高中生物-基因工程課件

§1-1

DNA重組技術(shù)的基本工具和基本操作程序?qū)ｎ}1基因工程1§1-1DNA重組技術(shù)的基本工具和基本操作程序?qū)ｎ}1一基因工程的基本內(nèi)容主要內(nèi)容（一）基因工程的概念（二）基因工程的基本工具（三）基因工程的基本操作程序（四）基因工程的應(yīng)用2一基因工程的基本內(nèi)容主要內(nèi)容（一）基因工程的概念2基因工程的概念

基因工程又叫基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。該技術(shù)是在生物體外，通過對DNA分子進行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細胞內(nèi)進行無性繁殖，使重組基因在受體細胞內(nèi)表達，產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物。復(fù)習(xí)3基因工程的概念基因工程又叫基因拼接技術(shù)或DN基因工程的別名操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程結(jié)果基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平人類需要的基因產(chǎn)物剪切→拼接→導(dǎo)入→表達實質(zhì)基因重組復(fù)習(xí)4基因工程的別名操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程結(jié)果基因拼接技基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因與運載體DNA拼接導(dǎo)入棉花細胞(含抗蟲基因)棉花植株(有抗蟲特性)復(fù)習(xí)5基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金芽基因工程的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與運載體DNA連接關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因?qū)胧荏w(棉花)細胞復(fù)習(xí)6基因工程的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞解決基因工程關(guān)鍵步驟需要的工具關(guān)鍵步驟一的工具：關(guān)鍵步驟二的工具：關(guān)鍵步驟三的工具：限制性內(nèi)切酶DNA連接酶運載體復(fù)習(xí)7解決基因工程關(guān)鍵步驟需要的工具關(guān)鍵步驟一的工具：限制性內(nèi)切酶88基因的剪刀——限制性內(nèi)切酶（簡稱限制酶）

限制酶是在生物體(主要是微生物)內(nèi)的一種酶，能將外來的DNA切斷，由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進行的，故名限制性內(nèi)切酶。特點：特異性。即一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點上切割DNA分子。復(fù)習(xí)9基因的剪刀——限制性內(nèi)切酶（簡稱限制酶）限制酶是在識別序列大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成。也有少數(shù)限制酶識別序列由4、5、或8個核苷酸組成。迄今為止，有300多種微生物中分離出4000種限制酶10識別序列大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成。迄今為止，有

大腸桿菌(E.coli)的一種限制酶能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。限制酶11大腸桿菌(E.coli)的一種限制酶能識別G限制酶12限制酶12

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。13被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個平末端14平末端14要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產(chǎn)生幾個黏性末端？提問要切兩個切口，產(chǎn)生四個黏性末端。如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？

會產(chǎn)生相同的黏性末端，然后讓兩者的黏性末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。15要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產(chǎn)生幾2、基因的針線——DNA連接酶

DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，即把梯子兩邊扶手的斷口連接起來，這樣一個重組的DNA分子就形成了。162、基因的針線——DNA連接酶DNA連接酶可E.coliDNA連接酶從大腸桿菌中分離得到的。只能用于粘性末端的連接T4DNA連接酶從T4噬菌體中分離得到的。既能用于粘性末端的連接，又能用于平末端的連接，但是平末端的連接效率低。17E.coliDNA連接酶從大腸桿菌中分離得到的。只能用于粘性為什么要用運載體？1、直接將目的基因連接到受體細胞的DNA上不能表達。2、只有利用某種能夠侵染受體細胞，并且在受體細胞中能夠復(fù)制和表達的載體來用于表達。18為什么要用運載體？1、直接將目的基因連接到受體細胞的DNA上作為運載體必須具備哪些條件1）能夠在宿主細胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。2）具多個限制酶切點，以便與外源基因連接。3）具有某些標記基因，便于進行篩選。如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等。19作為運載體必須具備哪些條件1）能夠在宿主細胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保常用的運載體主要有兩類：1）細菌細胞質(zhì)的質(zhì)粒2）噬菌體或某些動植物病毒20常用的運載體主要有兩類：1）細菌細胞質(zhì)的質(zhì)粒20質(zhì)粒：

