代謝控制發(fā)酵的基本思想2課件

第三章代謝控制發(fā)酵的基本思想

第二講1基本思想：一切斷支路代謝二解除菌體自身的反饋調(diào)節(jié)三去除終產(chǎn)物四增加前體物的合成五特殊調(diào)節(jié)機制的利用六條件突變株的應用七選育不生成副產(chǎn)物的菌株八選育生產(chǎn)代謝拮抗物質(zhì)的菌株2四.增加前體物的合成通過選育某些營養(yǎng)缺陷型或結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株以及克隆某些關鍵酶的方法，增加目的產(chǎn)物的前體物的合成，有利于目的產(chǎn)物的大量積累。3例1預苯酸苯丙酮酸L-苯丙氨酸前酪氨酸L-酪氨酸預苯酸脫氫酶PD預苯酸脫水酶PTPD缺陷型5例2：在賴氨酸的發(fā)酵育種上，對育出的解除了賴氨酸反饋調(diào)節(jié)的突變株，通過增加丙氨酸營養(yǎng)缺陷等遺傳標記，提高產(chǎn)量。6葡萄糖丙酮酸丙氨酸天冬氨酸天冬氨酸半醛蘇氨酸二氫吡啶二羧酸賴氨酸亮氨酸協(xié)同反饋抑制L-氨基酸α-酮酸AB乳糖發(fā)酵短桿菌中賴氨酸,丙氨酸的生物合成途徑及其調(diào)節(jié)A：L-氨基酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶B：天冬氨酸-β-脫羧酶反饋阻遏反饋抑制抗S-（2-氨乙基）-L-半胱氨酸丙氨酸缺陷型7（2）目的產(chǎn)物的生物合成從別的終產(chǎn)物（氨基酸等）開始時（即別的終產(chǎn)物是目的產(chǎn)物生物合成的前體），除設法解除目的產(chǎn)物自身合成的反饋調(diào)節(jié)外，也應該設法解除其前體物合成的調(diào)節(jié)。8葡萄糖天冬氨酸天冬氨酸半醛高絲氨酸蘇氨酸α-酮丁酸異亮氨酸賴氨酸蛋氨酸高絲氨酸脫氫酶抗蘇氨酸結(jié)構(gòu)類似物2-氨基-3-羥基戊酸（AHVr）突變株

10葡萄糖磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰CoA乙酸乙酰磷酸檸檬酸順烏頭酸異檸檬酸草酰乙酸蘋果酸反丁烯二酸琥珀酸a-酮戊二酸乙醛酸乙酰CoAL-谷氨酸①②③④⑤⑥⑦⑧黃色短桿菌由葡萄糖和乙酸合成谷氨酸的代謝途徑磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶②②磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶12有報道將具有結(jié)構(gòu)類似物抗性的E.coliK12菌株中Thr操縱子與pBR322質(zhì)粒相結(jié)合，獲得重組質(zhì)粒再轉(zhuǎn)移給適當?shù)氖荏w菌，由于基因擴增，此基因工程菌可產(chǎn)蘇氨酸達55g/L，比原株提高3～4倍。14一個細胞在代謝調(diào)節(jié)中產(chǎn)生阻遏物的量僅滿足于和操縱基因結(jié)合，如果細胞中含有很多的操縱基因和結(jié)構(gòu)基因，那么一個調(diào)節(jié)基因所產(chǎn)生的阻遏物就不足以阻遏全部操縱子的活力，因而逃避了調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的阻遏作用，稱為“逃避合成”，這是最直接的提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量的方法之一。15例如，β-半乳糖苷酶、青霉素酶、氯霉素轉(zhuǎn)酰酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶，可借助含有相應結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移給受體培養(yǎng)物來增加產(chǎn)量；利用含有對苯丙氨酸合成酶編碼的結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)導噬菌體可使該酶產(chǎn)量增加15倍。16小結(jié)：

