膳食纖維的測(cè)定

“粗纖維”一詞最早用于營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究，并被認(rèn)為是對(duì)人體不起營(yíng)養(yǎng)作用的一種非營(yíng)養(yǎng)成分。然而近年來(lái)分析技術(shù)的發(fā)展和對(duì)這種“非營(yíng)養(yǎng)素”認(rèn)識(shí)的提高，“粗纖維”也被“膳食纖維”所替代，而且賦予更豐富的內(nèi)容。膳食纖維大致分為二類，一類為可溶性的，一類為不可溶性的，二者合并即為總的膳食纖維。它主要包括植物細(xì)胞壁的成分如纖維素、半纖維素、果膠、木質(zhì)素、角質(zhì)和二氧化硅等成分，最早曾有中型洗滌劑法和酸性洗滌劑法等，測(cè)定結(jié)果常不能包括全部。本章所介紹的Englist建立的、AOAC推薦的方法。它主要測(cè)定為可溶性的膳食纖維、不可溶性膳食纖維和總膳食纖維三種。膳食纖維實(shí)際上屬于碳水化合物的范疇。膳食纖維的物化特性主要包括5個(gè)方面：（1）很高的持水力。（2）對(duì)陽(yáng)離子有結(jié)合和交換能力。（3）對(duì)有機(jī)化合物有吸附螯合作用。（4）具有類似填充劑的充盈作用。（5）可改變腸道系統(tǒng)中的微生物群系組成。膳食纖維的測(cè)定方法主要有三種，包括非酶一重量法、酶重量法和酶化學(xué)法。非酶重量法是一個(gè)比較古老的方法，只能用于粗纖維的測(cè)定。而中性洗滌劑法也只能測(cè)定不溶性的膳食纖維。酶重量法卻可以測(cè)定總膳食纖維（包括可溶和不可溶性膳食纖維），也是AOAC的標(biāo)準(zhǔn)方法。酶化學(xué)法是AOAC最新承認(rèn)的另一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法，但此法易受儀器條件的限制，不適用于普通實(shí)驗(yàn)室。目前國(guó)標(biāo)采用的還是中性洗滌劑法，食物成分表中列出的數(shù)據(jù)都是不溶性膳食纖維，所以下文先介紹不溶性膳食纖維的測(cè)定方法。（一）中性洗滌劑法原理在中性洗滌劑的消化作用下，樣品中的糖、淀粉、蛋白質(zhì)、果膠等物質(zhì)被溶解除去，不能消化的殘?jiān)鼮椴蝗苄陨攀忱w維，主要包括纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、角質(zhì)和二氧化硅等，并包括不溶性灰分。適用范圍GB12394-90適用于各類植物性食物和含有植物性食物的混合食物中不溶性膳食纖維的測(cè)定。儀器（1）烘箱：110?130°C。恒溫箱：(37±2)°C。纖維測(cè)定儀。如沒(méi)有纖維測(cè)定儀，可由下列部件組成：電熱板：帶控溫裝置。高型無(wú)嘴燒杯：600mL。玻料坩蝸：容量50mL,孔徑40?60^m?；亓骼淠b置。抽濾裝置：由抽濾瓶、抽濾墊及水泵組成。試劑實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水，試劑不加說(shuō)明均為分析純?cè)噭?。無(wú)水亞硫酸鈉。石油醚：沸程30?60C。丙酮。甲苯。中性洗滌劑溶液：將18.61gEDTA二鈉鹽和6.81g+水合四硼酸鈉置于燒杯中，加水約150mL,加熱使之溶解，將30g月桂基硫酸鈉和10mL乙二醇獨(dú)乙醚溶于約700mL熱水中，合并上述兩液，再將4.56g無(wú)水磷酸氫二鈉溶于150mL熱水中，再并入上述溶液中，用磷酸調(diào)節(jié)上述混合液至pH6.9?7.1，最后加水至1000mL。