質(zhì)粒是染色體外能夠進行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細胞器和細菌細胞中核區(qū)外的DNA分子?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來專指細菌、酵母菌和放線菌等生物中核以外的DNA分子。

質(zhì)粒是基因工程最常用的運載體。絕大多數(shù)細菌質(zhì)粒都是閉合環(huán)狀DNA分子。有的一個細菌中有一個，有的一個細菌中有多個。21質(zhì)粒：質(zhì)粒是染色體外能夠進行自主復(fù)制的遺傳單大腸桿菌的質(zhì)粒：

最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒，其中常含有抗藥基因，如四環(huán)素的標記基因。質(zhì)粒的存在與否對宿主細胞生存沒有決定性作用，但復(fù)制只能在宿主細胞內(nèi)成。22大腸桿菌的質(zhì)粒：最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒原核細胞的基因結(jié)構(gòu)(補充內(nèi)容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子①不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì),連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細胞的基因結(jié)構(gòu)②調(diào)控遺傳信息表達,上游有啟動子，下游有終止子23原核細胞的基因結(jié)構(gòu)(補充內(nèi)容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上真核細胞的基因結(jié)構(gòu)（補充內(nèi)容）編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點內(nèi)含子外顯子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有啟動子，下游有終止子非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子24真核細胞的基因結(jié)構(gòu)（補充內(nèi)容）編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)比較連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼25原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是編碼區(qū)是間隔的、_____的都四個基本步驟：三、基因工程的基本操作程序1）提取目的基因2）目的基因與運載體結(jié)合3）將目的基因?qū)胧荏w細胞4）目的基因的檢測和表達26四個基本步驟：三、基因工程的基本操作程序1）提取目的基因26目的基因

目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因。

如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗病（抗病毒、抗細菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。供體生物細胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因限制酶27目的基因目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因1、目的基因的獲取1〉目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因請舉出三個以上的例子2〉獲取目的基因的常用方法（1）從基因文庫中獲取（2）利用PCR技術(shù)擴增（3）人工合成281、目的基因的獲取1〉目的基因主要是指___________概念：基因文庫（genelibrary）基因組文庫部分基因文庫（如cDNA文庫）

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(genelibrary)29概念：基因文庫基因組文庫部分基因文庫（如cDNA文庫）基因組文庫:

基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫.部分基因文庫:

基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫.30基因組文庫:30基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系31基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系31cDNA文庫的構(gòu)建mRNA

反轉(zhuǎn)錄cDNA(互補DNA）

DNA聚合酶雙鏈DNA②反轉(zhuǎn)錄法：基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA32cDNA文庫的構(gòu)建mRNA②反轉(zhuǎn)錄法：基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRN基因組DNA文庫cDNA文庫基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較33基因組DNA文庫cDNA文庫基因組DNA文庫與cDNA文庫的如何從基因文庫中得到所需要的基因？依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA

基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。34如何從基因文庫中得到所需要的基因？依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。④利用PCR技術(shù)擴增目的基因PCR——聚合酶鏈式反應(yīng)是一項生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過此技術(shù)，可獲取大量的目的基因。35④利用PCR技術(shù)擴增目的基因PCR——聚合酶鏈式反應(yīng)35DNA序列自動測序儀：PCR技術(shù)：

對提取出來的基因進行核苷酸序列分析。

使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增。36DNA序列自動測序儀：對提取出來的基因進行核苷酸序列⑤

