養(yǎng)基最好使用蒸餾水。2）蛋白胨：是細菌氮、碳的來源。3）血液和血清：血液中含有多種營養(yǎng)成分，是營養(yǎng)培養(yǎng)基的主要原

料之一，適用于對營養(yǎng)要求高的細菌的培養(yǎng)。453、基本成分1284）糖類：通常用糖發(fā)酵試驗檢測細菌的生化性狀。5）肉浸膏：用?；蝰R的肉浸液濃縮而成，是豐富的營養(yǎng)液，適用于多數(shù)細菌的培養(yǎng)。6）酵母浸膏：將面包酵母細胞用自融方法破壞、沉淀后進行濃縮、干燥而成。7）雞卵和卵黃：凝固后可作為固體培養(yǎng)基，如培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌的羅氏培養(yǎng)基。8）膽汁和膽鹽：可用于制備鑒別培養(yǎng)基和增菌培養(yǎng)基。464）糖類：通常用糖發(fā)酵試驗檢測細菌的生化性狀。129（2）凝固劑1）瓊脂：主要化學成分是多糖，在98℃以上溶于水，至45℃以下凝固。2）明膠：主要成分是蛋白質(zhì)，但是營養(yǎng)價值不高，在24℃以上溶解，故不能在37℃孵育。47（2）凝固劑130（3）抑菌劑

抑制雜菌的生長，常用的有膽鹽、孔雀綠、亞硫酸鈉、苯乙醇等。（4）指示劑

指示劑是為了檢測培養(yǎng)基中pH的變化，常用的有酚紅、溴甲酚紫、甲基紅、酸性復(fù)紅等。48（3）抑菌劑1314、培養(yǎng)基的制備1）調(diào)配與溶化：用電子天平稱量一定的原料，并加蒸餾水至所配置的體積，若加有瓊脂粉，則需加熱溶解。2）調(diào)整pH：一般培養(yǎng)基的pH為7.2-7.6左右，經(jīng)高壓鍋滅菌后其PH可發(fā)生0.1-0.2的變動。494、培養(yǎng)基的制備1323）過濾澄清：液體或半固體培養(yǎng)基常采用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基在融化后趁熱用紗布或雙層紗布加脫脂棉過濾。4）分裝503）過濾澄清：液體或半固體培養(yǎng)基常采用濾紙過濾，固體培養(yǎng)1335）滅菌：高壓滅菌，103.4kPa，121.3℃，15-30min。6）檢測與質(zhì)控7）保存：注明名稱、日期。一般放在4℃冰箱保存，不宜超過一周。515）滅菌：高壓滅菌，103.4kPa，121.3℃，151345、細菌常用培養(yǎng)基

血平板、巧克力平板、

中國藍平板或伊紅亞甲藍平板、

麥康凱平板、SS瓊脂、堿性瓊脂

或TCBS瓊脂、血液增菌培養(yǎng)基、

營養(yǎng)肉湯血培養(yǎng)瓶真菌培養(yǎng)管麥康凱瓊脂平板血瓊脂平板525、細菌常用培養(yǎng)基血培養(yǎng)瓶真菌培養(yǎng)管麥康凱瓊脂平板血瓊脂135