磷酸鹽緩沖液：由38.7mL0.1mol/L磷酸氫二鈉和61.3mL0.1mol/L磷酸二氫鈉混合而成，pH為7。2.5%a—淀粉酶溶液：稱取2.5ga—淀粉酶(Sigma公司，VI-A型，產(chǎn)品號(hào)6880)溶于100mLpH7的磷酸鹽緩沖溶液中，離心，過(guò)濾，濾過(guò)的酶液備用。耐熱玻璃棉：耐熱130C，美國(guó)Corning玻璃廠出品，PYREX牌。操作步驟樣品制備：糧食：磨粉，過(guò)20目篩(1mm)，貯于塑料瓶?jī)?nèi)，蓋緊瓶塞保存，備用。蔬菜及其他植物性食物：取其可食部，用水洗凈，紗布吸去水分，打碎，沸合均勻后備用。脂肪含量超過(guò)10%樣品：需先去除脂肪，即樣品1.00g，用石油醚提取3次，每次10mL。取樣0.5?1.0g,力口100mL中性洗滌劑溶液，再加0.5g無(wú)水硫酸鈉。電爐加熱，5min內(nèi)使其煮沸，移至電熱板上，保持微沸1h。于玻料坩蝸中鋪1g玻璃棉，移至烘箱中，110°C4h，取出置干燥器中，晾至室溫，萬(wàn)分之一天平稱重，得m1。將煮沸后樣品趁熱倒入濾器，用水泵抽濾。用600mL熱水(90?100C)，分?jǐn)?shù)次洗燒杯及濾器，抽干。洗凈濾器下部的液體和泡沫，塞上橡皮塞。于濾器中加酶液，液面需覆蓋纖維，用細(xì)針擠壓掉其中氣泡，加幾滴甲苯，蓋上表玻皿，37C恒溫箱中過(guò)夜。取出濾器，除去底部塞子，抽去酶液，并用300mL熱水分?jǐn)?shù)次洗去殘留酶液，用碘液檢查，如有殘留，繼續(xù)加酶水解，如淀粉已除盡，抽干，再以丙酮洗2次。將濾器置烘箱中，110C4h，取出，置干燥器中，晾至室溫，精確稱重，得m2。計(jì)算式中3——樣品中不溶性膳食纖維的含量，％；m1——濾器加玻璃棉的質(zhì)量，g；m2——濾器加玻璃棉及樣品中纖維的質(zhì)量，g；m——樣品質(zhì)量，g。注意事項(xiàng)因酶配成溶液后其活力會(huì)隨時(shí)間延長(zhǎng)而下降，從而影響酶解效力，所以酶溶液需當(dāng)天現(xiàn)配。過(guò)濾時(shí)若遇到操作困難，可采取滴加淀粉酶和將樣品稱重減少至0.3g的方法來(lái)加快過(guò)濾。每次實(shí)驗(yàn)用完的坩蝸去除玻璃棉，若玻板上殘?jiān)^多，可用重鉻酸鉀洗液浸泡數(shù)小時(shí)后取出，用水沖洗干凈以備下次實(shí)驗(yàn)使用。(二)酶一重量法1.原理樣品分別用a-淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶進(jìn)行酶解消化以去除蛋白質(zhì)和可消化的淀粉。總膳食纖維(TDF)是先酶解，然后用乙醇沉淀，再將沉淀物過(guò)濾，將TDF殘?jiān)靡掖己捅獩_洗，干燥稱重。不溶性和可溶性膳食纖維(IDF和SDF)是酶解后將IDF過(guò)濾，過(guò)濾后的殘?jiān)脽崴疀_洗，經(jīng)干燥后稱重。SDF是將上述濾出液用4倍量的95%乙醇沉淀，然后再過(guò)濾，干燥，稱重。TDF、IDF和SDF量通過(guò)蛋白質(zhì)、灰分含量進(jìn)行校正。適用范圍本方法適用于各類植物性食物和保健食品(AOAC991.43)。儀器燒杯：400mL或600mL高腳型。過(guò)濾用坩蝸:玻料濾板，美國(guó)試驗(yàn)和材料學(xué)會(huì)(ASTM)40?60^m，Pyrex60mL(CorningNo.36060buchner，或同等的)。如下處理：在灰化爐525°C灰化過(guò)夜。爐溫降至130°C以下取出坩蝸。用真空裝置移出硅藻土和灰質(zhì)。室溫下用2%清洗溶液浸泡1h。