人工合成——根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學(xué)合成37⑤人工合成——根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA蛋白質(zhì)的氨基3、基因表達載體（重組質(zhì)粒）的構(gòu)建（1）用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。（2）用___________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同1〉過程:383、基因表達載體（重組質(zhì)粒）的構(gòu)建（1）用一定的______2〉基因表達載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標記基因位于基因的首端,是mRNA結(jié)合位點位于基因的末端,終止轉(zhuǎn)錄檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細胞條件392〉基因表達載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動步驟二：目的基因與運載體重組1）用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出黏性末端。

2）用同一種限制酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。

3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒）

目的基因與運載體的結(jié)合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。40步驟二：目的基因與運載體重組1）用一定的限制酶切割質(zhì)質(zhì)粒目的基因限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶表達載體同一種過程:41質(zhì)粒目的基因限制酶處理一個切口兩個切口DNA連接酶表達載體同2、基因表達載體的作用a、使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代b、同時使目的基因能表達和發(fā)揮作用思考：作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？422、基因表達載體的作用a、使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并遺目的基因與運載體結(jié)合43目的基因與運載體結(jié)合43常用的受體細胞：

有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞等。將目的基因?qū)胧荏w細胞的原理借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。步驟三：目的基因?qū)胧荏w細胞44常用的受體細胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)1）將細菌用CaCl2處理，以增大細菌細胞壁的通透性。

2）使含有目的基因的重組質(zhì)粒進入受體細胞。

3）目的基因在受體細胞內(nèi)，隨其繁殖而復(fù)制，由于細菌繁殖的速度非常快，在很短的時間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。451）將細菌用CaCl2處理，以增大細菌細胞壁的通透性1、將目的基因?qū)胫参锛毎?）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點:能感染雙子葉植物和祼子植物,對單子葉植物無感染能力Ti質(zhì)粒的T—DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞并整合到其染色體上轉(zhuǎn)化過程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達載體導(dǎo)入植物細胞插入植物細胞染色DNA表達新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌461、將目的基因?qū)胫参锛毎?）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點:能感染雙子（2）基因槍法

基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。47（2）基因槍法基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用（3）花粉通道法

植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。48（3）花粉通道法植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉2、將目的基因?qū)雱游锛毎椒?顯微注射技術(shù)操作程序:提純含目的基因表達載體取受精卵顯微注射移植到子宮受精卵發(fā)育新性狀動物492、將目的基因?qū)雱游锛毎椒?顯微注射技術(shù)操作程序:提純含3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎Ｓ梅ǎ篊a2+處理常用菌：大腸桿菌微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA503、將目的基因?qū)胛⑸锛毎Ｓ梅ǎ篊a2+處理常用菌：大腸步驟四：目的基因的檢測和表達四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素抗性基因51步驟四：目的基因的檢測和表達四環(huán)素氨芐青霉51(四)目的基因的檢測與鑒定檢測①導(dǎo)入檢測：目的基因是否導(dǎo)入受體細胞方法——DNA分子雜交②表達檢測轉(zhuǎn)錄檢測——分子雜交翻譯檢測——抗原抗體雜交分子檢測法鑒定抗蟲鑒定抗病鑒定活性鑒定等個體水平的鑒定52(四)目的基因的檢測與鑒定檢測①導(dǎo)入檢測：目的基因是否導(dǎo)入受

不能，受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達。受體細胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達嗎？若不能表達，要對抗蟲基因再進行修飾。53不能，受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明知識延伸——DNA分子雜交技術(shù)

該方法是根據(jù)堿基互補配對原則，把互補的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進行標記，之后同被檢測的DNA中的同源互補序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。54知識延伸——DNA分子雜交技術(shù)該方法是根據(jù)返回55返回55DNA附著在膜上硝化纖維素加探針報告基因（含熒光素分子）變性DNA雜交（如檢測SARS病毒等）abcd56DNA附著在膜上硝化纖維素加探針報告基因（含熒光素分子）變性復(fù)習(xí)題1）將目的基因?qū)胧荏w細胞有哪些方法?(試舉例說明)2）簡述農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法57復(fù)習(xí)題1）將目的基因?qū)胧荏w細胞有哪些方法?(試舉例說明)2非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點外顯子內(nèi)含子終止子基因的結(jié)構(gòu)啟動子原核真核58非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶結(jié)合位點外顯子內(nèi)含子終止子1）以下說法正確的是（）