二、細菌的接種方法1）平板劃線法：分區(qū)劃線法：含菌量較多的標本（如膿汁等）。連續(xù)劃線法：含菌量較少的標本。2）斜面接種法：

挑取單個菌落，接種針從斜面底部自下而上劃一直線，再從底

部向上做S型劃線接種。53二、細菌的接種方法136分區(qū)劃線法54分區(qū)劃線法1373）傾注平板法：用無菌吸管吸取原標本或經(jīng)適當稀釋的標本1ml，置于無菌平皿內(nèi)，傾入已融化并冷至50℃左右的培養(yǎng)基，立即混勻待凝固后倒置于35±1℃培養(yǎng)。4）穿刺接種法：由培養(yǎng)基中央刺到距管底約半厘米處，然后沿穿刺線退出接種針。553）傾注平板法：用無菌吸管吸取原標本或經(jīng)適當稀釋的標本15）液體接種法：將試管傾斜30度角，接種環(huán)觸到試管的內(nèi)壁研磨數(shù)次，然后讓試管回復(fù)到原來的直立位置淹沒接種部位。6）涂布接種法：加定量的菌液于瓊脂平板表面，用滅菌L型玻璃棒反復(fù)涂布幾次，使菌液均勻的分布在瓊脂表面。1385）液體接種法：將試管傾斜30度角，接種環(huán)觸到試管的內(nèi)壁研磨139三、細菌的培養(yǎng)1）需氧培養(yǎng)：指需氧菌或兼性厭氧菌在有氧條件下的培養(yǎng)。2）二氧化碳培養(yǎng)：某些細菌在培養(yǎng)時，特別是初次分離時需要5%-10%的CO2環(huán)境。3）微需氧培養(yǎng)：即在5%-6%

O2，6%-10%

CO2的環(huán)境生長。4）厭氧培養(yǎng)：細菌對氧敏感，培養(yǎng)過程中需造成無氧環(huán)境。57三、細菌的培養(yǎng)140四、細菌的生長性狀1）液體培養(yǎng)基：大多數(shù)菌呈均勻混濁狀態(tài)，少數(shù)鏈狀的細菌（如鏈球菌）則呈沉淀生長，專性需氧菌（如分枝結(jié)核桿菌）呈表面生長，形成菌膜。58四、細菌的生長性狀141

3）固體培養(yǎng)基（1）菌落：單個細菌分裂繁殖成一堆肉眼可見的細菌集團，稱為菌落。

（2）菌落分為三型：①光滑型（S型菌落）：表面光滑、濕潤、邊緣整齊。②粗糙型菌落（R型菌落）：表面粗糙，干燥、呈皺紋或顆粒狀，邊緣不整齊。③黏液型菌落（M型菌落）：粘稠、有光澤、似水珠樣。593）固體培養(yǎng)基1422）半固體培養(yǎng)基（1）有鞭毛的細菌，沿穿刺線呈羽毛狀或云霧狀渾濁生長。（2）無鞭毛的細菌：只能沿穿刺線呈明顯的線狀生長。602）半固體培養(yǎng)基細菌的培養(yǎng)與分離技術(shù)細菌的培養(yǎng)與分離技術(shù)重點提示培養(yǎng)基的主要成分及作用培養(yǎng)基的種類培養(yǎng)基制備的基本程序細菌接種與培養(yǎng)方法細菌在培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象重點提示培養(yǎng)基的主要成分及作用一、培養(yǎng)基概念：人工配制的、適合細菌生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。要求：培養(yǎng)基必須含有細菌生長繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)和適宜的pH值。一、培養(yǎng)基概念：人工配制的、適合細菌生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。一、培養(yǎng)基（一）培養(yǎng)基的組成1.營養(yǎng)物質(zhì)：氮源、碳源、無機鹽、生長因子蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖（醇）類、血液、雞蛋和動物血清、無機鹽類、生長因子2.水：蒸餾水或去離子水3.凝固物質(zhì)：即賦形劑，常用瓊脂、明膠一、培養(yǎng)基（一）培養(yǎng)基的組成一、培養(yǎng)基4.抑制劑抑制非檢出菌的生長或使其少生長，以利于檢出菌的生長。膽鹽、煌綠、亞硫酸鈉、某些染料及抗生素等。5.指示劑常用的指示劑：酚紅、中性紅、中國藍、溴甲酚紫、酸性復(fù)紅等。一、培養(yǎng)基4.抑制劑一、培養(yǎng)基1.按用途分類基礎(chǔ)培養(yǎng)基：只有基本營養(yǎng)成分營養(yǎng)培養(yǎng)基：加有血液、血清等鑒別培養(yǎng)基：含有特定底物