結(jié)核抗酸性染色

抗酸染色第1頁，共21頁。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆湛顾崛旧脑砗头椒顾崛旧?頁，共21頁。分枝桿菌的細(xì)胞壁內(nèi)含有大量的脂質(zhì)，主要是分枝菌酸，它包圍在肽聚糖的外面，所以分枝桿菌一般不易著色，要經(jīng)過加熱和延長染色時(shí)間來促使其著色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結(jié)合后，就很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色。齊-尼氏抗酸染色法是在加熱條件下使分枝菌酸與石炭酸復(fù)紅牢固結(jié)合成復(fù)合物，用鹽酸酒精處理也不脫色。當(dāng)再加堿性美蘭復(fù)染后，分枝桿菌仍然為紅色，而其他細(xì)菌及背景中的物質(zhì)為蘭色。二、實(shí)驗(yàn)原理：第3頁，共21頁。三、實(shí)驗(yàn)材料：細(xì)菌：結(jié)核桿菌染液：石炭酸復(fù)紅液、3%鹽酸酒精、堿性美蘭溶液其它：接種環(huán)、酒精燈、載玻片等第4頁，共21頁。四、實(shí)驗(yàn)方法：1、細(xì)菌涂片標(biāo)本的制備涂片干燥固定2、染色3、油鏡觀察1）初染：用玻片夾夾持涂片標(biāo)本，滴加石炭酸復(fù)紅2-3滴，在火焰高處徐徐加熱，切勿沸騰，出現(xiàn)蒸汽即暫時(shí)離開，若染液蒸發(fā)減少，應(yīng)再加染液，以免干涸，加熱3-5分鐘，待標(biāo)本冷卻后用水沖洗。2）脫色：3%鹽酸酒精脫色30’’~1’；用水沖洗。3）復(fù)染：用堿性美蘭溶液復(fù)染1’，用水沖洗后用吸水紙吸干。第5頁，共21頁。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：結(jié)核桿菌呈紅色，常堆積成團(tuán)，排列無序，偶呈分枝狀生長。背景及非抗酸性細(xì)菌呈蘭色。第6頁，共21頁。第7頁，共21頁。六、注意事項(xiàng)：1、無菌操作2、涂片厚度要適中3、固定4、沖洗5、染色時(shí)間6、初染加熱的溫度，勿沸騰第8頁，共21頁。結(jié)核桿菌的培養(yǎng)特點(diǎn)培養(yǎng)基：羅-琴氏（LowenateinJensen）培養(yǎng)基

主要成分：蛋黃；甘油；天門冬素；馬鈴薯淀粉；無機(jī)鹽；孔雀綠；蛋黃含脂質(zhì)生長因子，能刺激生長，孔雀綠可抑制雜菌生長。第9頁，共21頁。生長特點(diǎn)：緩慢；2-4周可見菌落；呈乳白色或米黃色，不透明，粗糙型顆粒狀，結(jié)節(jié)狀，菜花狀菌落。

液體培養(yǎng)基中呈膜樣生長。第10頁，共21頁。溶菌酶的溶菌作用第11頁，共21頁。目的要求了解溶菌酶的溶菌現(xiàn)象了解溶菌酶的殺菌機(jī)制第12頁，共21頁。原理溶菌酶是正常體液和分泌液中所含的一種低分子量堿性蛋白，能水解G+菌細(xì)胞壁中的肽聚糖成分，致使細(xì)菌崩解。G-菌細(xì)胞壁肽聚糖層外面還有一層外膜，故一般情況下不受溶菌酶的影響。溶菌酶是非特異性免疫中一種重要的體液殺菌成分。第13頁，共21頁。材料混有溶壁微球菌的1％瓊脂平板人的唾液（含有溶菌酶）、PBS、溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品打孔器、針頭、吸管、量尺第14頁，共21頁。方法菌液的準(zhǔn)備：溶壁微球菌在使用前于普通瓊脂斜面?zhèn)鞔淮危缓蠼臃N于普通瓊脂斜面37℃培養(yǎng)24h。加pH6.4的1/15mol/L磷酸緩沖液，將菌苔洗下，用比濁法使每ml菌液含相當(dāng)于2000億菌體濃度，再以70℃水浴加熱1h殺菌。稱取1g優(yōu)質(zhì)瓊脂加入pH6.4的1/15mol/L磷酸緩沖液100ml，加熱溶解。第15頁，共21頁。方法取1ml菌液加到50-60℃已溶化的瓊脂內(nèi)，搖勻，取15ml培養(yǎng)基傾注平板待凝。打孔打孔打5孔，邊緣不能裂開，依次標(biāo)記“1”-“5”于皿底；封底加樣

1-5號孔分別加溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品、PBS、唾液1、唾液2、唾液3（以加滿孔但又不溢出為宜）置于24-26℃，12-18h后測量加樣孔周圍溶菌環(huán)直徑。第16頁，共21頁。打孔第17頁，共21頁。封底第18頁，共21頁。結(jié)果第19頁，共21頁。注意事項(xiàng)打孔時(shí)保持邊緣完整打孔后應(yīng)當(dāng)封底，以免樣品發(fā)生底漏向孔內(nèi)加樣時(shí)，樣品不能溢出孔外，孔內(nèi)不能有氣泡第20頁，共21頁。內(nèi)容梗概抗酸染色?？顾崛旧７种U菌的細(xì)胞壁內(nèi)含有大量的脂質(zhì)，主要是分枝菌酸，它包圍在肽聚糖的外面，所以分枝桿菌一般不易著色，要經(jīng)過加熱和延長染色時(shí)間來促使其著色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結(jié)合后，就很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色。當(dāng)再加堿性美蘭復(fù)染后，分枝桿菌仍然為紅色，而其他細(xì)菌及背景中的物質(zhì)為蘭色。染液：石炭酸復(fù)紅液、3%鹽酸酒精、堿性美蘭溶液。其它：接種環(huán)、酒精燈、載玻片等。1）初染：用玻片夾夾持涂片標(biāo)本，滴加石炭酸復(fù)紅2-3滴，在火焰高處徐徐加熱，切勿沸騰，出現(xiàn)蒸汽即暫時(shí)離開，若染液蒸發(fā)減少，應(yīng)再加染液，以免干涸，加熱3-5分鐘，待標(biāo)本冷卻后用水沖洗。2）脫色：3%鹽酸酒精脫色30’’~1’。3）復(fù)染：用堿性美蘭溶液復(fù)染1’，用水沖洗后用吸水紙吸干。結(jié)核桿菌呈紅色，常堆積成團(tuán)，排列無序，偶呈分枝狀生長。培養(yǎng)基：羅-琴氏（LowenateinJensen）培養(yǎng)基。蛋黃含脂質(zhì)生長因子，能