A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列

B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體

C、運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接

D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來C練習(xí)591）以下說法正確的是2）不屬于質(zhì)粒被選為基因運載體的理由是

A、能復(fù)制（）

B、有多個限制酶切點

C、具有標記基因

D、它是環(huán)狀DNAD練習(xí)602）不屬于質(zhì)粒被選為基因運載體的理由是D練習(xí)603）有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是（）

A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來

B、限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得

C、目的基因須由運載體導(dǎo)入受體細胞

D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶A練習(xí)613）有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是（）A練習(xí)614）有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）

A、限制酶只在獲得目的基因時才用

B、重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成

C、質(zhì)粒都可作為運載體

D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料D練習(xí)624）有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）D練習(xí)65）基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是（）

A、人工合成目的基因

B、目的基因與運載體結(jié)合

C、將目的基因?qū)胧荏w細胞

D、目的基因的檢測和表達C練習(xí)635）基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的。在基因操作的§1-1

DNA重組技術(shù)的基本工具和基本操作程序?qū)ｎ}1基因工程64§1-1DNA重組技術(shù)的基本工具和基本操作程序?qū)ｎ}1一基因工程的基本內(nèi)容主要內(nèi)容（一）基因工程的概念（二）基因工程的基本工具（三）基因工程的基本操作程序（四）基因工程的應(yīng)用65一基因工程的基本內(nèi)容主要內(nèi)容（一）基因工程的概念2基因工程的概念

基因工程又叫基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。該技術(shù)是在生物體外，通過對DNA分子進行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細胞內(nèi)進行無性繁殖，使重組基因在受體細胞內(nèi)表達，產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物。復(fù)習(xí)66基因工程的概念基因工程又叫基因拼接技術(shù)或DN基因工程的別名操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程結(jié)果基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平人類需要的基因產(chǎn)物剪切→拼接→導(dǎo)入→表達實質(zhì)基因重組復(fù)習(xí)67基因工程的別名操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程結(jié)果基因拼接技基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因與運載體DNA拼接導(dǎo)入棉花細胞(含抗蟲基因)棉花植株(有抗蟲特性)復(fù)習(xí)68基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金芽基因工程的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與運載體DNA連接關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因?qū)胧荏w(棉花)細胞復(fù)習(xí)69基因工程的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞解決基因工程關(guān)鍵步驟需要的工具關(guān)鍵步驟一的工具：關(guān)鍵步驟二的工具：關(guān)鍵步驟三的工具：限制性內(nèi)切酶DNA連接酶運載體復(fù)習(xí)70解決基因工程關(guān)鍵步驟需要的工具關(guān)鍵步驟一的工具：限制性內(nèi)切酶718基因的剪刀——限制性內(nèi)切酶（簡稱限制酶）

限制酶是在生物體(主要是微生物)內(nèi)的一種酶，能將外來的DNA切斷，由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進行的，故名限制性內(nèi)切酶。特點：特異性。即一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點上切割DNA分子。復(fù)習(xí)72基因的剪刀——限制性內(nèi)切酶（簡稱限制酶）限制酶是在識別序列大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成。也有少數(shù)限制酶識別序列由4、5、或8個核苷酸組成。迄今為止，有300多種微生物中分離出4000種限制酶73識別序列大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成。迄今為止，有

大腸桿菌(E.coli)的一種限制酶能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。限制酶74大腸桿菌(E.coli)的一種限制酶能識別G限制酶75限制酶12

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。76被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個平末端77平末端14要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產(chǎn)生幾個黏性末端？提問要切兩個切口，產(chǎn)生四個黏性末端。如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？