用水和去離子水沖洗坩蝸；然后用15mL丙酮沖洗然后風(fēng)干。在干燥的坩蝸中加0.5g硅藻土，在130C烘干恒重。在干燥器中冷卻1h，記錄坩蝸加硅藻土質(zhì)量，精確至0.1mg。真空裝置：真空泵或抽氣機(jī)作為控制裝置。1L的厚壁抽濾瓶。與抽濾瓶相配套的桷皮圈。振蕩水浴箱：自動(dòng)控溫使溫度能保持在(98±2)C。恒溫控制在60Co天平：分析級(jí)，精確到±0.1mg。馬福爐：溫度控制在(525±5)C。干燥箱：溫度控制在105C和(130±3)C。干燥器：用二氧化硅或同等的干燥劑。干燥劑兩周一次在130C烘干過(guò)夜。pH計(jì)：注意溫控，用pH4.0、7.0和10.0緩沖液標(biāo)化。移液管及套頭：容量100RL和5mLo分配器或量筒：①(15±0.5)mL，供分配78%的乙醇、95%的乙醇以及丙酮。②(40±0.5)mL，供分配緩沖液。(12)磁力攪拌器和攪拌棒。試劑全過(guò)程使用去離子水，試劑不加說(shuō)明均為分析純度劑。乙醇溶液：85%:加895mL95%乙醇在1L量筒中，用水稀釋至刻度。78%:加821mL95%乙醇在1L量筒中，用水稀釋至刻度。丙酮。供分析用酶：在0?5°C下貯存。熱穩(wěn)定a-淀粉酶溶液：Cat.No.A3306，SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO63178，或Termamyl300L，Cat.No.361—6282，Novo—Nordisk，Bagsvaerd，Denmark，或等效的酶。蛋白酶：Cat.No.P3910，SigmaChemicalCo.，或等效的。當(dāng)天用MES/TRIS緩沖液中現(xiàn)配50mg/mL酶溶液。淀粉葡糖苷酶溶液：Cat.No.AMGA9913，SigmaChemicalCo.，或等效的。硅藻土：酸洗(Celite545AW，No.C8656，SigmaChemicalCo.，或等效的)。洗滌液：兩者挑一。鉻酸：120g重鉻酸鈉Na2Cr2O7-2H2O，1000mL蒸餾水和1600mL濃硫酸。實(shí)驗(yàn)室用液體清潔劑，預(yù)備急需清洗的(Micro,InternationalProductsCorp.，Trenton，NJ08016，或等效的)。用水配制2%溶液。MES—TRIS緩沖液：0.05mol/L，溫度在24C時(shí)pH為8.2。MES：2—(N-嗎啉代)磺酸基乙烷(No.M—8250，SingmaChemicalCo.或等效的)。TRIS：三羥(羥甲基)氨基甲烷(No.T—1503，SigmaChemicalCo.或等效的)。在1.7L的蒸餾水中溶解19.52gMES和12.2gTRIS，用6mol/LNaOH調(diào)pH到8.2，用水定容至2L［注意：24C時(shí)的pH為8.2，但是，如果緩沖液溫度在20C，pH就為8.3，如果溫度在28C，pH為8.1。為了使溫度在20?28C之間，需根據(jù)溫度調(diào)整pH］。HCl溶液：0.561mol/L，加93.5mL6mol/L鹽酸到700mL水中，用水定容1L。操作方法(1)樣品制備：①固體樣品：如果樣品粒度〉0.5mm，研磨后過(guò)0.3?0.5mm(40?60目)篩。高脂肪樣品：如果脂肪含量＞10%，用石油醚去脂。每克樣品用25mL，每次提取完靜置一會(huì)兒再小心將燒杯傾斜，慢慢將石油醚倒出，共洗3次。高碳水化合物樣品：如果樣品干重含糖〉50%，用85%乙醇去除糖分，每克樣品每次10mL，共洗3次輕輕倒出，然后在40°C烘箱中不時(shí)翻攪干燥過(guò)夜，并研磨過(guò)0.5mm篩。