增加前體物合成的途徑：切斷分支代謝途徑解除前體物的反饋調(diào)節(jié)增強分支點代謝流增加關鍵酶的表達17五、特殊調(diào)節(jié)機制的利用1.多種產(chǎn)物控制機制的利用2.平衡合成的利用3.代謝互鎖的利用4.優(yōu)先合成的變換18天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酰半醛二氫吡啶二羧酸賴氨酸高絲氨酸O-乙酰高絲氨酸蛋氨酸O-磷酸高絲氨酸蘇氨酸異亮氨酸天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶高絲氨酸激酶黃色短桿菌賴氨酸的合成調(diào)節(jié)TDHT反饋控制高絲氨酸脫氫酶缺陷高絲氨酸激酶缺陷202.平衡合成的利用ABCDEFGab底物A經(jīng)分支合成途徑生成E和G，由于a酶的活性大于b酶，結(jié)果優(yōu)先合成E。E過量后就抑制a酶，使代謝轉(zhuǎn)向G。G過量后就會拮抗或逆轉(zhuǎn)E的反饋抑制作用，結(jié)果使代謝流轉(zhuǎn)向合成E，如此循環(huán)不已。21舉例：磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸乙酰CoA檸檬酸草酰乙酸天冬氨酸黃色短桿菌中天冬氨酸與乙酰CoA的平衡合成反饋抑制逆轉(zhuǎn)反饋抑制喪失檸檬酸合成酶的突變株23所謂代謝互鎖（metabolicinterlock），就是從生物合成途徑來看，似乎是受一種完全無關的終產(chǎn)物的控制，它只是在較高濃度下才發(fā)生，而且這種抑制（阻遏）作用是部分性的，不完全的。3.代謝互鎖的利用24例：黃色短桿菌賴氨酸的合成調(diào)節(jié)天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酰半醛二氫吡啶二羧酸賴氨酸高絲氨酸蛋氨酸蘇氨酸異亮氨酸乳糖發(fā)酵短桿菌賴氨酸及亮氨酸的生物合成天冬氨酸激酶二氫吡啶二羧酸合成酶亮氨酸反饋抑制反饋阻遏抗AEC+leu-26代謝互鎖不僅具有抑制與阻遏作用，還發(fā)現(xiàn)具有激活作用。如：枯草芽孢桿菌色氨酸的生物合成途徑中，氨茴酸合成酶的活性被組氨酸激活，使用枯草芽孢桿菌的抗5-氟色氨酸突變株生產(chǎn)色氨酸時，通過添加組氨酸使色氨酸產(chǎn)量由2g/L提高到3.4g/L。274.優(yōu)先合成（preferencesynthesis）的變換底物A經(jīng)過分支途徑生成兩種終產(chǎn)物E和G，由于a酶的活性遠大于b酶的活性，結(jié)果優(yōu)先合成E；E升高到一定濃度，抑制a酶，使代謝轉(zhuǎn)向合成G，G量增加后抑制c的活性。ABCDEFGabc28天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酰半醛二氫吡啶二羧酸賴氨酸高絲氨酸O-乙酰高絲氨酸蛋氨酸O-磷酸高絲氨酸蘇氨酸異亮氨酸天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶高絲氨酸激酶黃色短桿菌賴氨酸的合成調(diào)節(jié)TD反饋控制加過量蛋氨酸5g/L突變活性降低1/320g/L30六、條件突變株的應用像溫度敏感性突變、鏈霉素依賴性突變和低溫敏感性突變等，因環(huán)境條件的不同能顯示突變型特性的改變，稱為條件致死突變（conditionallethalmutation）。主要是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變。31溫度敏感性突變很多微生物可以在20℃-50℃溫度范圍內(nèi)生長。通過誘變可以得到在低溫下生長，而在高溫下卻不能生長繁殖的突變株，這樣的突變即是溫度敏感型突變。32溫度敏感型突變的位置常發(fā)生在酶的結(jié)構(gòu)基因上，致使一個氨基酸被另一個氨基酸代替。溫度敏感突變株高溫下酶失活，因而不能生長。改變溫度，酶活性在0～100％之間變化，但是難以恢復到100％野生型活性。33如果該酶是蛋白質(zhì)，維生素或核苷酸生物合成途徑上的酶，則該突變株高溫下就是一種營養(yǎng)缺陷型。例：如果突變位置發(fā)生在為亮氨酸合成酶系編碼的基因中，使翻譯出來的酶對溫度敏感，則高溫時就不能合成亮氨酸，即成為亮氨酸缺陷型。34例如：由谷氨酸產(chǎn)生菌乳糖發(fā)酵短桿菌經(jīng)誘變處理得到溫度敏感變異株Ts88，30℃培養(yǎng)時能正常生長，40℃時死亡,但能在富含生物素的培養(yǎng)基中積累谷氨酸(而野生型卻受生物素的反饋抑制).

在富含生物素的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵時:

先在30℃(允許條件)中進行培養(yǎng)以得到大量菌細胞,適