會產(chǎn)生相同的黏性末端，然后讓兩者的黏性末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。78要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產(chǎn)生幾2、基因的針線——DNA連接酶

DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，即把梯子兩邊扶手的斷口連接起來，這樣一個重組的DNA分子就形成了。792、基因的針線——DNA連接酶DNA連接酶可E.coliDNA連接酶從大腸桿菌中分離得到的。只能用于粘性末端的連接T4DNA連接酶從T4噬菌體中分離得到的。既能用于粘性末端的連接，又能用于平末端的連接，但是平末端的連接效率低。80E.coliDNA連接酶從大腸桿菌中分離得到的。只能用于粘性為什么要用運載體？1、直接將目的基因連接到受體細胞的DNA上不能表達。2、只有利用某種能夠侵染受體細胞，并且在受體細胞中能夠復(fù)制和表達的載體來用于表達。81為什么要用運載體？1、直接將目的基因連接到受體細胞的DNA上作為運載體必須具備哪些條件1）能夠在宿主細胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。2）具多個限制酶切點，以便與外源基因連接。3）具有某些標記基因，便于進行篩選。如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等。82作為運載體必須具備哪些條件1）能夠在宿主細胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保常用的運載體主要有兩類：1）細菌細胞質(zhì)的質(zhì)粒2）噬菌體或某些動植物病毒83常用的運載體主要有兩類：1）細菌細胞質(zhì)的質(zhì)粒20質(zhì)粒：

質(zhì)粒是染色體外能夠進行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細胞器和細菌細胞中核區(qū)外的DNA分子?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來專指細菌、酵母菌和放線菌等生物中核以外的DNA分子。

質(zhì)粒是基因工程最常用的運載體。絕大多數(shù)細菌質(zhì)粒都是閉合環(huán)狀DNA分子。有的一個細菌中有一個，有的一個細菌中有多個。84質(zhì)粒：質(zhì)粒是染色體外能夠進行自主復(fù)制的遺傳單大腸桿菌的質(zhì)粒：

最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒，其中常含有抗藥基因，如四環(huán)素的標記基因。質(zhì)粒的存在與否對宿主細胞生存沒有決定性作用，但復(fù)制只能在宿主細胞內(nèi)成。85大腸桿菌的質(zhì)粒：最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒原核細胞的基因結(jié)構(gòu)(補充內(nèi)容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子①不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì),連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細胞的基因結(jié)構(gòu)②調(diào)控遺傳信息表達,上游有啟動子，下游有終止子86原核細胞的基因結(jié)構(gòu)(補充內(nèi)容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上真核細胞的基因結(jié)構(gòu)（補充內(nèi)容）編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點內(nèi)含子外顯子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有啟動子，下游有終止子非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子87真核細胞的基因結(jié)構(gòu)（補充內(nèi)容）編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)比較連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼88原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是編碼區(qū)是間隔的、_____的都四個基本步驟：三、基因工程的基本操作程序1）提取目的基因2）目的基因與運載體結(jié)合3）將目的基因?qū)胧荏w細胞4）目的基因的檢測和表達89四個基本步驟：三、基因工程的基本操作程序1）提取目的基因26目的基因

目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因。

如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗?。共《尽⒖辜毦┗?、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。供體生物細胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因限制酶90目的基因目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因1、目的基因的獲取1〉目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因請舉出三個以上的例子2〉獲取目的基因的常用方法（1）從基因文庫中獲?。?）利用PCR技術(shù)擴增（3）人工合成911、目的基因的獲取1〉目的基因主要是指___________概念：基因文庫（genelibrary）基因組文庫部分基因文庫（如cDNA文庫）

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(genelibrary)92概念：基因文庫基因組文庫部分基因文庫（如cDNA文庫）基因組文庫:

基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫.部分基因文庫:

基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫.93基因組文庫:30基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系94基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系31cDNA文庫的構(gòu)建mRNA