樣品消化：準(zhǔn)確稱取雙份(1.000±0.005)g樣品(ml和m2)，置于高腳燒杯中。在每個(gè)燒杯中加入40mLMES-TRIS緩沖液，在磁力攪拌器上攪拌直到樣品完全分散［注意：防止團(tuán)塊形成，使受試物與酶能充分接觸］。用熱穩(wěn)定的淀粉酶進(jìn)行酶解處理：加100RL熱穩(wěn)定的淀粉酶溶液，低速攪拌。用鋁箔片將燒杯蓋住，在95?100C水浴中反應(yīng)30min［注意：起始的水浴溫度應(yīng)達(dá)到95C］。冷卻：所有燒杯從水浴中移出，晾至60C。打開鋁箔蓋，用刮勺將燒杯邊緣的網(wǎng)狀物以及燒杯底部的膠狀物刮離，以使樣品能夠完全的酶解。用10mL蒸餾水沖洗燒杯壁和刮勺。用蛋白酶進(jìn)行酶解處理：在每個(gè)燒杯中各加入10皿蛋白酶溶液。用鋁箔蓋住，在60C持續(xù)搖動(dòng)反應(yīng)30min［注意：開始時(shí)的水浴溫度應(yīng)達(dá)60C］，使之充分反應(yīng)。pH測(cè)定：30min后，打開鋁箔蓋，攪拌中加入5mL0.561mol/LHCl至燒杯中。60C時(shí)用溶液或1mol/LHCl溶液調(diào)最終pH為4.0?4.7［注意：當(dāng)溶液為60C時(shí)檢測(cè)和調(diào)整pH，因?yàn)樵谳^低溫度時(shí)pH會(huì)偏高］。用淀粉葡糖苷酶溶液酶解處理：攪拌同時(shí)加100皿淀粉葡糖苷酶溶液。用鋁箔蓋住，在60C持續(xù)振搖反應(yīng)30min，溫度應(yīng)恒定在60C。測(cè)定：總的膳食纖維測(cè)定：用乙醇沉淀膳食纖維：在每份樣品中，加入預(yù)熱至60C的95%乙醇225mL，乙醇與樣品的體積比為4:1。室溫下沉淀1h。過(guò)濾裝置：用15mL78%乙醇將硅藻土濕潤(rùn)和重新分布在已稱重的坩蝸中。用適度的抽力把坩蝸中的硅藻土吸到玻板上。酶解過(guò)濾，用78%乙醇和刮勺移所有內(nèi)容物微粒到坩蝸中［注意：如果一些樣品形成膠質(zhì)，用刮勺破壞表面，以加速過(guò)濾］。抽真空，分別用15mL的78%乙醇，95%乙醇和丙酮沖洗殘?jiān)?次，將坩蝸內(nèi)的殘?jiān)楦珊笤?05C烘干過(guò)夜。將坩蝸置干燥器中冷卻至室溫。坩蝸重量，包括膳食纖維殘?jiān)凸柙逋粒_稱至0.1mg。減去坩蝸和硅藻土的干重，計(jì)算殘?jiān)?。蛋白質(zhì)和灰分的測(cè)定：取成對(duì)的樣品中的一份測(cè)定蛋白質(zhì)，用本書前述或GB-960.52方法測(cè)定。用（Nx6.25作為蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)換系數(shù)）。分析灰分時(shí)用平行樣的第二份在525°C灼燒5h,在干燥器中冷卻，精確稱至0.1mg,減去坩蝸和硅藻土的質(zhì)量，即為灰分質(zhì)量。不溶性膳食纖維測(cè)定：稱適量樣品按②進(jìn)行酶解，過(guò)濾前用3mL水濕潤(rùn)和重新分布硅藻土在預(yù)先處理好的坩蝸上，保持抽氣使坩蝸中的硅藻土抽成均勻的一層。過(guò)濾并沖洗燒杯，用10mL70C水洗殘?jiān)?次，然后再過(guò)濾并用水洗，轉(zhuǎn)移到600mL高腳燒杯，保留用以測(cè)定可溶性膳食纖維，按④操作。用抽濾裝置，分別用15mL78%乙醇，95%乙醇和丙酮各沖洗殘?jiān)?次。［注意：應(yīng)及時(shí)用78%乙醇、95%乙醇和丙酮沖洗殘?jiān)駝t可造成不溶性膳食纖維數(shù)值的增大］按②用雙份樣品測(cè)定蛋白質(zhì)和灰