反轉(zhuǎn)錄cDNA(互補DNA）

DNA聚合酶雙鏈DNA②反轉(zhuǎn)錄法：基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA95cDNA文庫的構(gòu)建mRNA②反轉(zhuǎn)錄法：基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRN基因組DNA文庫cDNA文庫基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較96基因組DNA文庫cDNA文庫基因組DNA文庫與cDNA文庫的如何從基因文庫中得到所需要的基因？依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA

基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。97如何從基因文庫中得到所需要的基因？依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。④利用PCR技術(shù)擴增目的基因PCR——聚合酶鏈式反應(yīng)是一項生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過此技術(shù)，可獲取大量的目的基因。98④利用PCR技術(shù)擴增目的基因PCR——聚合酶鏈式反應(yīng)35DNA序列自動測序儀：PCR技術(shù)：

對提取出來的基因進行核苷酸序列分析。

使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增。99DNA序列自動測序儀：對提取出來的基因進行核苷酸序列⑤

人工合成——根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學(xué)合成100⑤人工合成——根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA蛋白質(zhì)的氨基3、基因表達載體（重組質(zhì)粒）的構(gòu)建（1）用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。（2）用___________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同1〉過程:1013、基因表達載體（重組質(zhì)粒）的構(gòu)建（1）用一定的______2〉基因表達載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標記基因位于基因的首端,是mRNA結(jié)合位點位于基因的末端,終止轉(zhuǎn)錄檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細胞條件1022〉基因表達載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動步驟二：目的基因與運載體重組1）用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出黏性末端。

2）用同一種限制酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。

3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒）

目的基因與運載體的結(jié)合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。103步驟二：目的基因與運載體重組1）用一定的限制酶切割質(zhì)質(zhì)粒目的基因限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶表達載體同一種過程:104質(zhì)粒目的基因限制酶處理一個切口兩個切口DNA連接酶表達載體同2、基因表達載體的作用a、使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代b、同時使目的基因能表達和發(fā)揮作用思考：作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？1052、基因表達載體的作用a、使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并遺目的基因與運載體結(jié)合106目的基因與運載體結(jié)合43常用的受體細胞：

有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞等。將目的基因?qū)胧荏w細胞的原理借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。步驟三：目的基因?qū)胧荏w細胞107常用的受體細胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)1）將細菌用CaCl2處理，以增大細菌細胞壁的通透性。

2）使含有目的基因的重組質(zhì)粒進入受體細胞。

3）目的基因在受體細胞內(nèi)，隨其繁殖而復(fù)制，由于細菌繁殖的速度非?？?，在很短的時間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。1081）將細菌用CaCl2處理，以增大細菌細胞壁的通透性1、將目的基因?qū)胫参锛毎?）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點:能感染雙子葉植物和祼子植物,對單子葉植物無感染能力Ti質(zhì)粒的T—DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞并整合到其染色體上轉(zhuǎn)化過程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達載體導(dǎo)入植物細胞插入植物細胞染色DNA表達新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌1091、將目的基因?qū)胫参锛毎?）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點:能感染雙子（2）基因槍法

基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。110（2）基因槍法基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用（3）花粉通道法

植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。111（3）花粉通道法植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉2、將目的基因?qū)雱游锛毎椒?顯微注射技術(shù)操作程序:提純含目的基因表達載體取受精卵顯微注射移植到子宮受精卵發(fā)育新性狀動物1122、將目的基因?qū)雱游锛毎椒?顯微注射技術(shù)操作程序:提純含3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎Ｓ梅ǎ篊a2+處理常用菌：大腸桿菌微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA1133、將目的基因?qū)胛⑸锛毎Ｓ梅ǎ篊a2+處理常用菌：大腸步驟四：目的基因的檢測和表達四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素抗性基因114步驟四：目的基因的檢測和表達四環(huán)素氨芐青霉51(四)目的基因的檢測與鑒定檢測①